黃 燦，楊侃侃，江 兵，李啟信

（安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院胃腸外科，安徽 合肥 238000）

胃癌（gastric cancer，GC）是全球第5 大常見惡性腫瘤，也是惡性腫瘤死亡的第3 大原因[1]。胃癌的發(fā)病機制十分復雜，具體機制仍不清楚。全身化療、手術、免疫治療和靶向治療均已證實對胃癌有效[2]。盡管近年來較早期胃癌通過外科手術取得了一定的效果，早期手術后5 年生存率可達到60%～80%，但進展期胃癌預后較差[3]。相關基因及分子在胃癌中的異常表達在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[4]。因此，篩選胃癌診斷和治療的新靶向分子有利于對胃癌的早期診斷和精準治療。GLI1 是Hedgehog 信號轉導途徑末端的轉錄因子，Hedgehog 途徑在癌癥中異常激活有兩種方式：①配體依賴模式：腫瘤通過自分泌信號過度激活Shh-GLI 途徑產(chǎn)生高水平Shh配體；②配體非依賴模式：突變的PTCH 導致SMO結構性激活，導致GLI1 信號失控促進細胞的轉化和腫瘤的發(fā)生[5]。既往有很多研究發(fā)現(xiàn)GLI1 與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有著重要關系，包括結腸癌[6]、膠質瘤[7]、食道癌、膀胱癌[8]、骨肉瘤[9]、乳腺癌[10]等。但目前

GLI1 在胃癌中的研究尚不明確。本研究運用多種癌癥基因數(shù)據(jù)庫分析GLI1 在胃癌中的表達情況，同時探討GLI1 基因表達對胃癌患者預后及免疫影響，旨在為深入研究GLI1 的靶向治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源 檢索TIMER 數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）檢索GLI1 在泛癌中的表達情況，檢索條件為：①Exploration：Gene Diff Exp；②Gene Expression:select GLI1。利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）先檢索GLI1在泛癌中的表達隨后在STAD 中臨床相關性表達的相關信息，檢索條件為：①Gene symbol：GLI1；②pan-cancer view；③Gene Expression；④Select Cancer:Stomach adenocarcinoma；⑤GLI1 expression based on：Sample types，individual cancer stages，Tumor Grade，Nodal Metastasis status。進一步利用Kaplan -Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（https://kmplot.com/analysis/）分析GLI1 在STAD 中的預后，設置檢索條件為：①Gene symbol：GLI1；②Cancer：gastric cancer；③Survival：OS，F(xiàn)P，PPS。進一步檢索TIMER 數(shù)據(jù)庫基因分析GLI1 的表達與免疫浸潤的相關性。篩選條件如下：①Getting started by Gene：Gene Symbol：GLI1；②CancerTypes：STAD；③Immune infiltrates:selectimmunecells；④Correlationcancer types ：STAD；⑤Gene Symbol Y：GLI1；Gene Symbol X：select immune cells marker。

1.2 統(tǒng)計學處理 UALCAN 數(shù)據(jù)庫中正常組織和腫瘤組織的GLI1 基因表達差異進行薈萃分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，生存曲線采用Kaplan-Meier 方法，兩組間生存率比較運用Log-Rank 檢驗通過對數(shù)秩檢驗分析，結果為風險比（HR），P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義，TIMER 數(shù)據(jù)庫中相關性采用Spearman 相關系數(shù)評價。

2 結果

2.1 GLI1 在多種腫瘤組織中的表達水平 UALCANS數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)GLI1 在膽管癌、食管癌、頭頸鱗狀細胞癌、腎透明細胞癌、肝細胞癌、肺鱗癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌的表達均高于正常組織，見圖1A。TIMER 數(shù)據(jù)庫分析GLI1 在特定腫瘤組織中的差異表達，結果顯示膽管癌、食管癌、頭頸鱗狀細胞癌、腎透明細胞癌、胃癌的表達均高于正常組織見圖1B。

圖1 GLI1 在不同惡性腫瘤中的表達情況

2.2 GLI1 在胃癌中的表達情況 UALCAN 數(shù)據(jù)庫顯示，GLI1 胃癌中的表達水平高于正常對照組，且差異有統(tǒng)計學意義（P=4.208600024036e-09）；GLI1 在腫瘤分期中Stage（1、2、3、4）表達均高于正常組，同時Stage（2、3、4）表達高于Stage1，且差異有統(tǒng)計學意義。腫瘤分級中Grade（2、3）表達高于正常組，Grade3 表達高于Grade（1，2）。在腫瘤淋巴結轉移中，N0、N1、N2、N3的表達高于正常組，且差異有統(tǒng)計學意義。

圖2 GLI1 的差異表達胃癌樣本類型（n=449）

2.3 GLI1 的高表達與胃癌患者的預后不良的關系Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫分析GLI1 在胃癌中表達預后價值的結果顯示，GLI1 的高表達與胃癌的預后不良有關。高表達的GLI1 與胃癌的不良預后呈正相關。OS：（HR=2.56，95%CI：2.05～3.19，P＜1e-16）見 圖3A；FP:（HR=2.29,95%CI：1.82～2.87，P=3.1e-13）見圖3B；PPS：（HR=3.02，95%CI：2.37～3.86，P＜1e-16）見圖3C。

圖3 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫中GLI1 水平與HCC 預后的關系

2.4 GLI1 表達水平與胃癌免疫浸潤豐度相關性分析對TIMER 數(shù)據(jù)庫的分析發(fā)現(xiàn)，GLI1 的表達水平與腫瘤豐度呈負相關，與B 細胞（Rho=0.112，P=3.09e-02）、CD4+T 細胞（Rho=0.523，P=4.80e-27）、CD8+T 細胞（Rho=0.235，P=5.10e-06）、巨噬細胞（Rho=0.434，P=1.74e-18）、樹突狀細胞（Rho=0.571，P=2.29e-33）、中性粒細胞（Rho=0.203，P=8.49e-05）均呈正相關，見圖4。

圖4 GLI1 表達與胃癌組織免疫細胞浸潤水平的關系

2.5 GLI1 表達與腫瘤免疫細胞標志物水平相關性分析 GLI1 表達與腫瘤免疫細胞標志物水平相關性分析胃癌中GLI1 的表達與多種免疫細胞標志物正相關且具有明顯的相關性（P＜0.01），與CD8+T 細胞、T細胞、B 細胞、單核細胞、腫瘤相關巨噬細胞、M1 巨噬細胞、M2 巨噬細胞、中性粒細胞、Th1 細胞、Th2細胞的免疫細胞標志物均呈正相關，見表1。

表1 GLI1 在胃癌中與免疫細胞相關標記物的關系

3 討論

GLI1 是編碼鋅指蛋白家族成員之一，最初被鑒定為惡性膠質瘤的擴增基因產(chǎn)物而得名[11]。GLI1 是Hedgehog 信號通路（HH）末端的轉錄效應因子，在胚胎發(fā)育和組織模式/分化過程中受到嚴格調控。在正常生物體中影響生物的生長發(fā)育尤其是在細胞組織修復過程中[12]。某些惡性腫瘤中GLI1 的異常激活和高表達與促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的許多特征有關。這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展部分是由GLI1 在調節(jié)細胞周期、DNA 復制和DNA 損傷修復過程中的作用驅動的[13]。同時GLI1 的異常表達在某些非惡性腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展中同樣起到重要作用，如在骨髓纖維化[14]、肺動脈高壓[15]等，并且這些表達往往伴隨HH 信號通路的激活。

研究發(fā)現(xiàn)GLI1 在多種實體腫瘤中過度表達且與預后不良相關，包括胃癌。如Yao Y 等[16]通過蛋白質印記和免疫組化研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織GLI1 的表達高于正常組織，還進一步評估GLI1 的表達與臨床病理因素發(fā)現(xiàn)GLI1 表達與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移、靜脈浸潤和TNM 分期相關，隨后細胞水平實驗再次證實了GLI1 的高表達促進了腫瘤組織的增值和遷徙，同時利用動物實驗驗證GLL1 的靶向抑制劑提高了對CIS 的敏感性。Qi W 等[17]研究發(fā)現(xiàn)GLI1 的表達與胃癌的分期分級及遠處轉移具有相關性，但與腫瘤大小及淋巴結轉移有關。且運用癌癥干性相關的蛋白的共定位表明GLI1 可能是胃癌的干性相關蛋白。

本研究為了證實GLI1 在胃癌中的表達差異和免疫浸潤的相關性，利用TIMER 數(shù)據(jù)庫和UALCAN 數(shù)據(jù)庫對GLI1 在多種癌癥中的表達進行分析，發(fā)現(xiàn)GLI1 在多種癌癥中呈現(xiàn)出高表達狀態(tài)，且在TIMER 和UALCAN 兩個數(shù)據(jù)庫中胃癌中的GLI1 均表達高于正常組織。隨后進一步運用UALCAN 數(shù)據(jù)庫進一步分析了GLI1 在胃癌和正常組織的差異表達，具有明顯相關性，GLI1 在胃癌中高表達于正常組織，且在腫瘤分期中Stage2、3、4 期的胃癌組織表達高于正常組織和Stage1 期胃癌組織。在腫瘤分級中部分高分期的腫瘤組織中GLI1的表達高于低分期腫瘤組織的GLI1 的表達，而在淋巴結分期中腫瘤組織GLI1 表達均高于正常組織，但胃癌淋巴結分期中組間的表達無明顯的相關性。利用Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)GLI1 的高表達會影響患者的生存率并導致預后不良，降低患者OS，F(xiàn)P 及PPS。由此可以猜測GLI1在胃癌中起到促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。

腫瘤微環(huán)境主要有腫瘤細胞中的不同免疫細胞組成，腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[18]，且其中的復雜機制可能為腫瘤的免疫治療提供策略[19]。TIMER 數(shù)據(jù)庫是全面研究腫瘤免疫相關研究的綜合性數(shù)據(jù)庫[20]。因此本研究運用TIMER數(shù)據(jù)庫進一步分析了GLI1 的表達與胃癌組織中的免疫細胞的相關性。研究表明，GLI1 的表達與腫瘤豐度呈負相關，與B 細胞的浸潤無相關性，但與CD4+T 細胞、CD8+細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞浸潤呈正相關。此外，本研究運用TIMER 數(shù)據(jù)庫對GLI1 的表達與腫瘤細胞免疫標志物水平進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)GLI1 的表達與多種腫瘤免疫細胞標志物具有明顯的相關性，由此驗證了GLI1 通過影響免疫細胞來影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。以上結果表明，GLI1 在胃癌中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且預示胃癌患者的預后不良，并且在胃癌組織中與免疫浸潤有關，免疫浸潤與單抗。說明GLI1 在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中可能起到促癌的作用，為GLI1 作為胃癌預防和診斷的重要腫瘤學標志物，并且作為胃癌的一個潛在的治療靶點提供理論依據(jù)。此外，本研究結果僅從生物信息學角度進行研究分析，且研究結果尚未進行免疫組化、細胞功能試驗、動物實驗等相關實驗進一步驗證。需要進一步的實驗和臨床數(shù)據(jù)研究。

綜上所述，通過多種數(shù)據(jù)庫進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，GLI1 在胃癌組織中呈高表達，且表達水平與患者生存預后有關。GLI1 在胃癌的發(fā)生發(fā)展機制表明GLI1 可能成為以后胃癌的分子診斷和預后標志及免疫治療靶點。