李 邦 劉春娟 郭俊杰 武宇昕 鄧志成 張 敏 崔 彤 劉 暢 周宇飛

低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)高粱幼苗根系伸長的調(diào)控作用

李 邦**劉春娟**郭俊杰 武宇昕 鄧志成 張 敏 崔 彤 劉 暢 周宇飛*

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 遼寧沈陽 110866

低氮脅迫促進(jìn)高粱根系伸長, 但其具體的生理機(jī)制仍不清晰。為解析高粱根系在低氮脅迫下伸長的生理機(jī)制, 本試驗(yàn)選用高粱耐低氮自交系(398B)和氮敏感自交系(CS-3541)為材料, 研究低氮脅迫下高粱根系伸長的物質(zhì)和能量代謝基礎(chǔ)。結(jié)果表明, 與正常氮相比, 低氮脅迫顯著促進(jìn)了398B和CS-3541根長及根尖細(xì)胞長度, 398B表現(xiàn)出更長的根長; 低氮脅迫后1、5和10 d, 398B和CS-3541根系中內(nèi)源色氨酸含量顯著增加; 應(yīng)用RNA-seq技術(shù)對(duì)2個(gè)高粱自交系低氮脅迫后根系樣品進(jìn)行差異表達(dá)基因鑒定, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)色氨酸代謝途徑的有關(guān)基因參與了低氮下高粱根系的伸長。進(jìn)一步利用外源色氨酸處理發(fā)現(xiàn), 外源色氨酸通過增加生長素含量, 激活了質(zhì)膜H+-ATPase的活性, 促進(jìn)質(zhì)膜酸化, 提高了能量代謝相關(guān)酶活性及ATP含量, 從而誘導(dǎo)了根系的能量代謝, 促進(jìn)了低氮脅迫下高粱根系的伸長。而且, 外源色氨酸對(duì)低氮脅迫下398B的作用效果更好。綜上所述, 低氮脅迫處理激活了內(nèi)源色氨酸在高粱根系伸長中的關(guān)鍵作用, 依賴色氨酸途徑合成的生長素及協(xié)同提高的能量代謝是促進(jìn)低氮下高粱根系伸長的生理機(jī)制。

高粱; 低氮; 外源色氨酸; 生長素; 能量代謝; 根伸長

高粱((L.) Moench)是我國北方地區(qū)重要的糧食作物, 屬于短日照C4植物, 生長能力較強(qiáng), 往往被作為先鋒作物種植在瘠薄的土壤中[1]。隨著我國農(nóng)業(yè)供給側(cè)改革的深化, 高粱以其優(yōu)異的耐貧瘠性成為種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中重要的替代作物[2]。而貧瘠土地常常會(huì)導(dǎo)致土壤氮素供應(yīng)不足, 影響高粱對(duì)氮素的吸收利用[3]。因此, 篩選耐低氮脅迫能力較強(qiáng)的高粱種質(zhì)并研究其耐低氮生理機(jī)制, 對(duì)于有效利用貧瘠土地, 實(shí)現(xiàn)高粱高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[4-5]。根系具有可塑性, 在不同的生長環(huán)境下根系形態(tài)會(huì)發(fā)生變化, 低氮脅迫會(huì)顯著促進(jìn)根系伸長[6-7]。當(dāng)?shù)毓?yīng)受限制時(shí), 作物會(huì)將資源優(yōu)先分配給根系, 保障根系的構(gòu)建和功能, 而發(fā)達(dá)的根系是實(shí)現(xiàn)作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的必要保障[8-9]。研究表明玉米長而深的根系是其氮素有效吸收的必要條件[10]。同時(shí), 玉米根長的增加顯著提高了其耐低氮脅迫能力[11]。低氮環(huán)境下, 植株根系伸長生長, 利于植株尋找更多氮源[12-13]。因此, 在低氮條件下, 培養(yǎng)植物深根系統(tǒng)的能力對(duì)增強(qiáng)植物的耐低氮能力至關(guān)重要。

色氨酸作為重要的氨基酸之一, 在增強(qiáng)植物抗逆能力方面表現(xiàn)突出[14]。色氨酸可以通過提高根系對(duì)營養(yǎng)和水分的吸收, 從而增強(qiáng)植物的抗脅迫能力[15-16]。色氨酸作為生長素的合成前體, 依賴色氨酸途徑是生長素合成的主要途徑[17-18]。色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶1 (TAA1)及其同源物TAR1和TAR2通過色氨酸依賴途徑將L-色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚-3-丙酮酸(indole-3-pyruvic acid, IPyA)[19], 黃素單加氧酶YUCCA (YUC)酶催化IPyA合成IAA[20-21]。在生長素介導(dǎo)的根系發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用, 擬南芥突變體中在低氮條件下調(diào)節(jié)根系結(jié)構(gòu), 抑制了生長素在根系中的積累[22]。水稻中的過表達(dá)引起根尖生長素含量升高, 增加了根系的數(shù)量, 但抑制了根的伸長[23]。Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn),是一個(gè)關(guān)鍵的硝酸鹽信號(hào)調(diào)節(jié)因子, 它直接與啟動(dòng)子結(jié)合并激活其表達(dá), 維持根原基的生長素信號(hào), 色氨酸通過合成生長素促進(jìn)了硝酸鹽介導(dǎo)的根系發(fā)育。外源色氨酸可以刺激藜麥根部生長素的合成, 從而改善植株的生長, 提高藜麥的抗逆性[25]。另外, 生長素能夠激活根系中質(zhì)膜 H+-ATPase活性, 質(zhì)膜H+-ATPase負(fù)責(zé)外質(zhì)體酸化(以生長素誘導(dǎo)的方式)并激活細(xì)胞壁擴(kuò)張相關(guān)酶的活性, 誘導(dǎo)的H+流出并且參與到細(xì)胞壁松動(dòng)中, 進(jìn)而通過酸化作用促進(jìn)根系伸長[26]。綜合分析表明, 色氨酸作為生長素前體誘導(dǎo)根系伸長的路徑較為明確, 然而, 色氨酸對(duì)于植物生長的影響并不僅限于生長素的作用[27]。并且, 色氨酸在高粱抗逆研究中也鮮見此類報(bào)道, 因此進(jìn)一步揭示低氮脅迫下色氨酸對(duì)高粱根系形態(tài)調(diào)控的生理機(jī)制具有重要意義。

植物生長伴隨著能量代謝, 通過糖酵解、磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán), 釋放的能量保存在ATP中, 為生命活動(dòng)提供能量來源[28]。然而上述能量轉(zhuǎn)化過程易受環(huán)境的影響, 例如為提高干旱適應(yīng)性, 杜仲葉片通過增強(qiáng)糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑增加ATP、NADPH等能量物質(zhì), 維持在干旱環(huán)境中的生長[29]。研究表明, 施氮可以上調(diào)大部分糖酵解相關(guān)蛋白的含量, 增加糖酵解過程[30]。另外, 增施氮提高了低溫條件下番茄葉片碳水化合物和能量代謝相關(guān)蛋白含量, 增加了能量代謝過程中的丙酮酸激酶活性[31]。江立庚等[32]研究表明, 在低氮脅迫下, 氮吸收效率高的水稻品種根系中具有較高的ATP含量。而低氮環(huán)境下, 植物是否也可能通過調(diào)節(jié)植株能量和物質(zhì)代謝來響應(yīng)低氮脅迫仍需深入研究[33]。色氨酸不僅是生長素的合成前體, 也是蛋白質(zhì)合成的前體, 因此, 是影響植物生長發(fā)育中的重要物質(zhì)[27]。黎旺姐[34]研究發(fā)現(xiàn), 包括色氨酸在內(nèi)的多種氨基酸參與蛋白質(zhì)合成, 為植物體內(nèi)的物質(zhì)代謝和能量代謝提供底物。然而, 在特定條件下(如低氮脅迫)色氨酸參與植物生長和能量代謝中的作用仍不十分清楚。

本研究以高粱耐低氮自交系和氮敏感自交系為材料, 通過分析低氮脅迫下不同耐低氮自交系根系生長的響應(yīng)差異和外源色氨酸對(duì)根系伸長調(diào)控的生理機(jī)制, 系統(tǒng)研究色氨酸誘導(dǎo)的根系生長素及協(xié)同的能量代謝變化, 探明高粱在低氮脅迫下的適應(yīng)性, 為充分發(fā)揮高粱作為先鋒作物的作用, 培育耐低氮高粱種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)高粱生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行, 選用高粱耐低氮自交系398B和高粱氮敏感自交系CS-3541為試驗(yàn)材料。選取大小相近的高粱自交系種子進(jìn)行萌發(fā)。用10%次氯酸鈉溶液消毒種子5～10 min, 用蒸餾水沖洗。隨后, 放置在培養(yǎng)皿中潮濕的濾紙上, 然后放在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)箱設(shè)置溫度為28℃/25℃日/夜, 光周期12 h, 光強(qiáng)為280 μmol m–2s–1。3 d后選取發(fā)育良好的幼苗20株, 插入黑色培養(yǎng)盒中, 蒸餾水培養(yǎng)3 d后, 將營養(yǎng)液改為1/2 Hoagland溶液培養(yǎng)3 d后, 以0.05 mol L–1氮源的1/2 Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行低氮處理(low nitrogen, LN), 以1/2 Hoagland營養(yǎng)液為對(duì)照(normal nitrogen, NN)。

外源色氨酸(Trp)處理: 本試驗(yàn)選擇葉面噴施色氨酸, 色氨酸濃度為50 mg L–1, 在低氮脅迫處理同時(shí)進(jìn)行外源色氨酸的噴施(LN-T), 對(duì)照培養(yǎng)也噴施同樣濃度色氨酸(NN-T)。外源色氨酸連續(xù)噴施3 d, 每天上午09:00噴施一次, 噴施狀態(tài)均以葉片表面形成水滴而不掉落為準(zhǔn), 并加入0.1%的吐溫(Tween)作為粘合劑, 在外源噴施色氨酸后1、5和10 d, 取每個(gè)處理長勢一致的高粱幼苗進(jìn)行根系掃描及相關(guān)生理指標(biāo)的測定。

1.2 測定內(nèi)容與方法

1.2.1 根長、根系形態(tài)及根尖細(xì)胞長度測定 每個(gè)處理中選取長勢一致的10株高粱幼苗, 使用直尺測定每株高粱幼苗的根長(植株基部到根系形態(tài)學(xué)最下端的絕對(duì)距離)。在樹脂玻璃槽內(nèi)注水5～10 mm深, 將根系樣品放置在樹脂玻璃槽內(nèi), 使根系完全被水淹沒過并充分展開, 用根系掃描儀(The LA2400 Scanner 2014)進(jìn)行根系掃描, 之后使用WinRHIZO Pro 2013e軟件(Regent Instruments Inc., 加拿大)進(jìn)行分析, 獲得總根長、根尖數(shù)和根系平均直徑。在低氮處理后10 d, 切取高粱幼苗根尖15～20 mm, 用固定液固定。將固定好的根尖脫水、透明、包埋、切片、番紅染色2 h、用不同梯度酒精脫色、固綠染色、二甲苯透明、中性樹膠封片。使用掃描儀(Pannoramic DESK, P-MIDI, P250, 匈牙利)對(duì)切片進(jìn)行掃描, 利用掃描軟件(Pannoramic Scanner)對(duì)切片進(jìn)行觀察的處理。

1.2.2 全氮含量測定 將烘干后的樣品用粉碎機(jī)粉碎, 取0.3 g樣品放入到消煮管內(nèi), 加入10 mL濃硫酸進(jìn)行消煮, 直至消煮液澄清, 用蒸餾水定容至100 mL待用。使用SmarChem 200 全自動(dòng)化學(xué)分析儀測定全氮含量。

1.2.3 色氨酸含量測定 稱取根系樣品0.2 g置于水解管內(nèi), 加入1 g Ba(OH)2·8H2O及2 mL 5 g L–1淀粉溶液, 搖勻后放入沸水浴中加熱溶解5 min, 取出抽真空封管, 置110℃烘箱內(nèi)水解24 h。取出水解管待冷卻至室溫后打開管口, 在冰水浴中將試管內(nèi)容物全部轉(zhuǎn)入預(yù)先加有2 mL 4 mol L–1HCl的5 mL容量瓶中, 調(diào)整溶液pH 6.0, 待至室溫后用超純水定容至10 mL, 經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后即為樣品測定液, 取標(biāo)準(zhǔn)工作液及樣品測定液各20 μL, 利用高效液相色譜儀(安捷倫HPLC1100)進(jìn)行測定。

1.2.4 根系A(chǔ)TP含量測定 取0.5 g幼苗根系, 加入5%三氯乙酸, 在冰浴條件下研磨, 用NaOH中和pH至7.5, 倒入刻度試管定容至5 mL, 在4℃ 13,000′條件下離心15 min, 上清液即為ATP提取液, 將上清液倒入試管, 置于冰水浴中備用。取0.2 mL ATP提取液和0.8 mL熒光素酶溶液于比色皿中, 放入FQ-300發(fā)光光度計(jì), 記錄發(fā)光峰值。

1.2.5 質(zhì)外體pH值測定 將新鮮根系用去離子水洗凈, 并用濾紙吸干水分。稱取1.5 g根系放入50 mL注射器, 再加入280 mol L–1山梨醇溶液30 mL。堵住注射器出口, 用力抽氣1 min, 使山梨醇溶液滲入根系質(zhì)外體中, 緊接著用力壓氣1 min, 本過程重復(fù)10次, 直至根系表面積有大量小氣泡為止, 取出根系, 吸干表面水分, 在4℃ 2000′離心10 min, 得到質(zhì)外體提取液。質(zhì)外體pH值用微電極(Mettler Toleab, Inlab 423, Electroly, 9811)直接在微型離心管內(nèi)測定。

1.2.6 生長素含量及能量代謝相關(guān)酶活性測定 稱取1 g根系樣本, 加入9 mL PBS (pH 7.2～7.4, 濃度為0.01 mol L–1), 冰浴研磨至勻漿, 在4℃ 4000′離心10 min, 取上清液待測。生長素含量, 質(zhì)膜H+-ATPase活性, 丙酮酸激酶活性, 檸檬酸合酶活性, α-酮戊二酸脫氫酶活性和6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性采用索寶來試劑盒進(jìn)行測定。以空白孔調(diào)零, 450 nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。

1.2.7 差異基因表達(dá)量測定 取高粱幼苗根尖, 進(jìn)行差異基因表達(dá)量的測定。使用TRIzol法進(jìn)行總RNA的提取, 每組樣本進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。用Prime-ScriptTMRT試劑盒去除基因組并反轉(zhuǎn)錄生成模板cDNA, 進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。RT-qPCR在Light-Cycler 96儀器(Roche Applied Science, 德國)中進(jìn)行, 反應(yīng)體系(10 μL)為: cDNA (10×) 1 μL, SYBR Green 4 μL, qRT-Primer F 1 μL, qRT-Primer R 1 μL, ddH2O 3 μL。RT-qPCR反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性10 min; 95℃ 10 s, 55℃ 10 s, 72℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。在PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí), 生成溶解曲線, 以評(píng)估PCR引物特異性。根據(jù)擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)(CT值), 采用2–ΔΔCT方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。用于qRT-PCR的基因ID和引物信息如表1所示。

1.2.8 轉(zhuǎn)錄組測定 采用TRIzol試劑(Invitrogen)提取根系總RNA, 挑選合格RNA樣品進(jìn)行高通量測序, 由武漢邁特維爾生物科技有限公司完成轉(zhuǎn)錄組測序。利用帶有Oligo(dT)對(duì)樣品總RNA進(jìn)行mRNA分離, 然后將mRNA隨機(jī)斷裂。以片段化的mRNA為模板, 在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成雙鏈cDNA, 經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A形成接頭。通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫富集, 進(jìn)行文庫制備工作, 將構(gòu)建好的文庫上機(jī)進(jìn)行測序。利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)數(shù)據(jù)庫對(duì)DEGs進(jìn)行差異表達(dá)基因的KEGG Pathway富集分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,采用SPSS18.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 并用Graph Pad Prism 8.0作圖。

表1 試驗(yàn)所用基因引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 低氮脅迫對(duì)高粱幼苗表型及根長的影響

由圖1可知, 在低氮處理后10 d, 高粱自交系的根系長度會(huì)顯著增加, 398B根長增加了26.67%, CS-3541根長增加了15.47%, 398B根長顯著大于CS-3541。

2.2 低氮脅迫對(duì)高粱幼苗根尖細(xì)胞長度的影響

由圖2可知, 與正常氮條件相比, 低氮處理后10 d, 2份高粱自交系在低氮條件下根尖的細(xì)胞顯著伸長, 398B根尖細(xì)胞長度顯著增加了64.68%, CS-3541根尖細(xì)胞長度顯著增加了41.18%, 在低氮條件下, 398B根尖細(xì)胞長度顯著大于CS-3541。

2.3 低氮脅迫對(duì)高粱幼苗根系色氨酸含量的影響

由圖3可知, 低氮脅迫下2份自交系根系中色氨酸含量呈現(xiàn)上升的趨勢。低氮處理1、5和10 d, 398B根系中色氨酸含量分別顯著增加13.52%、45.37%和20.91%, CS-3541根系中色氨酸含量分別顯著增加33.52%、28.09%和67.22%。低氮條件下, 398B根系中色氨酸含量均大于CS-3541, 不同時(shí)間點(diǎn)兩自交系間差異均達(dá)到顯著水平。

圖1 低氮脅迫下高粱幼苗根系的表型(A)及根長(B)

不同小寫字母表示0.05概率水平差異顯著。NN: 正常氮處理; LN: 低氮處理。

Columns with different lowercase letters are significantly different at the 0.05 probability level. NN: normal nitrogen treatment; LN: low nitrogen treatment.

圖2 低氮脅迫下高粱幼苗的根尖細(xì)胞形態(tài)(A)和長度(B)

不同小寫字母表示在0.05概率水平差異顯著。NN: 正常氮處理; LN: 低氮處理。

Columns with different lowercase letters are significantly different at the 0.05 probability level. NN: normal nitrogen treatment; LN: low nitrogen treatment.

圖3 低氮脅迫對(duì)幼苗根系色氨酸含量的影響

I為低氮處理后1 d; II為低氮處理后5 d; III為低氮處理后10 d。不同小寫字母表示在0.05概率水平差異顯著。NN: 正常氮處理; LN: 低氮處理。

I: 1 day after low nitrogen treatment; II: 5 days after low nitrogen treatment; III: 10 days after low nitrogen treatment. Columns with different lowercase letters are significantly different at the 0.05 probability level. NN: normal nitrogen treatment; LN: low nitrogen treatment.

2.4 低氮脅迫下高粱幼苗根系依賴色氨酸合成生長素的代謝途徑

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析可以看出(圖4), 低氮脅迫下高粱幼苗根系的差異基因主要集中在IPA途徑及生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, IPA是色氨酸合成生長素的重要途徑,其中主要的差異基因是調(diào)控生長素合成的和基因。

2.5 低氮脅迫對(duì)高粱幼苗根系生長素合成途徑相關(guān)基因表達(dá)量的影響

通過qRT-PCR測定分析得出, 在低氮脅迫下、和表達(dá)存在顯著差異。由圖5可知, 低氮脅迫1、5和10 d后, 398B根系中表達(dá)量顯著上升29.33%、124.74%和119.77%, CS-3541根系中表達(dá)量顯著上升53.23%、141.80%和440.52%。低氮脅迫1 d后, 398B根系中表達(dá)量顯著下降9.33%; 低氮脅迫5 d和10 d后, 398B根系中表達(dá)量顯著上升331.06%和95.10%; 低氮脅迫1、5和10 d后, CS-3541根系中表達(dá)量顯著上升33.61%、178.69%和85.57%。低氮脅迫1 d后, 398B根系中表達(dá)量顯著下降14.00%; 低氮脅迫5 d和10 d后, 398B根系中表達(dá)量顯著上升223.17%和240.56%; 低氮脅迫1、5和10 d后, CS-3541根系中表達(dá)量顯著上升11.32%、273.33%和297.67%。

2.6 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)高粱幼苗根系表型的影響

由圖6可知, 外源色氨酸影響了高粱幼苗根系的伸長。根系掃描圖片可以看出, 隨著處理時(shí)間的增加, 根系伸長的越明顯。外源色氨酸處理后10 d, 根系形態(tài)差異最明顯, 主要表現(xiàn)在根量增多, 根長增長; 外源色氨酸處理后10 d, 與低氮條件下未噴施色氨酸相比較, 398B和CS-3541根系長度顯著增加8.63%和21.35%。

2.7 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)高粱幼苗根系質(zhì)膜酸化的影響

2.7.1 幼苗根系生長素含量 由圖7可知, 低氮脅迫1、5和10 d后, 398B根系生長素含量顯著增加9.52%、21.49%和12.27%; CS-3541根系生長素含量顯著增加2.45%、22.42%和13.70%。外源色氨酸處理后5 d和10 d, 與低氮條件下未噴施色氨酸相比較, 398B根系生長素含量顯著增加3.26%和36.18%; 外源色氨酸處理后5 d, CS-3541根系生長素含量差異未達(dá)顯著水平; 外源色氨酸處理后10 d, CS-3541根系生長素含量顯著增加了35.32%, 自交系、低氮脅迫和外源色氨酸處理之間的交互作用存在顯著性差異(<0.05)。

2.7.2 幼苗根系質(zhì)膜H+-ATPase活性 由圖8可知, 低氮脅迫1、5和10 d后, 398B根系質(zhì)膜H+-ATPase活性顯著增加10.86%、5.03%和4.07%; CS-3541根系質(zhì)膜H+-ATPase活性顯著增加5.78%、3.65%和3.65%。外源色氨酸處理后5 d和10 d, 與低氮條件下未噴施色氨酸相比較, 398B根系質(zhì)膜H+-ATPase活性顯著增加12.31%和24.40%; CS-3541根系質(zhì)膜H+-ATPase活性顯著增加16.53%和22.58%;自交系、低氮脅迫和外源色氨酸處理之間的交互作用存在顯著性差異(<0.05)。

2.7.3 幼苗根系pH 由圖9可知, 低氮脅迫1、5和10 d后, 398B根系質(zhì)外體pH值顯著下降8.62%、15.05%和17.25%, CS-3541根系質(zhì)外體pH值顯著下降8.04%、9.17%和12.02%。外源色氨酸處理后5 d和10 d, 與低氮條件下未噴施色氨酸相比較, 398B根系質(zhì)外體pH值顯著下降21.68%和21.58%, CS- 3541根系質(zhì)外體pH值顯著下降20.05%和16.85%; 自交系、低氮脅迫和外源色氨酸處理之間的交互作用存在顯著性差異(<0.05)。

圖4 色氨酸代謝通路圖

圖5 低氮脅迫對(duì)高粱幼苗根系生長素合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響

不同小寫字母表示在0.05概率水平差異顯著。NN: 正常氮處理; LN: 低氮處理。

Columns with different lowercase letters are significantly different at the 0.05 probability level. NN: normal nitrogen treatment; LN: low nitrogen treatment.

圖6 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)高粱幼苗根系生長的影響

NN: 正常氮處理; LN: 低氮處理。NN: normal nitrogen treatment; LN: low nitrogen treatment.

圖7 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)幼苗根系生長素含量的影響

I為低氮處理后1 d; II為低氮處理后5 d; III為低氮處理后10 d。C、S和B分別表示不同自交系、不同氮水平處理和外源色氨酸處理。*、**和***分別表示在0.05、0.01和0.001概率水平差異顯著, ns表示差異不顯著。不同小寫字母表示0.05概率水平差異顯著。NN: 正常氮處理; LN: 低氮處理; NN-T: 正常氮噴施色氨酸處理; LN-T: 低氮噴施色氨酸處理。

I: 1 day after low nitrogen treatment; II: 5 days after low nitrogen treatment; III: 10 days after low nitrogen treatment. C, S, and B represent hybrid lines, different nitrogen treatments and exogenous tryptophan treatments, respectively. *, **, and *** are significantly different at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively, and ns is not significantly different. Columns with different lowercase letters are significantly different at the 0.05 probability level. NN: normal nitrogen treatment; LN: low nitrogen treatment; NN-T: normal nitrogen was sprayed with tryptophan; LN-T: low nitrogen was sprayed with tryptophan.

2.8 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)高粱幼苗根系能量代謝的影響

2.8.1 幼苗根系A(chǔ)TP含量 由圖10可知, 低氮脅迫1、5和10 d后, 398B根系A(chǔ)TP含量顯著增加9.52%、20.87%和17.73%, CS3541根系A(chǔ)TP含量顯著增加13.62%、12.17%和18.05%。外源色氨酸處理后5 d和10 d, 與低氮條件下未噴施色氨酸相比較, 398B根系A(chǔ)TP含量顯著增加21.18%和11.81%, CS- 3541根系A(chǔ)TP含量顯著增加17.06%和19.39%; 自交系、低氮脅迫和外源色氨酸處理之間的交互作用存在顯著性差異(<0.05)。

2.8.2 幼苗根系6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性 由圖11可知, 低氮脅迫1 d后, 398B和CS-3541根系6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性差異不顯著; 低氮脅迫5 d和10 d后, 398B根系6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性顯著增加5.36%和3.18%, CS-3541根系6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性顯著增加7.61%和6.73%。外源色氨酸處理后5 d和10 d, 與低氮條件下未噴施色氨酸相比較, 398B根系6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性顯著增加17.53%和29.45%, CS-3541根系6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性顯著增加14.33%和21.72%; 自交系、低氮脅迫和外源色氨酸處理之間的交互作用存在顯著性差異(<0.05)。

2.8.3 幼苗根系丙酮酸激酶活性 由圖12可知, 低氮脅迫1、5和10 d后, 398B根系丙酮酸激酶的活性顯著增加3.34%、3.89%和3.12%; 低氮脅迫1 d和5 d后, CS-3541根系丙酮酸激酶的活性顯著增加2.77%和3.11%, 低氮脅迫10 d后, CS-3541根系丙酮酸激酶的活性未達(dá)到顯著水平。外源色氨酸處理后5 d和10 d, 與低氮條件下未噴施色氨酸相比較, 398B根系丙酮酸激酶的活性顯著增加23.21%和17.00%, CS-3541根系丙酮酸激酶的活性顯著增加21.26%和14.43%; 自交系、低氮脅迫和外源色氨酸處理之間的交互作用存在顯著性差異(<0.05)。

圖8 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)幼苗根系中質(zhì)膜H+-ATPase活性的影響

I為低氮處理后1 d; II為低氮處理后5 d; III為低氮處理后10 d。C、S和B分別表示不同自交系、不同氮水平處理和外源色氨酸處理。*、**和***分別表示在0.05、0.01和0.001概率水平差異顯著, ns表示差異不顯著。不同小寫字母表示0.05概率水平差異顯著。NN: 正常氮處理; LN: 低氮處理; NN-T: 正常氮噴施色氨酸處理; LN-T: 低氮噴施色氨酸處理。

I: 1 day after low nitrogen treatment; II: 5 days after low nitrogen treatment; III: 10 days after low nitrogen treatment. C, S, and B represent hybrid lines, different nitrogen treatments, and exogenous tryptophan treatments, respectively. *, **, and *** are significantly different at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively, and ns is not significantly different. Columns with different lowercase letters are significantly different at the 0.05 probability level. NN: normal nitrogen treatment; LN: low nitrogen treatment; NN-T: normal nitrogen was sprayed with tryptophan; LN-T: low nitrogen was sprayed with tryptophan.

圖9 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)幼苗根系質(zhì)外體pH的影響

I為低氮處理后1 d; II為低氮處理后5 d; III為低氮處理后10 d。C、S和B分別表示不同自交系、不同氮水平處理和外源色氨酸處理。*、**和***分別表示在0.05、0.01和0.001概率水平差異顯著, ns表示差異不顯著。不同小寫字母表示0.05概率水平差異顯著。NN: 正常氮處理; LN: 低氮處理; NN-T: 正常氮噴施色氨酸處理; LN-T: 低氮噴施色氨酸處理。

I: 1 day after low nitrogen treatment; II: 5 days after low nitrogen treatment; III: 10 days after low nitrogen treatment. C, S, and B represent hybrid lines, different nitrogen treatments, and exogenous tryptophan treatments, respectively. *, **, and *** are significantly different at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively, and ns is not significantly different. Columns with different lowercase letters are significantly different at the 0.05 probability level. NN: normal nitrogen treatment; LN: low nitrogen treatment; NN-T: normal nitrogen was sprayed with tryptophan; LN-T: low nitrogen was sprayed with tryptophan.

圖10 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)幼苗根系A(chǔ)TP含量的影響

I為低氮處理后1 d; II為低氮處理后5 d; III為低氮處理后10 d。C、S和B分別表示不同自交系、不同氮水平處理和外源色氨酸處理。*、**和***分別表示在0.05、0.01和0.001概率水平差異顯著, ns表示差異不顯著。不同小寫字母表示0.05概率水平差異顯著。NN: 正常氮處理; LN: 低氮處理; NN-T: 正常氮噴施色氨酸處理; LN-T: 低氮噴施色氨酸處理。

I: 1 day after low nitrogen treatment; II: 5 days after low nitrogen treatment; III: 10 days after low nitrogen treatment. C, S, and B represent hybrid lines, different nitrogen treatments, and exogenous tryptophan treatments, respectively. *, **, and *** are significantly different at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively, and ns is not significantly different. Columns with different lowercase letters are significantly different at the 0.05 probability level. NN: normal nitrogen treatment; LN: low nitrogen treatment; NN-T: normal nitrogen was sprayed with tryptophan; LN-T: low nitrogen was sprayed with tryptophan.

圖11 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)幼苗根系6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性的影響

I為低氮處理后1 d; II為低氮處理后5 d; III為低氮處理后10 d。C、S和B分別表示不同自交系、不同氮水平處理和外源色氨酸處理。*、**和***分別表示在0.05、0.01和0.001概率水平差異顯著, ns表示差異不顯著。不同小寫字母表示0.05概率水平差異顯著。NN: 正常氮處理; LN: 低氮處理; NN-T: 正常氮噴施色氨酸處理; LN-T: 低氮噴施色氨酸處理。

I: 1 day after low nitrogen treatment; II: 5 days after low nitrogen treatment; III: 10 days after low nitrogen treatment. C, S, and B represent hybrid lines, different nitrogen treatments, and exogenous tryptophan treatments, respectively. *, **, and *** are significantly different at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively, and ns is not significantly different. Columns with different lowercase letters are significantly different at the 0.05 probability level. NN: normal nitrogen treatment; LN: low nitrogen treatment; NN-T: normal nitrogen was sprayed with tryptophan; LN-T: low nitrogen was sprayed with tryptophan.

圖12 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)幼苗根系丙酮酸激酶活性的影響

I為低氮處理后1 d; II為低氮處理后5 d; III為低氮處理后10 d。C、S和B分別表示不同自交系、不同氮水平處理和外源色氨酸處理。*、**和***分別表示在0.05、0.01和0.001概率水平差異顯著, ns表示差異不顯著。不同小寫字母表示0.05概率水平差異顯著。NN: 正常氮處理; LN: 低氮處理; NN-T: 正常氮噴施色氨酸處理; LN-T: 低氮噴施色氨酸處理。

I: 1 day after low nitrogen treatment; II: 5 days after low nitrogen treatment; III: 10 days after low nitrogen treatment. C, S, and B represent hybrid lines, different nitrogen treatments, and exogenous tryptophan treatments, respectively. *, **, and *** are significantly different at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively, and ns is not significantly different. Columns with different lowercase letters are significantly different at the 0.05 probability level. NN: normal nitrogen treatment; LN: low nitrogen treatment; NN-T: normal nitrogen was sprayed with tryptophan; LN-T: low nitrogen was sprayed with tryptophan.

2.8.4 幼苗根系檸檬酸合酶活性 由圖13可知, 低氮脅迫1 d后, 398B和CS-3541根系檸檬酸合酶活性差異不顯著; 低氮脅迫5 d和10 d后, 398B根系檸檬酸合酶的活性顯著增加3.55%和6.82%, CS-3541根系檸檬酸合酶的活性顯著增加6.93%和7.50%。外源色氨酸處理后5 d和10 d, 與低氮條件下未噴施色氨酸相比較, 398B根系檸檬酸合酶的活性顯著增加19.06%和21.21%, CS-3541根系檸檬酸合酶的活性顯著增加14.00%和12.52%; 自交系、低氮脅迫和外源色氨酸處理之間的交互作用存在顯著性差異(<0.05)。

2.8.5 幼苗根系α-酮戊二酸脫氫酶活性 由圖14可知, 低氮脅迫1、5和10 d后, 398B根系α-酮戊二酸脫氫酶活性顯著增加2.62%、3.62%和5.38%; 低氮脅迫1 d和5 d后, CS-3541根系α-酮戊二酸脫氫酶活性顯著增加1.91%和3.54%, 低氮脅迫10 d后, CS-3541根系α-酮戊二酸脫氫酶活性未達(dá)到顯著水平。外源色氨酸處理后5 d和10 d, 與低氮條件下未噴施色氨酸相比較, 398B根系α-酮戊二酸脫氫酶活性顯著增加13.35%和19.76%, CS-3541根系α-酮戊二酸脫氫酶活性顯著增加14.05%和17.71%; 自交系、低氮脅迫和外源色氨酸處理之間的交互作用存在顯著性差異(<0.05)。

圖13 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)幼苗根系檸檬酸合酶活性的影響

I為低氮處理后1 d; II為低氮處理后5 d; III為低氮處理后10 d。C、S和B分別表示不同自交系、不同氮水平處理和外源色氨酸處理。*、**和***分別表示在0.05、0.01和0.001概率水平差異顯著, ns表示差異不顯著。不同小寫字母表示0.05概率水平差異顯著。NN: 正常氮處理; LN: 低氮處理; NN-T: 正常氮噴施色氨酸處理; LN-T: 低氮噴施色氨酸處理。

I: 1 day after low nitrogen treatment; II: 5 days after low nitrogen treatment; III: 10 days after low nitrogen treatment. C, S, and B represent hybrid lines, different nitrogen treatments, and exogenous tryptophan treatments, respectively. *, **, and *** are significantly different at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively, and ns is not significantly different. Columns with different lowercase letters are significantly different at the 0.05 probability level. NN: normal nitrogen treatment; LN: low nitrogen treatment; NN-T: normal nitrogen was sprayed with tryptophan; LN-T: low nitrogen was sprayed with tryptophan.

圖14 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)幼苗根系α-酮戊二酸脫氫酶活性的影響

I為低氮處理后1 d; II為低氮處理后5 d; III為低氮處理后10 d。C、S和B分別表示不同自交系、不同氮水平處理和外源色氨酸處理。*、**和***分別表示在0.05、0.01和0.001概率水平差異顯著, ns表示差異不顯著。不同小寫字母表示0.05概率水平差異顯著。NN: 正常氮處理; LN: 低氮處理; NN-T: 正常氮噴施色氨酸處理; LN-T: 低氮噴施色氨酸處理。

I: 1 day after low nitrogen treatment; II: 5 days after low nitrogen treatment; III: 10 days after low nitrogen treatment. C, S, and B represent hybrid lines, different nitrogen treatments, and exogenous tryptophan treatments, respectively. *, **, and *** are significantly different at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively, and ns is not significantly different. Columns with different lowercase letters are significantly different at the 0.05 probability level. NN: normal nitrogen treatment; LN: low nitrogen treatment; NN-T: normal nitrogen was sprayed with tryptophan; LN-T: low nitrogen was sprayed with tryptophan.

3 討論

3.1 低氮脅迫對(duì)高粱幼苗根系伸長的影響

植物為了適應(yīng)低氮環(huán)境, 一個(gè)重要的響應(yīng)策略是促進(jìn)根系伸長。Subudhi等[35]研究表明, 低氮條件下作物通過調(diào)節(jié)根系構(gòu)型而影響對(duì)氮素的吸收, 從而增強(qiáng)對(duì)低氮的耐受性。研究表明, 不同耐低氮性苦蕎和油菜品種間分別對(duì)低氮脅迫的響應(yīng)存在顯著差異, 耐低氮品種在低氮脅迫環(huán)境下具有極強(qiáng)的生長優(yōu)勢[36-37]。本試驗(yàn)結(jié)果表明在低氮脅迫條件下, 耐低氮能力不同的2份高粱自交系398B和CS-3541根系均顯著伸長, 同時(shí), 低氮脅迫下398B和CS- 3541根尖細(xì)胞長度也顯著增加; 其中, 398B根系伸長的長度大于CS-3541, 說明398B相比較于CS- 3541具有更強(qiáng)的耐低氮能力。另外, 在本研究中, 低氮脅迫顯著增加了根系中色氨酸含量以及依賴色氨酸途徑合成生長素相關(guān)基因的表達(dá), 進(jìn)一步通過對(duì)根尖轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn), 低氮脅迫下根系差異基因集中在色氨酸代謝通路以及依賴色氨酸途徑合成生長素通路上, 說明低氮脅迫下色氨酸可能通過合成生長素參與了高粱幼苗根系的伸長。Tian等[38]和Gao等[39]研究表明, 生長素在根系伸長中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用, 不同氮濃度下玉米根系長度與根系IAA含量密切相關(guān), 并且, 外源施加NAA和IAA能夠促進(jìn)根系伸長, 這與本研究的結(jié)果相一致。

3.2 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)高粱幼苗根系伸長的影響

色氨酸作為氨基酸之一, 能夠增強(qiáng)植物對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)性, 提高植物的抗逆性[40]。鐘曉紅等[41]研究表明, 外源色氨酸處理后的油菜幼苗根系更加發(fā)達(dá), 提高了根系吸收養(yǎng)分的能力。本研究中, 低氮脅迫下, 外源色氨酸處理顯著增加了根系中生長素的水平, 并進(jìn)一步促進(jìn)了高粱幼苗根系伸長。生長素對(duì)根系形態(tài)的構(gòu)建起著關(guān)鍵作用, 色氨酸作為生長素合成前體, 其中YUC途徑是最重要生長素合成途徑[42]。在本研究中, 低氮脅迫顯著增加了YUC途徑上的、和基因表達(dá)量, 說明低氮脅迫下高粱幼苗通過色氨酸代謝途徑增加根系生長素含量。并且, 398B根系生長素的含量高于CS-3541, 398B相對(duì)于CS-3541具有更強(qiáng)的耐低氮特性。根據(jù)酸生長理論, 在低氮脅迫下, 生長素在質(zhì)外體積累并激活生長素受體蛋白, 刺激與膜結(jié)合的H+泵, 促進(jìn)質(zhì)子釋放到細(xì)胞壁基質(zhì)中, 改變細(xì)胞基質(zhì)中的pH值, 細(xì)胞壁中的酸性環(huán)境激活相關(guān)酶和擴(kuò)張素, 使細(xì)胞壁松動(dòng), 由于細(xì)胞自身存在膨壓, 從而促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)大和伸長[43]。在本研究中, 低氮條件下398B和CS-3541根尖生長素含量的上升, 質(zhì)膜H+-ATPase的活性上升, 說明低氮條件下高粱根系中生長素含量的提高激活了質(zhì)膜H+-ATPase的活性, 從而促進(jìn)了根尖細(xì)胞的長度, 進(jìn)一步證明了色氨酸在低氮脅迫下通過合成生長素促進(jìn)了高粱幼苗根系伸長的生理機(jī)制。

3.3 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)高粱幼苗根系能量代謝的影響

植物的生長發(fā)育過程中伴隨著能量代謝, 以滿足植物對(duì)能量的需求[44]。Liu等[45]研究表明, 低鉀脅迫誘導(dǎo)了大豆根系能量代謝, 促進(jìn)糖酵解和TCA循環(huán), 從而增強(qiáng)能量代謝以此來抵抗低鉀脅迫。洪麗芳等[46]研究表明, 外源生長素能夠增加煙草根系碳水化合物含量, 提高了根系A(chǔ)TP含量, 為根系的伸長和物質(zhì)跨膜運(yùn)輸提供能量, 進(jìn)而利于根系的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn), 外源色氨酸通過增強(qiáng)植物體內(nèi)的物質(zhì)代謝及相關(guān)酶活性, 不僅增加了植物的根長和株高, 同時(shí)提高了植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)[47]。在本研究中, 外源色氨酸處理后, 398B和CS-3541根系中能量代謝關(guān)鍵酶的活性均顯著增加。其中, 低氮脅迫下, 398B根系丙酮酸激酶和α-酮戊二酸脫氫酶活性顯著上升, 而CS-3541在低氮處理后10 d, 根系丙酮酸激酶和α-酮戊二酸脫氫酶活性差異不顯著, 說明398B根系能夠在低氮脅迫下保持更高的丙酮酸激酶和α-酮戊二酸脫氫活性。丙酮酸激酶是糖酵解途徑上的調(diào)節(jié)酶, 而α-酮戊二酸脫氫酶作為調(diào)控三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶, 其氧化脫羧過程與丙酮酸激酶相似[48], 低氮條件下二者含量的升高為高粱根系的伸長奠定了能量基礎(chǔ)。在磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)中, 6-磷酸葡萄糖脫氫酶和檸檬酸合酶作為關(guān)鍵酶之一[49]。低氮脅迫下, 398B和CS-3541根系中二者酶活性顯著增加, 并且外源色氨酸處理的398B根系中酶活性上升的幅度更大, 398B更高的能量供應(yīng)加快了其根系的伸長。因此, 低氮脅迫下, 外源色氨酸能夠增加根系中能量代謝關(guān)鍵酶的活性, 以此產(chǎn)生更多的ATP, 為生長素酸化高粱根系細(xì)胞壁奠定了能量基礎(chǔ), 其對(duì)398B根系產(chǎn)生的能量更多, 從而398B對(duì)低氮環(huán)境的適應(yīng)性更強(qiáng)。

4 結(jié)論

低氮脅迫下, 高粱幼苗根系伸長, 根尖細(xì)胞平均長度增加, 并且在低氮脅迫下398B根長和根尖細(xì)胞長度均大于CS-3541; 通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn), 低氮脅迫下差異基因集中在依賴色氨酸途徑合成生長素上, 根系中內(nèi)源色氨酸含量顯著增加。低氮脅迫下外源色氨酸顯著促進(jìn)398B和CS-3541的根系伸長, 增加398B和CS-3541根系生長素含量及H+-ATP酶活性, 減少了根系pH, 從而酸化根系細(xì)胞壁; 外源色氨酸顯著增強(qiáng)α-酮戊二酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、丙酮酸激酶和異檸檬酸合酶的活性以及根系中ATP含量, 為生長素引起的根系酸化提供了能量, 最終促進(jìn)高粱根系伸長, 其中, 對(duì)398B根系伸長的作用更大(圖15)。

圖15 低氮脅迫下外源色氨酸對(duì)高粱幼苗根系伸長的作用模式

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Effects of exogenous tryptophan on root elongation of sorghum seedlings under low nitrogen stress

LI Bang**, LIU Chun-Juan**, GUO Jun-Jie, WU Yu-Xin, DENG Zhi-Cheng, ZHANG Min, CUI Tong, LIU Chang, and ZHOU Yu-Fei*

College of Agronomy, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China

The physiological mechanism of root elongation in sorghum under low nitrogen stress remains unclear. Here, two sorghum inbred lines, 398B (low nitrogen tolerance) and CS-3541 (low nitrogen sensitivity), were used as experimental materials, to clarify the physiological mechanism of root elongation of sorghum seedlings under low nitrogen stress. The results showed that, compared with normal nitrogen stress, low nitrogen stress significantly increased root length and root tip cell length of 398B and CS-3541, and 398B had longer root length. The endogenous tryptophan content in roots of 398B and CS-3541 increased significantly at 1, 5, and 10 days after low nitrogen stress. Tryptophan was involved in root elongation of sorghum under low nitrogen conditions through the auxin synthesis pathway by RNA-seq, and the relative expression level of genes in the auxin synthesis pathway of root in 398B was significantly higher than that in CS-3541. Furthermore, the root lengths of 398B and CS-3541 were significantly increased by 50 mg L–1exogenous tryptophan treatment under low nitrogen conditions. Exogenous tryptophan activated the activity of H+-ATPase in plasma membrane by increasing the content of auxin, promoted the acidification of plasma membrane, and improved the activity of enzymes related to energy metabolism and ATP content, and thus inducing energy metabolism of root system. Exogenous tryptophan had a better effect on 398B under low nitrogen stress. In conclusion, low nitrogen stress activated the key role of endogenous tryptophan in sorghum root elongation, and auxin depended on tryptophan pathway and synergistic enhancement of energy metabolism were the physiological mechanism promoting root elongation of sorghum seedlings under low nitrogen stress.

sorghum; low nitrogen; exogenous tryptophan; auxin; energy metabolism; root elongation

10.3724/SP.J.1006.2023.24133

本研究由財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-06-14.5-A17)和遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(LSNFW202006)資助。

This study was supported by the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-06-14.5-A17) and the General Research Project of Education Department of Liaoning Province of China (LSNFW202006).

周宇飛, E-mail: zhouyufei@syau.edu.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

李邦, E-mail: 3281908550@qq.com; 劉春娟, E-mail: liuchunjuan@syau.edu.cn

2022-06-01;

2022-09-05;

2022-09-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220921.1033.002.html

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