金 杰，張 鋒，孫 蓓，王秀杰，趙功寶

（1. 江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校，江蘇 徐州 221116；2. 徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221140）

荷葉被稱為蓮葉，是中國(guó)傳統(tǒng)的中藥材之一，具有減肥、減少脂肪、抗氧化、抗纖維化[1-2]等效果。在中藥上的荷葉常常以干制的形式出現(xiàn)。在古代荷葉就已經(jīng)流入中國(guó)，《醫(yī)林纂要》就有記載，荷葉入肝，可平熱，去濕，除妄熱[3-4]。在浙江和遼寧出土的碳化蓮子[5]均可表明古人就已經(jīng)開(kāi)始對(duì)荷葉蓮子有所涉獵，可見(jiàn)其歷史悠久?，F(xiàn)在，湖南、江蘇、安徽都是產(chǎn)荷葉的大省。雖然歷史悠久，但是目前市面上關(guān)于荷葉的產(chǎn)品少之又少，少數(shù)用于中醫(yī)藥研究，大多數(shù)無(wú)人采摘，造成了很大的浪費(fèi)。目前，荷葉大多被運(yùn)用于中醫(yī)藥行業(yè)，而對(duì)食品方面的研究進(jìn)展少之又少，高附加值的產(chǎn)品研發(fā)還處于初始階段。

乳酸菌飲料是以奶粉（牛奶）、果汁（梨、西瓜、獼猴桃、草莓等）、蔬菜汁為主要原料，發(fā)酵發(fā)酵劑制成的產(chǎn)品[6-9]。隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者的健康意識(shí)增強(qiáng)，對(duì)牛奶飲料的營(yíng)養(yǎng)、味道等特點(diǎn)的認(rèn)識(shí)越來(lái)越高，牛奶飲料的消費(fèi)需求也增加了。通過(guò)大量相關(guān)資料的調(diào)查，目前，對(duì)以荷葉為原料的產(chǎn)品研發(fā)類型很少[10-12]，只有干制荷葉在市面上出現(xiàn)的較多?，F(xiàn)有研究證明，荷葉浸提液含有大量生物活性物質(zhì)[1]，保健功能較高，應(yīng)用價(jià)值較好。試驗(yàn)以發(fā)酵型酸奶為原料，以荷葉浸提液為復(fù)配液制備條件，研制活菌型乳酸菌飲料。研究中將具有生物活性的荷葉浸提液與凝固型酸奶相結(jié)合，做出一款口感風(fēng)味極好、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的活菌型乳酸菌飲料，進(jìn)一步豐富發(fā)酵乳飲料的產(chǎn)品種類，滿足社會(huì)不同人群的需求，同時(shí)提高荷葉在食品中的利用率，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料、原料及試劑

伊利全脂乳粉、同仁堂荷葉茶、安琪酸奶發(fā)酵劑，均購(gòu)自京東商城；發(fā)酵乳，實(shí)驗(yàn)室自制；檸檬酸（食品級(jí)）、白砂糖（食品級(jí)），浙江一諾科技公司提供；黃原膠（食品級(jí)），河南萬(wàn)邦公司提供。

氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、鹽酸、氯化鈉、乙醇、溴甲酚綠指示劑、甲基紅指示劑、亞甲基藍(lán)指示劑、MC培養(yǎng)基以上試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

FA1004 型電子天平，天馬衡基儀器制造有限公司產(chǎn)品；LDZX-30KA 型立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；JM-L50；膠體磨，溫州市一州機(jī)械有限公司產(chǎn)品；VS-840-U 型超凈工作臺(tái)，江蘇益愷實(shí)驗(yàn)裝備有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 荷葉汁風(fēng)味發(fā)酵乳飲料加工基本工藝流程

乳粉復(fù)原→預(yù)熱→加糖→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→后熟→破乳→混合→均質(zhì)→灌裝→冷卻→成品。 ↑

水料水、黃原膠、荷葉汁、白砂糖、食鹽

1.3.2 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

根據(jù)試驗(yàn)技術(shù)路線，荷葉風(fēng)味發(fā)酵乳飲料分別進(jìn)行了單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以檸檬酸添加量、白砂糖添加量、水與酸奶液料比和食鹽添加量4 個(gè)變量為影響因素，感官評(píng)分為響應(yīng)值，根據(jù)Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行四因素三水平組合試驗(yàn)[13-16]。

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.3 荷葉汁發(fā)酵乳飲料感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)NY/T 898—2016 綠色食品含乳飲料文件為標(biāo)準(zhǔn)[17]，并結(jié)合荷葉風(fēng)味發(fā)酵乳飲料感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)給9 位經(jīng)驗(yàn)者提供發(fā)酵乳飲料并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，最后計(jì)算合計(jì)分?jǐn)?shù)，最終獲得9 人的平均分。

荷葉風(fēng)味乳飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 荷葉風(fēng)味乳飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.4 荷葉汁發(fā)酵乳飲料主要指標(biāo)檢驗(yàn)方法

（1） 感官指標(biāo)檢驗(yàn)方法。將適量樣品放入50 mL的燒杯中，在自然光下觀察結(jié)構(gòu)和顏色，聞味道，用溫水漱口，品嘗味道，每次品嘗4~10 mL。

（2） 理化指標(biāo)檢驗(yàn)方法。①蛋白質(zhì)指標(biāo)按照GB 5009.5—2016 凱氏定氮進(jìn)行測(cè)定[18]；②酸度指標(biāo)按照GB 5009.239—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測(cè)定進(jìn)行[19]。

（3） 微生物指標(biāo)檢驗(yàn)方法。乳酸菌指標(biāo)按照GB 4789.35—2016 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷葉汁發(fā)酵乳飲料配制指南優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比單因素試驗(yàn)

取600 mL 荷葉汁，向其中添加0.15%的檸檬酸，0.15%的黃原膠，8%的白砂糖和0.12%的食鹽，混勻，待冷卻。將酸奶和復(fù)配的料液比以1∶6，1∶5，1∶4，1∶3，1∶2 比例進(jìn)行復(fù)配。

料液比單因素試驗(yàn)見(jiàn)圖1。

圖1 料液比單因素試驗(yàn)

由圖1 可知，隨著酸奶料液比的增加，荷葉發(fā)酵乳飲料的感官評(píng)價(jià)先增加后降低，當(dāng)料液比達(dá)到1∶4 時(shí)獲得最高點(diǎn)。當(dāng)水量較少時(shí)，酸奶口味較濃，荷葉味寡淡，故評(píng)分較低；隨著酸奶和荷葉汁復(fù)配液的比例持續(xù)增加時(shí)，其得到感官評(píng)價(jià)下降了。因?yàn)楫?dāng)水量過(guò)多時(shí)，荷葉味較苦澀且味道比較濃，影響了感官評(píng)分。所以酸奶與水的料液比選擇為1∶4時(shí)口感風(fēng)味和組織狀態(tài)最佳。

2.1.2 檸檬酸對(duì)荷葉風(fēng)味乳飲料的影響

試驗(yàn)取600 mL 的荷葉汁，在其中添加0.15%的黃原膠，8%的白砂糖和0.12%的食鹽充分?jǐn)嚢杌靹?。酸奶與復(fù)配好的荷葉汁（荷葉汁、白砂糖、黃原膠）比為1 ∶4，分別選用了添加量0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%的檸檬酸，研究檸檬酸對(duì)荷葉發(fā)酵乳飲料品質(zhì)的影響。

檸檬酸對(duì)荷葉風(fēng)味發(fā)酵乳飲料的影響見(jiàn)圖2。

由圖2 可知，荷葉發(fā)酵乳飲料的感官評(píng)價(jià)根據(jù)檸檬酸添加量的增加而不同，當(dāng)達(dá)到0.15%時(shí)，得分最高。因?yàn)闄幟仕崽砑恿窟^(guò)低時(shí)，入口甜而后苦，酸甜比比例失調(diào)；當(dāng)檸檬酸添加過(guò)多時(shí)，入口酸而后轉(zhuǎn)為澀，甜味較少，口感不佳，所以當(dāng)檸檬酸添加量選擇為0.15%時(shí)口感風(fēng)味最佳。

圖2 檸檬酸對(duì)荷葉風(fēng)味發(fā)酵乳飲料的影響

2.1.3 二次添加白砂糖對(duì)荷葉汁發(fā)酵乳飲料的影響

二次添加白砂糖，可以改善荷葉汁發(fā)酵乳飲料的味道與口感。因此試驗(yàn)取600 mL 荷葉汁，向其中加入0.15%的檸檬酸，0.15 的黃原膠和0.12%的食鹽，酸奶與水的料液比為1∶4，再選擇不同白砂糖添加量6%，7%，8%，9%，10%，研究不同白砂糖添加量對(duì)荷葉汁發(fā)酵乳飲料的影響。

二次添加白砂糖對(duì)荷葉汁發(fā)酵乳飲料的影響見(jiàn)圖3。

圖3 二次添加白砂糖對(duì)荷葉汁發(fā)酵乳飲料的影響

由圖3 可知，荷葉風(fēng)味發(fā)酵乳飲料的感官評(píng)分隨著白砂糖添加量的增加而變化，其感官評(píng)分從低升高，當(dāng)達(dá)到8%時(shí)評(píng)分最高，因?yàn)槎翁砑影咨疤菧p少了荷葉中的苦味。評(píng)分逐漸降低，是因?yàn)楫?dāng)白砂糖添加過(guò)多時(shí)，白砂糖掩蓋了乳酸味，使得飲品過(guò)于甜，故評(píng)分較低，因此試驗(yàn)選擇白砂糖添加量為8%。

2.1.4 食鹽添加量對(duì)荷葉汁發(fā)酵乳飲料品質(zhì)的影響

食鹽可以有效減少荷葉中的苦澀感，適量的添加可以將口味達(dá)到最好，因此試驗(yàn)取荷葉汁600 mL向其中添加0.15%檸檬酸，0.15%的黃原膠，8%的白砂糖和酸奶與水料比為1∶4，選擇食鹽添加量分別為0.04%，0.08%，0.12%，0.16%，0.20%進(jìn)行試驗(yàn)。

食鹽對(duì)荷葉風(fēng)味發(fā)酵乳飲料的影響見(jiàn)圖4。

由圖4 可知，荷葉風(fēng)味發(fā)酵乳飲料的感官評(píng)分根據(jù)食鹽添加量的增加而變化，當(dāng)達(dá)到0.08%時(shí)，得分最高。因?yàn)槭雏}添加量過(guò)低時(shí)，荷葉中的苦澀感并沒(méi)有完全消除，或多或少可以嘗出苦澀感；而食鹽添加過(guò)多時(shí)，食鹽的咸味占據(jù)了飲料中絕大多數(shù)的滋味。所以，食鹽添加量過(guò)高時(shí)會(huì)影響梨果汁發(fā)酵乳飲料的口感，所以食鹽添加量選擇為0.08%時(shí)口感風(fēng)味最佳。

圖4 食鹽對(duì)荷葉風(fēng)味發(fā)酵乳飲料的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以檸檬酸添加量、白砂糖添加量、水與酸奶液料比和食鹽添加量4 個(gè)變量為影響因素，感官評(píng)分為響應(yīng)值，根據(jù)Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，對(duì)荷葉風(fēng)味發(fā)酵乳飲料工藝參數(shù)[21]進(jìn)行優(yōu)化。

Box-behnken 設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值見(jiàn)表3。

表3 Box-behnken 設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值

應(yīng)用Design Expert 8.0.6 軟件將表3 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，得到了4 個(gè)因素與感官評(píng)分之間的回歸方程如下：

為了更好地驗(yàn)證方程的有效性，對(duì)得出的數(shù)據(jù)模型進(jìn)行了方差分析。

回歸方程的方差分析見(jiàn)表4。

由表4 可知，模型的p<0.01，表現(xiàn)為極顯著水平。失擬項(xiàng)p=0.243 2，表現(xiàn)為不顯著，說(shuō)明回歸模型與實(shí)際情況吻合度高，試驗(yàn)誤差小，因此可采用此模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。模型中D、CD、B2、C2、D2的p值均小于0.01，有極顯著的水平，對(duì)感官評(píng)價(jià)得分有極顯著的影響。根據(jù)表4 中的數(shù)據(jù)可得出，在所選取的水平因素范圍內(nèi)，根據(jù)F值的大小，各因素對(duì)感官評(píng)分影響的程度順序?yàn)闄幟仕崽砑恿浚―） >料液比（C） >白砂糖添加量（B） >食鹽添加量（A）。

表4 回歸方程的方差分析

2.2.2 響應(yīng)面圖形分析

通過(guò)Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)回歸模型的分析，可以得到當(dāng)2 個(gè)因素為零水平時(shí)，其他2 個(gè)因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響效果。

食鹽添加量和白砂糖添加量對(duì)提取率影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖5，食鹽添加量和料液比對(duì)提取率影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖6，食鹽添加量和檸檬酸添加量對(duì)提取率影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖7，白砂糖添加量和料液比對(duì)提取率影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖8，白砂糖添加量和檸檬酸添加量對(duì)提取率影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖9，料液比和檸檬酸添加量對(duì)提取率影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖10。

圖5 食鹽添加量和白砂糖添加量對(duì)提取率影響的響應(yīng)面及等高線

圖6 食鹽添加量和料液比對(duì)提取率影響的響應(yīng)面及等高線

圖7 食鹽添加量和檸檬酸添加量對(duì)提取率影響的響應(yīng)面及等高線

圖8 白砂糖添加量和料液比對(duì)提取率影響的響應(yīng)面及等高線

圖9 白砂糖添加量和檸檬酸添加量對(duì)提取率影響的響應(yīng)面及等高線

由等高線可以看出，橢圓形的表示兩兩交互作用顯著，而圓形則相反，響應(yīng)面的坡度變化反映出各因素變化時(shí)，對(duì)響應(yīng)值的變化情況。由圖5 ~ 圖10 可知，檸檬酸添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分影響最大。

圖10 料液比和檸檬酸添加量對(duì)提取率影響的響應(yīng)面及等高線

2.2.3 配方參數(shù)優(yōu)化

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化分析得到荷葉汁發(fā)酵乳飲料的最佳配方為檸檬酸添加量0.048%，白砂糖添加量7.64%，料液比1∶4，食鹽添加量0.19%，感官評(píng)價(jià)理論值93.07，根據(jù)實(shí)際操作的可行性，最佳配方修正為，食鹽添加量為0.20%，白砂糖添加量8%，檸檬酸添加量0.04%，料液比1∶4，為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，采用以上工藝配方做3 次平行試驗(yàn)并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，此條件下制作的荷葉汁發(fā)酵乳飲料的感官評(píng)分為93.07±0.03 分，接近預(yù)測(cè)值93.37 分，說(shuō)明響應(yīng)面分析法對(duì)優(yōu)化荷葉汁發(fā)酵乳飲料的工藝條件是可行的。

2.3 優(yōu)化工藝的荷葉汁發(fā)酵乳飲料的指標(biāo)測(cè)定

參照含乳飲料產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，將試驗(yàn)最優(yōu)條件下得到的荷葉風(fēng)味發(fā)酵乳飲料成品的主要指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量。

荷葉汁發(fā)酵乳飲料產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照見(jiàn)表5。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化荷葉汁發(fā)酵乳飲料的制作工藝，得出最佳工藝條件為檸檬酸添加量0.04%，白砂糖添加量8%，料液比1∶4，食鹽添加量0.20%，黃原膠添加量0.15%，此時(shí)感官評(píng)分最高為93.07 分。4 個(gè)因素對(duì)荷葉汁發(fā)酵乳飲料的影響順序?yàn)闄幟仕崽砑恿浚―） >料液比（C） >白砂糖添加量（B） >食鹽添加量（A）。按此配方生產(chǎn)的荷葉汁乳飲料顏色為淺黃色，色澤均勻、味道醇厚，具有荷葉清香味和奶香味，其主要檢驗(yàn)指標(biāo)均達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，為進(jìn)一步市場(chǎng)化開(kāi)發(fā)奠定了較好的研究基礎(chǔ)。