張盈川 吳曉明玉 陶保龍 陳 麗,2 魯海琴 趙 倫 文 靜 易 斌 涂金星 傅廷棟 沈金雄,*

Bna-miR43-FBXL調(diào)控模塊參與甘藍(lán)型油菜鋁脅迫的功能分析

張盈川1吳曉明玉1陶保龍1陳 麗1,2魯海琴1趙 倫1文 靜1易 斌1涂金星1傅廷棟1沈金雄1,*

1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 國(guó)家油菜工程技術(shù)研究中心, 湖北武漢 430070;2長(zhǎng)江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院, 重慶 408100

在酸性土壤中, 鋁是制約作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的一個(gè)重要因素, 如何利用酸性土地意義重大。本研究的對(duì)象是前期本課題鑒定到的一個(gè)未被報(bào)道的miRNA——Bna-miR43。系統(tǒng)地對(duì)甘藍(lán)型油菜中Bna-miR43及其靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及表達(dá)模式鑒定, 并構(gòu)建Bna-miR43過(guò)表達(dá)載體探討了Bna-miR43-FBXL模塊在甘藍(lán)型油菜響應(yīng)鋁脅迫的分子機(jī)制。5￠-RACE結(jié)果表明Bna-miR43在甘藍(lán)型油菜中真實(shí)切割、。生物信息學(xué)分析表明,、在擬南芥中的同源基因?yàn)? 編碼含F(xiàn)-box的E3泛素連接酶。qRT-PCR結(jié)果顯示, Bna-miR43及其靶基因在甘藍(lán)型油菜不同組織以及鋁脅迫瞬時(shí)處理下的表達(dá)水平存在此消彼長(zhǎng)的現(xiàn)象。油菜轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)表明, Bna-miR43的過(guò)表達(dá)株系地上部分長(zhǎng)勢(shì)良好, 體內(nèi)積累了較少的MDA和H2O2, 同時(shí)轉(zhuǎn)基因植株根系的鋁積累量較對(duì)照少。本研究結(jié)果為甘藍(lán)型油菜中鋁脅迫響應(yīng)提供參考。

甘藍(lán)型油菜; Bna-miR43; F-box; 鋁脅迫

鋁是土壤中最豐富的金屬元素, 當(dāng)土壤pH<5時(shí), 鋁以Al3+的形態(tài)存在于土壤中[1]。酸性土壤中, Al3+是制約作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素[2]。植物在受到鋁毒后, Al3+會(huì)迅速造成根尖損傷, 根系從土壤中吸收水分和養(yǎng)分的能力降低[3]。植物應(yīng)對(duì)鋁脅迫主要有2種方式: 誘導(dǎo)Al3+的外排和Al3+內(nèi)部耐受[4-5]。植物誘導(dǎo)Al3+外排主要是通過(guò)根系分泌檸檬酸、蘋(píng)果酸和草酸和Al3+螯合, 將其從根部排出[6-7]。植物對(duì)Al3+內(nèi)部耐受則是通過(guò)提高細(xì)胞抗氧化能力或?qū)l3+隔離在液泡中。擬南芥在受到鋁脅迫后, 體內(nèi)多種抗氧化酶的活性增加, 減少了體內(nèi)活性氧的積累。水稻鋁轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可將根尖細(xì)胞吸收的Al3+隔離在液泡中, 在調(diào)控水稻耐鋁性中起重要作用[8-10]。轉(zhuǎn)錄因子STOP1 (SENSITIVE TO PROTEIN RHIZOTOXICITY 1)在植物響應(yīng)鋁脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中必不可少[4]。一方面, STOP1可以調(diào)節(jié)促進(jìn)根系外排Al3+的基因的表達(dá), 例如蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因, 促進(jìn)根系外排Al3+; 另一方面, STOP1作為轉(zhuǎn)錄因子可以激活其他響應(yīng)氧化應(yīng)激反應(yīng)的基因的表達(dá),增加植物對(duì)Al3+的耐受度[11-12]。

植物micro RNA (miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源非編碼小分子RNA, 其主要通過(guò)負(fù)調(diào)控靶基因從而行使功能[13]。目前, 關(guān)于miRNA參與植物響應(yīng)鋁脅迫已被陸續(xù)報(bào)道。水稻中miR168、miR528、miR399在受到鋁脅迫后均上調(diào), 通過(guò)不同的生物途徑緩解鋁毒[14]。大豆中通過(guò)高通量測(cè)序鑒定到了30個(gè)可以響應(yīng)Al3+的miRNA, 通過(guò)對(duì)這些miRNAs的靶基因進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)靶基因多參與到氧化應(yīng)激反應(yīng)中[15]。擬南芥中miR160、miR164可以通過(guò)負(fù)調(diào)控靶基因參與控制擬南芥根系的生長(zhǎng), 在擬南芥受到鋁脅迫后發(fā)揮重要作用[16]。

盡管目前已在甘藍(lán)型油菜中鑒定到許多miRNA, 但關(guān)于響應(yīng)鋁脅迫的miRNA尚未有較多報(bào)道, miRNA調(diào)控響應(yīng)鋁脅迫的機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。本研究前期通過(guò)小RNA測(cè)序在甘藍(lán)型油菜中鑒定到了一個(gè)新miRNA (Bna-miR43), 通過(guò)生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式鑒定以及轉(zhuǎn)基因油菜表型觀察, 揭示了Bna-miR43在甘藍(lán)型油菜響應(yīng)鋁脅迫中的作用, 為完善甘藍(lán)型油菜miRNA響應(yīng)鋁脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)中降解組測(cè)序所用材料為角果性狀存在較大差異的甘藍(lán)型油菜株系08-8008和4942高世代回交群體BC5中的長(zhǎng)角果油菜以及短角果油菜在開(kāi)花初期、0～7 d雌蕊、0～7 DAP角果混樣測(cè)序; 構(gòu)建RLM-5￠RACE文庫(kù)所使用的油菜為上述長(zhǎng)角果油菜和短角果油菜0～7 DAP角果的混池; 轉(zhuǎn)基因受體材料為甘藍(lán)型油菜J572。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RLM-RACE驗(yàn)證靶基因切割位點(diǎn) 使用FirstChoice RLM-RACE (Invitrogen, 美國(guó))試劑盒構(gòu)建RLM-RACE文庫(kù), 構(gòu)建文庫(kù)具體方法參照說(shuō)明書(shū)。以構(gòu)建的RLM-RACE文庫(kù)為模板, 進(jìn)行2輪nested PCR, 選擇正確大小的目的片段進(jìn)行TA克隆測(cè)序, 并確定其切割位點(diǎn), 具體步驟參照說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 基因家族生物信息學(xué)分析 使用DNAMAN軟件對(duì)目的序列進(jìn)行比對(duì); 利用甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫(kù)確定RLM-RACE驗(yàn)證到的靶基因?qū)儆贔BXL基因家族; 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)篩選甘藍(lán)型油菜FBXL基因家族序列; 用Pfam網(wǎng)站與hmmresearch對(duì)FBXL基因家族隱馬爾可夫模型搜索鑒定確定最終家族成員; 使用clustalw軟件對(duì)家族成員的蛋白序列比較分析后, 使用iqtree軟件繪制FBXL基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù); 使用The MEME Suite網(wǎng)站的MEME分析工具對(duì)FBXL基因家族的保守基序進(jìn)行分析; 使用TBtools繪制FBXL基因家族保守基序與基因結(jié)構(gòu)圖;根據(jù)MUSCLE 在線工具(https://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/muscle/)分析序列同一性, 并使用R語(yǔ)言中corrplot程序包繪制序列同一性圖。

1.2.4 油菜下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化 具體方法參考陳麗[17]。

1.2.5 植物總RNA提取 TRIzol試劑(Invitrogen, 美國(guó))提取總RNA。

1.2.6 miRNA及靶基因的反轉(zhuǎn)錄和定量 利用莖環(huán)法對(duì)miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄[18]。使用Vazyme的miRNA引物設(shè)計(jì)軟件, 對(duì)Bna-miR43的反轉(zhuǎn)錄引物和定量PCR引物進(jìn)行設(shè)計(jì)。miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒采用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop) (Vazyme, 南京), qRT-PCR采用Vazyme公司的miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix。靶基因的反轉(zhuǎn)錄采用RevertAid RT試劑盒(Thermo Scientific, 美國(guó)), 靶基因熒光定量采用MonAmp qPCR Mix。miRNA內(nèi)參為U6, 靶基因內(nèi)參為, 擴(kuò)增程序參考說(shuō)明書(shū)。根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[19]。

1.2.7 鋁脅迫瞬時(shí)處理Bna-miR43表達(dá)量檢測(cè) 選取飽滿一致的J572油菜種子, 表面消毒后放入網(wǎng)格狀播種盒中在霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)2周后, 轉(zhuǎn)入0.5 mmol L–1CaCl2、50 μmol L–1AlCl3(pH 4.5)的溶液中, 分別在0、2、4、8、12、24 h取樣, 均取3個(gè)生物學(xué)重復(fù), –80℃保存以便后續(xù)qRT-PCR。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因植株鋁脅迫表型鑒定 挑選均勻一致的J572油菜與轉(zhuǎn)基因油菜種子, 表面消毒后, 放入培養(yǎng)皿中進(jìn)行催芽, 待幼芽發(fā)育7 d后, 將其移至水培盒中固定生長(zhǎng), 生長(zhǎng)至3周后選取發(fā)育狀態(tài)相同, 均勻一致的幼苗, 使用海綿將油菜幼苗固定再裝有培養(yǎng)液的錐形瓶(表面黑暗處理)中, 對(duì)照組用0.5 mmol L–1CaCl2(pH 4.5)的溶液培養(yǎng), 處理組用0.5 mmol L–1CaCl2、300 μmol L–1AlCl3(pH 4.5)的溶液培養(yǎng), 處理時(shí)間為7 d。

1.2.9 油菜根系過(guò)氧化氫和丙二醛含量檢測(cè) 使用H2O2含量檢測(cè)試劑盒(Solarbio, 北京), 測(cè)定油菜組織過(guò)氧化氫含量; 使用MDA含量檢測(cè)試劑盒(Solarbio, 北京), 測(cè)定油菜組織丙二醛含量。隨機(jī)取不同株系的3株油菜新鮮根系, 測(cè)定方法參照說(shuō)明書(shū)。

研究對(duì)象小行星Toutatis和探測(cè)器Viking，根據(jù)現(xiàn)有材料中的描述以及圖片信息，采用Solidworks軟件進(jìn)行建模，其特征化以及參數(shù)化等特點(diǎn)，能夠勝任復(fù)雜模型建模，在航空、船舶、模具等工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2]。

1.2.10 蘇木精染色觀察根系鋁分布情況 配置0.2%蘇木精染色液: 0.2 g蘇木精粉末和0.02 g碘化鉀(KI)用少量去離子水溶解, 定容至100 mL。將鋁脅迫處理7 d后的油菜根系用去離子水浸泡沖洗3～4次, 清除附著在根系表面的鋁離子, 放入配置好的0.2%蘇木精工作液中完全浸泡, 避光染色30 min。染色完成后, 使用去離子水反復(fù)去除多余染液, 使用體式顯微鏡觀察根系染色情況并照相[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bna-miR43基本信息及其靶基因驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)2個(gè)角果長(zhǎng)度差異較大的甘藍(lán)型油菜株系進(jìn)行小RNA和降解組測(cè)序, 結(jié)果在2個(gè)文庫(kù)中均鑒定到Bna-miR43 (附表1), 同時(shí)降解組測(cè)序結(jié)果顯示Bna-miR43對(duì)靶基因的切割效率很高[17]。利用RNAFold繪制Bna-pre-miR43的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖1), 其前體可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu), 最小自由能為–24.37 kcal mol–1。在甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn), 前體序列位于甘藍(lán)型油菜C03染色體的5,010,729～5,010,920位置, 位于基因間隔區(qū)。上述特征均符合miRNA的基本特征。

圖1 Bna-miR43前體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

箭頭所指處為Bna-miR43成熟體序列。

Arrow indicates Bna-miR43 mature sequence.

降解組測(cè)序鑒定到Bna-miR43的4個(gè)候選靶基因均為F-box家族蛋白。對(duì)降解組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 通過(guò)對(duì)Bna-miR43剪切位點(diǎn)進(jìn)行分析, 可根據(jù)pvalue值對(duì)靶基因進(jìn)行分類(lèi)。4個(gè)候選靶基因均屬于Category0, 說(shuō)明Bna-miR43對(duì)靶基因的切割效率高, 可靠性高(表1)。RLM-RACE驗(yàn)證Bna-miR43的候選靶基因, 表明Bna-miR43在甘藍(lán)型油菜中真實(shí)切割(圖2)。

2.2 Bna-miR43靶基因與擬南芥同源基因序列比對(duì)分析

將RLM-RACE驗(yàn)證到的油菜靶基因與擬南芥同源序列進(jìn)行比對(duì)。DNAMAN比對(duì)結(jié)果如圖3, 2個(gè)靶基因與擬南芥同源基因()序列高度相似、序列保守性強(qiáng), 并且其結(jié)構(gòu)域相同, 均在C端含LRR結(jié)構(gòu)域, 屬于FBXL家族。因此推測(cè)Bna-miR43的靶基因與擬南芥同源基因()在植物中可能行使相似功能。

表1 Bna-miR43降解組預(yù)測(cè)靶基因情況概述

Table 1 Overview of Bna-miR43 target genes predicted from degradome sequencing

圖2 RLM-RACE驗(yàn)證靶基因定向切割位點(diǎn)

圖中箭頭表示切割位點(diǎn), 數(shù)字表示挑斑克隆驗(yàn)證目標(biāo)mRNA切割位點(diǎn)的克隆頻率。

The arrow indicates the cleavage site in the target genes, the number represents the frequency of clones to validate the cleavage sites of target mRNA.

2.3 Bna-miR43靶基因家族生物信息學(xué)分析

2.3.1 FBXL基因家族在甘藍(lán)型油菜中的進(jìn)化分析 根據(jù)BnTIR網(wǎng)站中BLAST工具搜索和hmmreash對(duì)隱馬爾可夫模型搜索分析, 最終在甘藍(lán)型油菜中鑒定到39個(gè)FBXL基因家族成員。為確定甘藍(lán)型油菜FBXL基因家族的進(jìn)化關(guān)系, 對(duì)39個(gè)FBXL基因家族成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示, 39個(gè)甘藍(lán)型油菜FBXL基因被分為4組(組I、II、III、IV)。I亞組包含6個(gè)成員, II亞組包含11個(gè)成員, III亞組包含13個(gè)成員, IV亞組包含9個(gè)成員。總體而言, 分組為同一亞組的基因可能具有相似功能。值得注意的是, 靶基因和兩個(gè)成員均分布在II組中(圖4-A)。

2.3.2 甘藍(lán)型油菜FBXL亞族基因結(jié)構(gòu)與Motif元件分析 根據(jù)FBXL基因家族進(jìn)化分析結(jié)果(圖4-A), 對(duì)靶基因所在的II亞族進(jìn)行保守基序分析。從的BLAST結(jié)果中選取-value值為0的2個(gè)擬南芥FBXL蛋白(、)做進(jìn)一步比較。采用The MEME Suite網(wǎng)站提供的MEME分析工具分析13個(gè)亞族成員(含2個(gè)擬南芥同源基因)的保守基序。結(jié)果顯示(圖4-B), 除和缺少motif5, 以及、、缺少motif4外, 其余成員均包含所有基序。其中motif1組成油菜F-box結(jié)構(gòu)域, motif2組成LRR結(jié)構(gòu)域。

圖3 油菜靶基因和擬南芥同源基因序列比對(duì)結(jié)果

圖4 油菜FBXL基因家族進(jìn)化分析

A: 油菜FBXL基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù); B: F-box家族的基因結(jié)構(gòu)與motif。

A: phylogenetic tree of FBXL gene family in; B: the gene structure and motif of F-box family.

使用TBtools對(duì)靶基因所在亞族進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析, 根據(jù)基因注釋文件繪制基因結(jié)構(gòu)圖。其中I組和III組中的所有成員以及III組中的除、、基因均含有7個(gè)或8個(gè)外顯子。擬南芥基因長(zhǎng)度最長(zhǎng), 油菜長(zhǎng)度最短, 另有部分成員不存在5￠UTR結(jié)構(gòu)。

2.3.3 甘藍(lán)型油菜FBXL亞族基因序列相似性分析 為分析甘藍(lán)型油菜FBXL亞族基因序列的相似性, 使用MUSCLE 工具以默認(rèn)設(shè)置比對(duì)FBXL亞族成員蛋白序列全長(zhǎng)同一性。結(jié)果顯示。、、、、5個(gè)基因序列同一性均超過(guò)80%,、、3個(gè)基因有較高同一性,、、、4個(gè)基因序列同一性較高(圖5)。表明和序列相似性為95%, 即這2個(gè)基因在油菜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能行使相似的功能。

圖5 FBXL亞族基因序列同一性分析

2.4 Bna-miR43及靶基因在甘藍(lán)型油菜不同組織及鋁脅迫瞬時(shí)表達(dá)模式分析

在甘藍(lán)型油菜J572不同組織器官對(duì)Bna-miR43以及其靶基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)(圖6)發(fā)現(xiàn), Bna- miR43和靶基因、在根、莖、葉、花、角果中均有表達(dá)。其中Bna-miR43在花和角果中的表達(dá)量最高, 分別是根中表達(dá)量的50倍和250倍。在花中的表達(dá)量最高;在莖中的表達(dá)量最高,、均在葉中的表達(dá)量最低。Bna-miR43和靶基因的組織特異性表達(dá)分析表明, Bna-miR43對(duì)靶基因存在一定的調(diào)控作用, 兩者之間存在一定的此消彼長(zhǎng)的關(guān)系。

Bna-miR43的靶基因?qū)儆贔BXL家族, 其擬南芥同源基因可響應(yīng)鋁脅迫, 泛素化降解STOP1[11]。為鑒定Bna-miR43是否受鋁脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)甘藍(lán)型油菜J572進(jìn)行鋁響應(yīng)瞬時(shí)試驗(yàn), 在不同時(shí)段取樣進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果顯示, 在J572受到鋁脅迫后, Bna-miR43表達(dá)水平逐漸升高, 與第0小時(shí)(未脅迫對(duì)照)相比, 鋁處理第24小時(shí)的J572中Bna- miR43的表達(dá)量上調(diào)了10倍左右。而靶基因的表達(dá)水平恰好相反, 隨著鋁處理時(shí)間的增加,、的表達(dá)量逐漸降低, 受到抑制(圖7-A)。表明在鋁脅迫下, Bna- miR43會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)從而對(duì)靶基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。

圖6 Bna-miR43及其靶基因在甘藍(lán)型油菜不同組織中的表達(dá)分析

每次試驗(yàn)3次生物學(xué)重復(fù), 3次技術(shù)重復(fù)。*和**分別表示顯著水平(< 0.05)與極顯著水平(< 0.01)。

Three biological replicates and three technical replicates per experiment. *:< 0.05; **:< 0.01.

圖7 Bna-miR43及其靶基因表達(dá)量分析

A: 鋁脅迫下甘藍(lán)型油菜J572中Bna-miR43及其靶基因的表達(dá)模式; B: 過(guò)表達(dá)Bna-miR43轉(zhuǎn)基因油菜基因表達(dá)量分析。每次試驗(yàn)3次生物學(xué)重復(fù), 3次技術(shù)重復(fù)。*和**分別表示顯著水平(< 0.05)與極顯著水平(< 0.01)。

A: the expression level of Bna-miR43 and its target genes ofunder Al stress; B: gene expression of over expression Bna-miR43 transgenic rapeseed. Three biological replicates and three technical replicates per experiment, *:< 0.05; **:< 0.01.

2.5 Bna-miR43在甘藍(lán)型油菜鋁脅迫中的功能驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證Bna-miR43是否在甘藍(lán)型油菜中參與響應(yīng)鋁脅迫, 構(gòu)建了Bna-miR43的過(guò)表達(dá)材料, 對(duì)Bna-miR43過(guò)表達(dá)植株檢測(cè)基因表達(dá)量, 結(jié)果如圖7-B所示。轉(zhuǎn)基因株系中Bna-miR43的表達(dá)量上調(diào)了10～50倍左右, 而2個(gè)靶基因的表達(dá)量則顯著下調(diào)。

將T1代轉(zhuǎn)基因油菜的陽(yáng)性株系和對(duì)照J(rèn)572同時(shí)進(jìn)行鋁脅迫, 對(duì)地上部分表型觀察。未進(jìn)行鋁脅迫處理的J572與轉(zhuǎn)基因油菜材料植株形態(tài)和葉片狀態(tài)相同, 均為嫩綠色, 植株長(zhǎng)勢(shì)正常。鋁脅迫處理后, J572與Bna-miR43過(guò)表達(dá)植株均出現(xiàn)一定程度的萎蔫, 葉片失綠、皺縮, 植株長(zhǎng)勢(shì)異常。其中葉片失綠和萎蔫首先表現(xiàn)在老葉上。J572對(duì)鋁脅迫耐受度低于轉(zhuǎn)基因油菜, 表現(xiàn)為葉片嚴(yán)重失綠呈現(xiàn)紫紅色并伴有皺縮現(xiàn)象, 植株嚴(yán)重萎蔫; Bna-miR43過(guò)表達(dá)陽(yáng)性植株葉片輕微失綠, 部分葉片顏色變紫, 植株輕度萎蔫(圖8-A, B)。說(shuō)明過(guò)表達(dá)Bna-miR43能有效減輕鋁脅迫對(duì)油菜地上部分的毒害。

為直觀展示鋁脅迫后油菜根系中的鋁分布狀況,對(duì)未進(jìn)行鋁脅迫油菜與鋁處理1周后的油菜根系進(jìn)行蘇木精染色。結(jié)果表明, 鋁脅迫后J572根系染色最深, 根尖、分生區(qū)、伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū)的細(xì)胞均為深藍(lán)色, 鋁離子幾乎分布整個(gè)根部; 鋁脅迫后的轉(zhuǎn)基因油菜根系染色比J572較淺, 其中顏色較深區(qū)域?yàn)楦夂蜕扉L(zhǎng)區(qū), 其余區(qū)域均為淺藍(lán)色(圖8-C)。表明, 鋁脅迫影響油菜根系生長(zhǎng), 鋁離子進(jìn)入油菜根系后主要富集在根尖以及伸長(zhǎng)區(qū), 對(duì)根尖以及伸長(zhǎng)區(qū)破壞力較強(qiáng); 鋁脅迫下Bna-miR43轉(zhuǎn)基因油菜材料根系中的鋁含量低于J572。

2.6 鋁脅迫下油菜生理生化指標(biāo)分析

膜脂過(guò)氧化程度通常會(huì)作為植物受非生物脅迫的損害指標(biāo), 植物體內(nèi)積累的MDA含量越高, 說(shuō)明植物受到的氧化損傷越大。對(duì)鋁脅迫處理后和未進(jìn)行鋁脅迫處理的轉(zhuǎn)基因油菜和J572油菜材料根系取樣, 檢測(cè)根系MDA含量。未進(jìn)行鋁脅迫處理的轉(zhuǎn)基因油菜材料根系MDA含量與對(duì)照組J572沒(méi)有顯著性差異, 而鋁脅迫處理的轉(zhuǎn)基因油菜根系MDA含量顯著低于J572油菜根系MDA含量(圖9-A), 表明Bna-miR43過(guò)表達(dá)植株受到的氧化損傷較對(duì)照輕。

過(guò)氧化氫是植物體內(nèi)常見(jiàn)的一種活性氧, 是一種植物氧化應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)因子。過(guò)量的過(guò)氧化氫在細(xì)胞中積累會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成損傷并加速細(xì)胞衰老和死亡。鋁脅迫處理后轉(zhuǎn)基因植株的過(guò)氧化氫含量顯著低于對(duì)照(圖9-B)。表明過(guò)表達(dá)Bna-miR43能夠提高油菜的抗氧化能力。

圖8 鋁處理J572和Bna-miR43過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定

A: 未進(jìn)行鋁處理油菜植株地上部分表型分析; B: 鋁處理后的油菜植株地上部分表型分析, 隨機(jī)取5株同一株系不同油菜植株的倒一葉照相, 其中地上部分表型圖標(biāo)尺為5 cm, 倒一葉圖標(biāo)尺為2 cm; C: 蘇木精染色鑒定根中鋁分布。–Al3+: J572在0.5 mmol L–1CaCl2(pH 4.5)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)1周后, 使用蘇木精染色, 體式顯微鏡觀察拍照。+Al3+: 轉(zhuǎn)基因油菜與J572在0.5 mmol L-1CaCl2, 300 μmol L–1AlCl3(pH 4.5)培養(yǎng)液中處理1周后, 使用蘇木精染色, 體式顯微鏡觀察照相, 左側(cè)圖標(biāo)尺為1 mm, 右側(cè)圖標(biāo)尺為0.5 mm。

A: the untreated rapeseed material. B: rapeseed material treated with Al. The bottom leaves of the same strain were randomly taken for pictures, and each strain choose five rapeseed, in the pictures of above ground portion, bar: 5 cm; the bottom leaf, bar: 2 cm. C: the distribution of aluminum in root by hematoxylin dyeing, –Al3+: J572 was cultured in 0.5mmol L-1CaCl2(pH 4.5) for one week, then stained with hematoxylin, observed with stereo microscope and photographed. +Al3+: transgenic rapeseed and J572 were treated in 0.5 mmol L–1CaCl2,300 μmol L–1AlCl3(pH 4.5) for one week, then stained with hematoxylin, observed and photographed by stereo microscope, on the left side of the figure, bar: 1 mm, on the right side of the figure, bar: 0.5 mm.

圖9 過(guò)表達(dá)Bna-miR43油菜根系鋁脅迫后生理生化指標(biāo)分析

A: 過(guò)表達(dá)Bna-miR43油菜根系鋁脅迫后MDA含量分析; B: 過(guò)表達(dá)Bna-miR43油菜根系鋁脅迫后過(guò)氧化氫含量分析。每次試驗(yàn)3次生物學(xué)重復(fù), 3次技術(shù)重復(fù)。*和**分別表示顯著水平(< 0.05)與極顯著水平(< 0.01)。

A: MDA content in roots of Bna-miR43-overexpressed transgenic rapeseed after Al stress; B: hydrogen peroxide content in roots of Bna-miR43-overexpressed transgenic rapeseed after Al stress. Three biological replicates and three technical replicates per experiment, *:< 0.05; **:< 0.01.

3 討論

3.1 Bna-miR43及其靶基因

本研究通過(guò)對(duì)2個(gè)角果長(zhǎng)度差異較大的甘藍(lán)型油菜進(jìn)行小RNA測(cè)序, 鑒定到了Bna-miR43。對(duì)Bna-miR43的前體分析發(fā)現(xiàn), 其位于和的間隔區(qū), 即Bna-miR43有自己的啟動(dòng)子, 以獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位存在于甘藍(lán)型油菜的基因組上。通過(guò)5￠-RACE驗(yàn)證到Bna-miR43 對(duì)靶基因、存在真實(shí)切割。對(duì)Bna-miR43及靶基因在甘藍(lán)型油菜J572的各個(gè)組織器官進(jìn)行表達(dá)量分析, 結(jié)果顯示Bna- miR43及其靶基因、在甘藍(lán)型油菜的不同組織均有表達(dá), 這說(shuō)明Bna-miR43及其靶基因可能在甘藍(lán)型油菜的多個(gè)發(fā)育階段都具有調(diào)節(jié)功能。其中, 值得注意的是Bna- miR43在花和角果中的表達(dá)量較高, 這可能是由于本試驗(yàn)中測(cè)序用的組織器官為花和角果, 因此可能會(huì)更容易鑒定到在花和角果中表達(dá)量高的miRNA。Bna-miR43和靶基因的組織特異性表達(dá)結(jié)果表明, Bna-miR43對(duì)靶基因存在一定的負(fù)調(diào)控作用。

3.2 靶基因生物信息學(xué)分析

FBXL是F-box家族中的一個(gè)亞家族, 其特點(diǎn)是C末端具有不同的亮氨酸重復(fù)序列(LRR), FBXL基因家族通常與植物響應(yīng)逆境脅迫相關(guān)[21-23]。通過(guò)對(duì)、和擬南芥的同源基因進(jìn)行生物信息學(xué)的研究, 發(fā)現(xiàn)其均屬于FBXL基因家族。、和擬南芥同源基因序列和保守基序均具有較高相似性, 推測(cè)靶基因與擬南芥同源基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到相似作用[22], 即作為FBXL家族蛋白, 通過(guò)泛素化的方式參與到植物響應(yīng)鋁脅迫中?；诖宋覀儤?gòu)建Bna-miR43過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化油菜作進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 Bna-miR43在響應(yīng)鋁脅迫中的作用

對(duì)擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)查詢并進(jìn)行擬南芥同源基因的蛋白互作分析,基因與C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子STOP1相互作用并促進(jìn)其泛素化降解。C2H2型轉(zhuǎn)錄因子STOP1是鋁抗性所必需的, 它通過(guò)誘導(dǎo)植物鋁抗性基因表達(dá)從而增加植物對(duì)鋁脅迫的耐受度[24]。同時(shí)STOP1在轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平受鋁脅迫的調(diào)控, 擬南芥FBXL蛋白R(shí)AE1參與了STOP1的泛素化降解[24-25], 由此推測(cè), Bna-miR43可能通過(guò)調(diào)控靶基因(FBXL)參與響應(yīng)鋁脅迫。

水稻中研究發(fā)現(xiàn), 450 μmol L–1Al3+處理8 h后, 秈稻中有5個(gè)miRNA顯著下調(diào), 3個(gè)miRNA顯著上調(diào); 粳稻有13個(gè)顯著下調(diào), 6個(gè)顯著上調(diào)[14]。對(duì)甘藍(lán)型油菜J572進(jìn)行鋁脅迫處理, 對(duì)Bna-miR43和靶基因、的表達(dá)模式分析。結(jié)果表明, 鋁脅迫后Bna-miR43的表達(dá)量逐漸上升; 靶基因、表達(dá)量則與Bna-miR43的表達(dá)模式相反, 隨著鋁脅迫處理時(shí)間的增加,、表達(dá)量均下降。鋁脅迫下, Bna-miR43及其靶基因的表達(dá)差異說(shuō)明, 鋁脅迫能夠誘導(dǎo)Bna-miR43表達(dá), Bna-miR43表達(dá)量上升導(dǎo)致靶基因(FBXL家族蛋白)表達(dá)量下降。靶基因表達(dá)量的降低可能減少了FBXL 蛋白對(duì)STOP1轉(zhuǎn)錄因子的泛素化降解, 進(jìn)而提高油菜耐鋁性。

基于表達(dá)量分析結(jié)果, 對(duì)過(guò)表達(dá)Bna-miR43轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗進(jìn)行鋁脅迫。根據(jù)表型觀測(cè)結(jié)果和生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果得出, 過(guò)表達(dá)Bna-miR43轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鋁的耐受性高于J572。植物受到鋁脅迫后對(duì)首先影響根系的生長(zhǎng)[26-27]。擬南芥中有研究發(fā)現(xiàn), 在突變體中編碼蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的表達(dá)量被下調(diào), 根系外排Al3+的能力減弱導(dǎo)致突變體對(duì)鋁不耐受[11]。同時(shí), STOP1在其他植物中的直系同源同樣可以在鋁脅迫下調(diào)節(jié)鋁耐受基因的表達(dá)[28]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)根系進(jìn)行蘇木精染色, 發(fā)現(xiàn)J572根系受到鋁脅迫后積累了較轉(zhuǎn)基因株系更多的Al3+, 說(shuō)明FBXL的降低可能增加了STOP1在甘藍(lán)型油菜中的蛋白豐度, 促進(jìn)了油菜根系A(chǔ)l3+的外排。研究表明, Al3+引起的氧化損傷主要是由于植物受到氧化應(yīng)激導(dǎo)致體內(nèi)的活性氧含量增加[8]。鋁脅迫會(huì)激活NADPH氧化酶, 導(dǎo)致H2O2的含量顯著增加[29]?；钚匝醯倪^(guò)量積累會(huì)激活鋁耐受相關(guān)基因的表達(dá), 使植物在鋁誘導(dǎo)的ROS損傷中得以恢復(fù)[30]。在鋁脅迫之前Bna-miR43過(guò)表達(dá)株系和J572的MDA和H2O2含量大致相同, 在鋁脅迫之后MDA和H2O2含量較未處理組均顯著增加, 同時(shí)對(duì)照組積累的MDA和H2O2高于轉(zhuǎn)基因株系。由于STOP1蛋白中的鋅指結(jié)構(gòu)域高度保守, 即STOP1同源基因在調(diào)控植物鋁抗性方面的進(jìn)化是保守的, 同時(shí)FBXL在單子葉和雙子葉植物中結(jié)構(gòu)保守, 因此FBXL在調(diào)節(jié)STOP1同源基因進(jìn)而參與調(diào)節(jié)植物鋁抗性方面具有保守功能[24,28]。結(jié)合上述結(jié)果可以得出結(jié)論, 油菜在受到鋁脅迫后, Bna-miR43對(duì)靶基因、進(jìn)行切割, 導(dǎo)致其編碼的FBXL蛋白降低, 減弱了FBXL對(duì)轉(zhuǎn)錄因子STOP1的泛素化降解, 使得過(guò)表達(dá)植株對(duì)鋁脅迫表現(xiàn)出較高的抗性(圖10)。

4 結(jié)論

本研究在甘藍(lán)型油菜中鑒定到了Bna-miR43, 其靶基因?yàn)镕BXL蛋白家族成員。Bna-miR43在甘藍(lán)型油菜體內(nèi)對(duì)靶基因FBXL進(jìn)行切割, 降低其表達(dá)量, 可能減少了FBXL對(duì)轉(zhuǎn)錄因子STOP1的泛素化降解, 增強(qiáng)了對(duì)鋁脅迫的抗性。

圖10 Bna-miR43的可能作用途徑

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附表1 Bna-miR43的前體和成熟體序列

Table S1 Bna-miR43 precursor sequence and mature sequence

Bna-miR43序列 Sequence (5￠-3￠) 前體序列Precursor sequenceAGTTTAGGTCGAAGATTGGAACATTGGGACCGTGCCCTATTACAAACTTACACACATTGCAAGCATATTTCTATGCTCATACATATGATCAATATAGCCTTCTATCTTAAGTCAAGTATTGTATAATTTAATTTTGTTATACACTAATTTAGATCATGAAGAGTCTGGATTTTTAGTTTTTTTTTCTACAAT 成熟體序列Mature sequenceGAAGATTGGAACATTGGGACC

Functional analysis of Bna-miR43-FBXL regulatory module involved in aluminum stress in

ZHANG Ying-Chuan1, WU Xiao-Ming-Yu1, TAO Bao-Long1, CHEN Li1,2, LU Hai-Qin1, ZHAO Lun1, WEN Jing1, YI Bin1, TU Jing-Xing1, FU Ting-Dong1, and SHEN Jin-Xiong1,*

1National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / National Engineering Research Center of Rapeseed, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China,2School of Advanced Agriculture and Bioengineering, Yangtze Normal University, Chongqing 408100, China

Aluminum is one of the main factors that limited crop growth and yield in acid soil and how to utilize acid soil is of great significance. This study is based on Bna-miR43, an unreported miRNA identified in the previous study. We analyzed the molecular characteristics, conserved structure, phylogenetic analysis, and the expression level of Bna-miR43 and its target genes in. The Bna-miR43 over expression vector was constructed to explore the molecular mechanism of Bna-miR43- FBXL module inin aluminum stress. 5'-RACE showed that Bna-miR43 actually cleavedand. Bioinformatics analysis revealed that the homologous gene ofandinwas, encoding E3 ubiquitin ligase contained F-box. The qRT-PCR indicated that the relative expression levels of Bna-miR43 and its target genes had a phenomenon of trade-off in different tissues ofand under transient treatment of aluminum stress. Aluminum treatment showed that the entire aerial part of the transgenic plant grew much better than control and accumulated less MDA and H2O2. Meanwhile, the aluminum accumulation in the root of transgenic plants was less than the control. In this study, these results may provide reference for the response of aluminum stress in.

L.; Bna-miR43; F-box; aluminum stress

10.3724/SP.J.1006.2023.24079

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31871654)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31871654).

沈金雄, E-mail: jxshen@mail.hzau.edu.cn

E-mail: yczhang612@163.com

2022-04-02;

2022-07-21;

2022-08-19.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220819.1137.002.html

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