白陽，曾歡，陶寧萍,2*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)

銀鯽(Carassiusauratusgibelio)屬于鯽的近緣亞種，喜好以水草、藻類、小蝦等為食，屬于雜食性淡水魚[1]，肉質(zhì)細(xì)嫩，營養(yǎng)價值豐富，具有高蛋白低脂肪的特點[2]。自古以來就享有“魚之美者，洞庭之鮒”的美譽[3]。但是，銀鯽喜好棲息在泥塘底層靠近水草、海藻的水域，體內(nèi)酶系活躍，生命活動旺盛，致使其存在典型的魚腥味、土霉味[3]，不被消費者接受，從而影響其深加工和經(jīng)濟價值。

水產(chǎn)品的腥味會極大影響消費者的可接受度，嚴(yán)重威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的拓展和未來發(fā)展前景[4-5]。腥味物質(zhì)種類繁多，組成復(fù)雜。腥味物質(zhì)可由水環(huán)境中積累[6]、魚體內(nèi)脂類氧化或酶促反應(yīng)形成[7]。JENSE等[8]曾報道，辛醛、癸醛和2,4-癸二烯醛等羰基化合物是造成鮭魚肉腥味的重要原因。己醛、(Z)-4-庚烯醛和其他低分子質(zhì)量醛、醇、酮以及少量呋喃、硫醚和萘等都對腥味有貢獻[9]。

土腥味是淡水養(yǎng)殖中最嚴(yán)重的異味問題。目前認(rèn)為淡水養(yǎng)殖環(huán)境中能產(chǎn)生土腥味的物質(zhì)主要包括2,4,6-三氯代茴香醚(2,4, 6-trichloroanisole，TCA)、2-異丁基-3-甲氧基吡嗪(2-isobutyl-3-methoxypyrazine，IBMP)、2-異丙基-3-甲氧基吡嗪(2-isopropyl 3-methoxypyrazine，IPMP)、土臭素(geosmin，GSM)、2-甲基異莰醇(2-methyl isobenol，2-MIB)等[10-11]。其中，JENSE等[8]認(rèn)為GSM和2-MIB是構(gòu)成土腥味的關(guān)鍵化合物，前一種有泥土味，而后一種則帶有霉味[12]。GSM和2-MIB都屬于烯萜醇類化合物，具有親脂性，半揮發(fā)性，微溶于水，它們在水環(huán)境中的嗅聞閾值分別為0.015、0.035 μg/L[8]。這2種土腥味物質(zhì)由藍藻菌、放線菌和某些真菌代謝產(chǎn)生隨后被排泄到水環(huán)境中，通常情況下，魚很容易通過鰓吸收這些異味化合物，然后通過血液運輸，最后囤積在富含脂質(zhì)的組織器官中[13]。GSM和2-MIB的閾值很低，在魚肉中的嗅覺閾值分別為0.6、0.9 μg/kg[14]，因此相較于其他腥味物質(zhì)更難檢測。前人[13]采用固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(solid phase microextraction combined with gas chromatography/mass spectrometry，SPME-GC-MS)鑒定出鯽魚肉中的魚腥味物質(zhì)，包括己醛、1-戊烯-3-酮、1-戊烯-3-醇、1-辛烯-3-醇，采用微波蒸餾-固相微萃取-氣相色/質(zhì)譜聯(lián)用(microwave distillation-solid phase microextraction-gas phase color/mass spectrometry，MAD-SPME-GC-MS)僅檢測出鯽魚體內(nèi)的2-MIB。

近年來檢測腥味物質(zhì)的主要方法有：感官評價法、電子鼻法、頂空-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-嗅聞測量法、氣相色譜-離子遷移譜法等。劉安軍等[15]采用CG-MS分別對鯉魚皮、血、肌肉的腥味進行檢測，共發(fā)現(xiàn)8種重合的物質(zhì)；章超樺等[16]采用GC-MS檢測鯽魚皮、內(nèi)臟、肌肉3部分的腥味物質(zhì)，結(jié)果表明內(nèi)臟腥味最強，其中己醛為魚體的特征腥味物質(zhì)。已有研究主要集中于魚類不同部位腥味物質(zhì)的共同點，鮮有對差異的詳細(xì)分析；同時內(nèi)臟、血等很少作為食用部位，前人也未對不同部位的肌肉進行細(xì)分。

本研究采用固相萃取整體捕集-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(solid phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry，MMSE-GC-MS)分析比較銀鯽魚皮、腹部肌肉、背部肌肉、尾部肌肉的魚腥味和土腥味物質(zhì)囤積情況，對4個部位腥味物質(zhì)差異情況和原因進行較為詳細(xì)的敘述，同時使用微波蒸餾-固相微萃取-氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(microwave distillation-solid-phase microextraction-gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry，MAD-SPME-GC-TOFMS)、固相微萃取-全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(solid-phase microextraction coupled with full two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry，SPME-GC×GC-TOFMS)測定魚肉腥味物質(zhì)的含量，比較不同檢測方法之間的異同，為探究魚體不同部位土腥味物質(zhì)分布規(guī)律提供理論支撐，為研究脫腥效果和機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

銀鯽，購自上海榮真水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社。銀鯽捕撈上岸裝于放有冰袋的泡沫箱中，2 h內(nèi)運回實驗室。隨機抽取6條健康鮮活的銀鯽，測定其生物學(xué)指數(shù)，見表1。急殺、去頭及內(nèi)臟，分背、腹、尾、皮4個部位取樣。冰浴條件下?lián)v碎混勻，分裝于自封袋中，于-80 ℃冰箱中貯藏待用。

表1 銀鯽生物學(xué)指數(shù)(濕重)Table 1 Biochemical indicator C. auratus gibelio

1.2 試劑與儀器

主要試劑：C7～C30正構(gòu)烷烴標(biāo)品，Sigma-Aldrich公司；土臭素和2-甲基異莰醇混標(biāo)，美國Supelco公司；2,4,6-三甲基吡啶(純度>98.0%)，東京化成株式會社。

主要儀器：Mono-Trap RCC18固相萃取整體捕集劑 (2.9 mm×5 mm×1 mm)，日本GL sciences公司；萃取頭2 cm, 50/30 μm DVB/CAR on PDMS SPME，美國Supelco公司；7890-5977A氣質(zhì)聯(lián)用儀、7890B-5977B氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀、890-PEGSUS 4D全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 MMSE-GC-MS檢測

采用固相萃取整體捕集技術(shù)結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測銀鯽不同部位揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，參考張晶晶等[17]的方法，稱取5.00 g樣品于頂空瓶，加入5 mL 0.18 g/mL NaCl溶液，均質(zhì)后，取5個吸附子固定在頂空瓶上方，50 ℃水浴條件下萃取45 min，將吸附子裝入襯管中進行GC-MS分析。

色譜條件：DB-5MS色譜柱(60 m×0.32 mm×1 μm)。程序升溫：40 ℃保持1 min；5 ℃/min升至100 ℃；3 ℃/min升至180 ℃;5 ℃/min升至220 ℃；7 ℃/min升至240 ℃，保持5 min。不分流進樣。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；接口溫度280 ℃。

定性方法：與NIST2008譜庫比對，僅報道正反匹配度均大于800的化合物。

相對氣味活度值(relative odor activity value，ROAV)是對腥味物質(zhì)的含量以及閾值綜合評估計算所得，能夠更高效合理地確定各化合物對樣品總體風(fēng)味的貢獻[18]。規(guī)定樣品中氣味貢獻最大的組分ROAVmax=100，其他揮發(fā)性風(fēng)味成分的ROAV按公式(1)計算：一般認(rèn)為0.1≤ROAV≤1的對整體風(fēng)味有修飾作用，ROAV>1的為特征性風(fēng)味化合物。

(1)

式中，Ci，各物質(zhì)的相對含量，%；Ti，各物質(zhì)的閾值，μg/kg；Cmax，對整體氣味貢獻最大組分的相對含量，%；Tmax，對整體氣味貢獻最大組分的感覺閾值，μg/kg。

1.3.2 全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜檢測

SPME萃?。簻?zhǔn)確稱取5.00 g樣品于頂空瓶中，采用2 cm DVB/CAR/PDMS萃取頭頂空吸附樣品。50 ℃下平衡10 min，萃取45 min。按照設(shè)定參數(shù)進行GC×GC-TOFMS分析。

GC×GC-TOFMS條件：第一維柱為DB-5MS非極性柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；進樣溫度250 ℃；升溫程序：初溫40 ℃保留3 min，以3 ℃/min升至160 ℃，再以5 ℃/min升至220 ℃，最后以10 ℃/min升至240 ℃，保留3 min。進樣口采用分流進樣模式，分流比5∶1。第二維柱為DB-17MS中等極性柱(2 m×100 μm×0.10 μm)，柱溫比第一維柱高15 ℃，調(diào)制解調(diào)器溫度比第二維柱高15 ℃，全二維分析時調(diào)制周期4.0 s。質(zhì)譜條件：檢測器接口溫度290 ℃；離子源溫度230 ℃；電子轟擊源70 eV；檢測器1 710 v；采集率50張/s；質(zhì)譜掃描范圍m/z20～450。

數(shù)據(jù)處理：原始數(shù)據(jù)由Chroma TOF軟件處理，峰提取(信噪比S/N>50)、峰積分、解卷積、峰對齊等操作后與NIST14和Wiley9譜庫檢索比對，生成臨時鑒定化合物列表，再根據(jù)“惰性柱按沸點大小出峰，極性柱按極性大小出峰”的基本原則，對上述初步比對結(jié)果進行人工篩選，參考ZHU等[19]選擇正反匹配度均大于800的化合物。

定量方法：將內(nèi)標(biāo)三羥甲基丙烷(trimethylolpropane,TMP)用甲醇稀釋至10 mg/L，迅速將10 μL 10 mg/L的TMP加入到5.00 g均質(zhì)魚樣品基質(zhì)中進行頂空萃取。本研究中，假定校準(zhǔn)因子均為1.00，每種揮發(fā)性化合物的估計質(zhì)量分?jǐn)?shù)按公式(2)計算：

(2)

式中：CX，各揮發(fā)性化合物的濃度，ng/g；AX，各揮發(fā)性化合物的峰面積；AS，TMP的峰面積；mS代表TMP的質(zhì)量，ng；m0，魚肉的質(zhì)量，g。

關(guān)鍵風(fēng)味成分的確定：采用氣味活度值法(odor activity value method，OAV)，通過各組分濃度(Cx)與其氣味閾值(odor thresholds，OTx)之比計算得到，計算方法如公式(3)。一般認(rèn)為，OAV≥1時，該物質(zhì)為特征性風(fēng)味化合物[20]。

(3)

1.3.3 土臭素和2-甲基異莰醇含量的測定

采用微波蒸餾裝置，提取銀鯽腹肌和背肌中的GSM和2-MIB。前處理及微波參數(shù)參照張凱[21]的方法略作修改，取5 g碎肉，添加50 mL 200 g/L NaCl溶液，充分混勻，加入沸石。微波爐參數(shù)設(shè)置為560 W、5 min，異味組分氣化后由N2帶出，冷凝管冷凝后，收集微波蒸餾液(圖1)。

圖1 微波蒸餾裝置簡圖Fig.1 Diagram of microwave-assisted distillation device

頂空固相微萃取條件：吸取5 mL上述收集的餾分于頂空瓶中。采用2 cm DVB/CAR/PDMS SPME萃取頭，50 ℃下孵育15 min，萃取40 min。按照設(shè)定參數(shù)進行GC-MS分析。

GC-TOFMS條件：色譜柱DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm)；不分流進樣。升溫程序：初溫60 ℃保留2.5 min，8 ℃/min升至250 ℃，保留5 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃；電子轟擊電壓70 eV；質(zhì)譜掃描范圍m/z20～400。采用選擇性離子掃描模式(selective ion scanning mode，SIM)對GSM和2-MIB進行監(jiān)測，確定其定量特征性離子質(zhì)荷比(m/z)分別為95和112。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：用色譜級甲醇逐級稀釋GSM和2-MIB混標(biāo)(100 μg/mL)。橫坐標(biāo)為目標(biāo)物濃度，縱坐標(biāo)為定量離子峰面積，繪制標(biāo)曲。

1.4 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。SPSS 23.0分析顯著性差異，不同的字母表示有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。Origin 2018用于處理和生成圖像。采用Alphasoft V12.44軟件進行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀鯽不同部位揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

采用MMSE-GC-MS分析發(fā)現(xiàn)銀鯽的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要為醛類、醇類、酮類、芳香族化合物、烴類、呋喃類。由表2可知，銀鯽背部、腹部、尾部和魚皮分別檢測出31、34、42、29種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

表2 銀鯽不同部位揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類Table 2 Types of volatile components in different parts of C. auratus gibelio by MMSE-GC-MS

其中尾部鑒定出了最高的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量，其原因可能是尾部為紅色肉，更易富集揮發(fā)性物質(zhì)。據(jù)報道，在新鮮淡水魚中發(fā)現(xiàn)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要由羰基化合物和醇類組成[22]。GC-MS結(jié)果如表3所示，本研究中羰基化合物和醇類化合物在銀鯽肌肉中的占比約為70%，其中，背部、腹部、尾部的占比分別為70.83%、69.96%、69.17%，而魚皮中僅占51.39%。分析其原因，可能是魚體內(nèi)風(fēng)味物質(zhì)主要是通過從水環(huán)境和食物中攝入，再經(jīng)體內(nèi)代謝富集，而魚皮中參與體內(nèi)物質(zhì)代謝的酶等物質(zhì)含量少，因此富集的風(fēng)味物質(zhì)相對較少。

表3 銀鯽不同部位主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)MMSE-GC-MS分析結(jié)果Table 3 Results of MMSE-GC-MS analysis of volatile flavor compounds in different parts of C. auratus gibelio

醛類化合物作為肉制品中重要的揮發(fā)性化合物，其來源和對食品氣味的貢獻已得到廣泛研究[23]。由于醛類化合物相較于醇類、酮類的氣味閾值更低，因此具有強烈特征性氣味，并對樣品整體氣味輪廓產(chǎn)生決定性影響。據(jù)報道，C3～C4的醛類化合物具有強烈的刺激氣味；C5～C9的醛類化合物具有青草味；C10～C12的醛類化合物具有愉快的柑橘味、香甜味[24]。如圖2所示，本研究在銀鯽背部、腹部、尾部和魚皮中分別檢測出9、9、11和7種醛類化合物，腹部和魚皮醛類化合物含量最高，均顯著高于背部和尾部，其中己醛、辛醛、壬醛、癸醛是背部、腹部、魚皮和尾部共有的特征揮發(fā)性化合物。上述醛類活性化合物在許多魚類中都被報道過[25-27]，并被認(rèn)為是脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物[28]。己醛可通過n-9單不飽和脂肪酸，如亞油酸氧化產(chǎn)生[25]，該物質(zhì)在銀鯽不同部位都被大量檢出，與章超樺等[16]研究鯽中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)果具有較好的一致性，說明己醛是鯽魚體內(nèi)典型的腥味物質(zhì)。從圖3可以看出，銀鯽腹部的己醛含量最多，顯著高于其余部位，背部中含量次之，魚皮中含量最少。銀鯽體內(nèi)檢出的其他重要醛類化合物，如辛醛、壬醛和癸醛可由n-9單不飽和脂肪酸，如油酸氧化形成[8]，它們一般具有“青草味、脂肪味”，也是重要的腥味物質(zhì)。此外，辛醛、壬醛和癸醛在魚皮中的含量顯著高于其他部位，可能與魚皮中的脂肪含量較高有關(guān)。(E)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛可通過n-6不飽和脂肪酸，如亞油酸、花生四烯酸氧化產(chǎn)生[29]，具有“魚腥味、油脂味”的氣味特征，在銀鯽背部、尾部、魚皮均有檢出，對其背部和魚皮整體氣味起修飾作用，而對尾部整體風(fēng)味貢獻大。(E,E)-2,4-庚二烯醛由n-3不飽和脂肪酸，如亞麻酸、二十碳五烯酸氧化生成，具有“青草味、脂肪味”，對腥味起增強作用。(E,E)-2,4-庚二烯醛未在魚皮中檢出，其在背部和尾部中的含量顯著高于腹部，并對背部和尾部風(fēng)味有影響。

圖2 銀鯽不同部位揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量Fig.2 Total areas of the volatile components in different parts of C. auratus gibelio

圖3 銀鯽不同部位腥味物質(zhì)含量Fig.3 Peak areas of fishy off-odors in different parts of C. auratus gibelio

醇類是由脂肪酸的氫過氧化物分解產(chǎn)生的次級產(chǎn)物[30]，其在銀鯽背部、腹部和尾部大量檢出，相對百分含量分別為47.07%、37.23%、40.91%，魚皮中的醇類化合物僅為17.16%。銀鯽體內(nèi)一共檢出了9種醇類，包括6種不飽和醇和3種飽和醇。不飽和醇的閾值普遍低于飽和醇，對魚肉的整體氣味影響較大。據(jù)報道，1-辛烯-3-醇是由n-6不飽和脂肪酸被12-脂氧合酶(12-lipoxygenase,12-LOX)氧化形成的[31]，具有青草、泥土和蘑菇的氣味特征[32]，氣味閾值很低(1.5 μg/L)，是導(dǎo)致魚體異味的重要因素。1-辛烯-3-醇還能作為脂質(zhì)氧化的標(biāo)志物，IGLESIAS等[25]利用HS-SPME-GC-MS監(jiān)測大西洋馬鮫魚肌肉氧化過程中揮發(fā)性化合物的變化發(fā)現(xiàn)，1-辛烯-3-醇的含量與過氧化值(peroxide value,POV)、硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid value,TBARS)等與魚脂氧化有關(guān)的化學(xué)指標(biāo)高度相關(guān)。水產(chǎn)品風(fēng)味研究中也經(jīng)常報道1-辛烯-3醇的存在，尤其是在鮭科魚類中。本研究中也被大量檢出(6%～8%)，并對銀鯽整體風(fēng)味貢獻較大。本研究檢測到的另一種對腥味有貢獻的醇類化合物是1-戊烯-3-醇，它被認(rèn)為是多不飽和脂肪酸最典型的氧化標(biāo)志產(chǎn)物之一[33]，該物質(zhì)在魚類風(fēng)味的研究中廣泛存在[25, 34]。但因其閾值較高(358.1 μg/L)，對銀鯽整體風(fēng)味貢獻程度較小。庚醇是本研究中發(fā)現(xiàn)的又一種重要的醇類化合物，僅在銀鯽尾部檢測到，它有助于產(chǎn)生青草味、發(fā)酵味、堅果味，可能衍生于n-9單不飽和脂肪酸，如油酸[31]。

酮類可能由脂質(zhì)氧化、氨基酸降解或微生物作用形成[28]。本研究共檢測出了6種酮類物質(zhì)，其中屬于特征性氣味的酮類化合物為2,3-戊二酮和1-戊烯-3-酮。2,3-戊二酮有助于產(chǎn)生“黃油味、焦糖味和水果味”，僅在銀鯽腹部和尾部被檢測到，并在大菱鲆[35]及虹鱒魚[36]等多種魚類中都能檢測到。張晶晶[37]在探究白姑魚和小黃魚氣味差異時，通過MMSE-GC-MS-O鑒定出了6-甲基-5-庚烯-2-酮，結(jié)合嗅聞確定該化合物金屬味和血腥味的氣味屬性，對腥味貢獻大。本研究在銀鯽尾部和魚皮中也鑒定出了該物質(zhì)，但由于含量少，對整體氣味影響不大。

本研究共檢測出13種芳香族化合物和7種碳?xì)浠衔?。然而這2類化合物中沒有屬于氣味活性的物質(zhì)，因為它們的閾值很高，對整體氣味輪廓貢獻小。萘的氣味閾值很低(6 μg/L)，呈現(xiàn)樟腦味，有研究表明，萘能和其他典型腥味物質(zhì)一起加強異味[12]。在本實驗中，銀鯽的各個部位均檢測到了萘的存在，對整體氣味起修飾作用。芳香族化合物可能來源于魚類的新陳代謝或環(huán)境污染[28]。銀鯽背部、腹部、尾部和魚皮檢測出的含量分別為24.79%、24.17%、18.62%和40.73%，魚皮中的芳香族化合物含量顯著高于其余部位。造成這種現(xiàn)象的原因可能是與皮膚長期直接接觸養(yǎng)殖環(huán)境中的污染物有關(guān)。碳?xì)浠衔锟赡苁侵|(zhì)自動氧化生成或類胡蘿卜素分解產(chǎn)生[28]。1,3-辛二烯有著腐敗味、霉味的氣味特征，因為閾值較高，對整體風(fēng)味貢獻程度較小。

銀鯽魚皮和尾部檢測出2-乙基呋喃和2-戊基呋喃這2種呋喃類物質(zhì)，它們也存在于馬鮫魚[25]、白姑魚[38]等魚類中。2-乙基呋喃來自于n-3不飽和脂肪酸的氧化作用[28]，具有橡膠味、刺激性的氣味特征，對腥味有貢獻。呋喃類物質(zhì)具有較強的揮發(fā)性和親脂性，吸收進入魚體后在細(xì)胞色素p-450酶的作用下迅速代謝，主要在肝臟和腎臟中累積[39]。魚皮脂肪含量遠高于其他3個部位，而尾部肉為紅肉，細(xì)胞色素p-450酶含量較其他部位含量高，因此僅在皮和尾檢測到呋喃類物質(zhì)。

風(fēng)味是影響魚類及其制品食用品質(zhì)的重要因素。異味，如泥土味，會使魚類及其制品變得不易接受[40]。如圖3所示，本研究共檢出了11種腥味物質(zhì)。從相對氣味活度值方面來看，除被定義為ROAVmax=100的癸醛外，對整體風(fēng)味貢獻大的腥味物質(zhì)為：己醛、辛醛、壬醛和1-辛烯-3-醇。己醛和1-辛烯-3-醇是含有肌紅蛋白的漂洗魚糜中的主要揮發(fā)性化合物，增強了腥味和腐臭味[41]。近年來，LIU等[42]和ROBERTSON等[14]一致認(rèn)為，己醛和1-辛烯-3-醇與2-MIB之間存在潛在的協(xié)同作用，可將己醛、1-辛烯-3-醇與淡水魚類的泥土味聯(lián)系起來。本研究在銀鯽體內(nèi)檢測到了高含量的己醛、1-辛烯-3-醇，腹部含量尤其高。采用MMSE-GC-MS并未檢測到銀鯽體內(nèi)的典型泥土味物質(zhì)GSM和2-MIB，原因可能并不是因為完全沒有這些物質(zhì)，而是因為相關(guān)物質(zhì)痕量存在且與魚肉結(jié)合緊密。

2.2 全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜分析

全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜可以通過調(diào)制器將一維色譜柱中的餾分聚焦，以脈沖的形式送到第二根色譜柱上進一步分離，因而具有峰容量大、分辨率高和靈敏度高[43]等優(yōu)勢，目前已經(jīng)用于多組分復(fù)雜樣品分析領(lǐng)域，如白酒[44]、石油[45]等。

采用SPME-GC×GC-TOFMS分析銀鯽腹肌中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，共檢測出約1 600個物質(zhì)峰，總離子流色譜圖和三維色譜如圖4所示。

a-一維;b-三維圖4 SPME-GC×GC-TOFMS總離子流色譜圖Fig.4 Total ion flow chromatogram of SPME-GC×GC-TOFMS

經(jīng)過比對相似度、可能性并剔除雜質(zhì)峰，共鑒定出101種有效揮發(fā)性化合物。采用相對氣味活度值來評估對整體氣味有貢獻的揮發(fā)性化合物。根據(jù)測得的揮發(fā)性有機化合物，從所有101種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中選出了16種氣味活性化合物，由此認(rèn)為它們是銀鯽腹肌氣味的主要來源。16種氣味活性化合物是：乙酸乙酯、正己醇、2,3-戊二酮、1-辛烯-3-酮、2-乙基呋喃、2-戊基呋喃、反式-2-壬烯醛、己醛、庚醛、(Z)-4-庚烯醛、(Z)-4-癸烯醛、庚醇、辛醛、壬醛、癸醛和1-辛烯-3-醇。OAV越大對整體風(fēng)味的貢獻程度越大，在這些特征性氣味化合物中，1-辛烯-3-酮、(Z)-4-癸烯醛和(Z)-4-庚烯醛等對整體風(fēng)味具有決定性的影響。

對比分析可知，GC-MS檢測出的物質(zhì)絕大多數(shù)都能被GC×GC-TOFMS檢測到。與GC-MS相比，GC×GC-TOFMS鑒定出更多的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，同時也能檢測出更多的腥味物質(zhì)如表4所示，如庚醛、(Z)-4-庚烯醛、(E)-2-壬烯醛、(Z)-4-癸烯醛、2-庚酮、6-甲基-2-庚酮和(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮等。其中，庚醛、(Z)-4-庚烯醛、(E)-2-壬烯醛和(Z)-4-癸烯醛屬于特征性腥味物質(zhì)。因此，全二維氣相色譜技術(shù)在風(fēng)味分析或腥味分析上具有很好的應(yīng)用前景。

另外，全二維還能鑒定出更多的同分異構(gòu)體，如(Z)-2-庚烯醛和(Z)-4-庚烯醛、1-辛烯和2-辛烯、1,2-二甲苯和1,3-二甲苯，這些物質(zhì)沸點和極性相似，在GC-MS分析中容易出現(xiàn)色譜峰重疊現(xiàn)象，而GC×GC-TOFMS通過內(nèi)部多種不同的分離機制很容易將這些物質(zhì)分離開[46]，提高了分離能力和定性準(zhǔn)確度。

表4 GC×GC-TOFMS和GC-MS鑒定銀鯽揮發(fā)性 風(fēng)味物質(zhì)種類的比較Table 4 Comparison of the volatile components in C. auratus gibelio identified by GC×GC-TOFMS and GC-MS

2.3 銀鯽魚肉泥土味物質(zhì)含量的測定

由表5可知，GSM和2-MIB分別在0.1～10 μg/kg和0.02～4 μg/kg線性關(guān)系較好，且R2分別為0.998 1和0.997 5。根據(jù)得到的線性方程，將峰面積轉(zhuǎn)換為濃度，計算出銀鯽腹肌和背肌的泥土味物質(zhì)GSM和2-MIB的含量。

表5 土臭素和二甲基異莰醇標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 5 Standard curvilinear equation of GSM and 2-MIB

如圖5所示，GSM含量高于2-MIB。GSM在腹肌和背肌含量分別為 (6.21±0.80)、(2.07±0.03)μg/kg，2-MIB在腹肌和背肌含量分別為(2.32±0.33)、(0.53±0.06)μg/kg。GSM和2-MIB在腹部中積累的含量顯著高于背部。原因可能是銀鯽腹肌脂肪含量顯著高于背肌，GSM和2-MIB具有親脂性，脂肪含量高的部位泥土味物質(zhì)含量也高。YARNPAKDEE等[47]在比較研究尼羅河羅非魚和寬頭鯰魚不同部位泥土味物質(zhì)差異時發(fā)現(xiàn)腹部脂肪和磷脂含量較高，GSM和2-MIB含量也較高。

圖5 銀鯽不同部位土臭素和2-甲基異莰醇的含量Fig.5 Contents of GSM and 2-MIB in different parts of C. auratus gibelio注：不同大寫字母表示GSM含量在銀鯽不同部位差異 顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示2-MIB含量在 銀鯽不同部位差異顯著(P<0.05)

土霉味是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中最嚴(yán)重的異味問題[48]。魚體一旦吸附了GSM和2-MIB后，通常會因其獨特的土霉味難以售出。有研究表明，當(dāng)養(yǎng)殖系統(tǒng)水環(huán)境中的GSM和2-MIB的濃度分別達到0.015和0.018 μg/L[2]，就會使魚體帶有泥土味。消費者對于魚肉中土臭素和2-甲基異莰醇的最高可接受濃度約為0.7 μg/kg[13]，超過此濃度的魚被視為不可銷售。除了銀鯽背肌中的2-MIB含量，其余GSM和2-MIB含量遠超0.7 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)，因此有必要對銀鯽探究有效的脫腥技術(shù)。

通過對3種風(fēng)味物質(zhì)檢測方法的比較發(fā)現(xiàn)，全二維氣相色譜比一維氣相色譜檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)更多，效果更好，但未檢測出2種典型的土腥味物質(zhì)。結(jié)合大量前人研究以及對本實驗過程的深入分析發(fā)現(xiàn)，典型土腥味物質(zhì)不能與其他風(fēng)味物質(zhì)一同檢出的2個重要原因可能是：(1)固相萃取時萃取頭的材質(zhì)，不同的材質(zhì)對不同的揮發(fā)性物質(zhì)吸附效果有所不同；(2)樣品進行GC-MS分析時的進樣方式，應(yīng)選擇不分流進樣，以保證更多種類的揮發(fā)性物質(zhì)進入氣相進行檢測。

3 結(jié)論

銀鯽不同部位共有的ROAV≥1的特征性腥味物質(zhì)主要有己醛、辛醛、壬醛、癸醛和1-辛烯-3-醇。(E)-2-辛烯醛對銀鯽背部、腹部和魚皮的風(fēng)味起修飾作用(0.1≤ROAV≤1)，其對尾部整體風(fēng)味貢獻大(ROAV≥1)。(E,E)-2,4-庚二烯醛僅在魚皮中未檢出，在背部和尾部中的含量顯著高于腹部，并對背部和尾部風(fēng)味起修飾作用(0.1≤ROAV≤1)。2-乙基呋喃僅在尾部中檢測出，并對尾部風(fēng)味貢獻大(ROAV≥1)。GSM和2-MIB在銀鯽背部和腹部均檢出，在腹部中的含量顯著高于背部(P<0.05)，GSM和2-MIB具有親脂性，易在脂肪含量高的部位囤積。比較3種風(fēng)味物質(zhì)測定方法可知，微波蒸餾前處理可以更有效地富集揮發(fā)性物質(zhì)，不需要全二維氣相色譜的輔助，只需一維氣相色譜就能檢測出含量低且難檢測的土腥味物質(zhì)。此研究結(jié)果為更高效更全面的測定風(fēng)味物質(zhì)，尤其是土腥味物質(zhì)提供新思路；為提升脫腥效果提供理論支持，有助于水產(chǎn)工業(yè)更高效地發(fā)展。