雷敏 胡麗麗 艾明

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的眼部并發(fā)癥，已成為全球主要的致盲原因之一[1]。DR按疾病進程分為非增殖性DR（non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR）和增殖性DR（proliferative diabetic retinopathy，PDR）兩個階段[2]。2021年國際糖尿病聯合會糖尿病流行病學報告指出，近50多年來全球糖尿病的患病率呈持續(xù)上升趨勢，預計到2030年將上升至10.2%[3]?！吨袊夏晏悄虿≡\療指南》（2021年版）指出，2019年中國65歲以上糖尿病患者數約3 550萬，居世界首位，占全球老年糖尿病患者的1/4[4]。研究顯示，視網膜屏障的破壞、視網膜新生血管形成及視網膜神經退行性病變在DR進展中發(fā)揮著重要作用，其發(fā)病機制涉及多種調控機制和通路[5]。近年來，臨床針對DR的治療主要有抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）藥物和皮質類固醇藥物的玻璃體腔內注射、視網膜激光光凝和后入路玻璃體切除手術[6]，但仍然存在部分患者治療效果不佳及視力預后不理想的情況。研究已證實，在DR發(fā)展早期，促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）具有明顯的血管神經保護作用[7]，PDR患者血清中EPO水平明顯升高，且EPO水平與PDR臨床分期呈正相關[8-9]。本文就EPO相關通路在DR中的發(fā)病作用機制研究進展作一綜述。

1 EPO及其與DR的關系

EPO是一種由4個α螺旋束組成的糖基化細胞因子，屬于集落刺激因子。胚胎期由胎兒肝臟產生，出生后主要由腎臟產生[10]。EPO在人體組織中廣泛分布，對心臟、胃腸道、肌肉、腎臟、胰腺和神經組織等有直接影響，可靶向作用紅細胞、類紅細胞及其祖細胞、腫瘤細胞、免疫細胞、內皮細胞和骨髓基質細胞等[11]。EPO是一把雙刃劍，近年來研究發(fā)現，生理狀態(tài)下EPO對視網膜神經元、微血管內皮細胞、視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞和Mller細胞具有保護功能[12]。EPO通過與EPO受體（erythropoietin receptor，EPOR）的相互結合發(fā)揮作用，有研究表明EPOR在PDR患者玻璃體中的表達水平越高預后越差，故EPOR有望作為PDR的預后生物標志物和潛在的治療靶點[13-14]。

研究發(fā)現EPO既參與視網膜的生理性血管生成，又參與病理性血管生成[11]。研究已證實，在DR發(fā)展早期，EPO具有明顯的血管神經保護作用[7]。Wang等[15]發(fā)現，EPO通過抑制甲基乙二醛的形成來降低血管生成素2（angiogenin-2，Ang-2）的表達，從而減少視網膜周細胞的絲氨酸-蘇氨酸激酶磷酸化，進而抑制周細胞遷移和凋亡，預防DR早期微血管損傷，在DR早期發(fā)揮保護作用。Gu等[16]發(fā)現EPO主要通過維持谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)相關蛋白的正常表達，抑制高糖條件下凋亡誘導因子易位和聚腺苷-核糖聚合物形成，下調谷氨酸受體，抑制視網膜神經元過度興奮和神經元毒性，減少神經元細胞死亡，來實現其神經保護作用。Bretz等[17]發(fā)現EPOR基因敲除小鼠視網膜的內層和外層網狀層更薄，異位神經突起和b波更低，進一步證實了EPO的血管神經保護作用。另外研究顯示，生理狀態(tài)下玻璃體中EPO水平是血漿中的3.5倍，DR患者玻璃體EPO水平比血漿高30倍，比非糖尿病患者玻璃體內EPO高10倍[18]。PDR患者血清中EPO水平明顯升高，且EPO水平與PDR臨床分期呈正相關[8-9]。有學者提出，EPO具有類似于VEGF的促血管形成活性，能夠刺激內皮細胞增殖、遷移和血管生成[19-20]。進一步證實，PDR患者玻璃體中EPO與VEGF明顯增高，兩者具有并聯協調作用，它們呈正函數相關[20]，提示EPO可加劇PDR視網膜缺血和新生血管生成，從而加速PDR的進展。

2 EPO對NPDR患者視網膜的保護作用機制

2.1 磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）信號通路PI3K/Akt信號通路可調節(jié)血管生成因子、促炎因子的表達及相關細胞的功能，參與多種酶生物學效應，介導正常血管及病理性血管的形成[21]。Liu等[22]研究發(fā)現，DR患者中血-視網膜內屏障（inner blood-retinal barrier，iBRB）完整性的破壞是通過VEGF/血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR2）/絡氨酸蛋白激酶（sarcoma，Src）信號通路磷酸化水平增加，導致血管內皮鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）表達的降低誘導的，EPO可通過抑制VEGF/VEGFR2/Src信號通路，促進DR大鼠VE-cadherin的表達從而維持視網膜的屏障功能，發(fā)揮DR早期血管保護作用。Xie等[12]發(fā)現，DR大鼠視網膜中激活的小膠質細胞吞噬內皮細胞，導致脫細胞毛細血管形成，引起血管滲漏，而EPO可以提高Src/Akt/肌動蛋白素（cofilin）信號通路相關分子 Src、Akt、cofilin的磷酸化比例，抑制小膠質細胞吞噬功能，從而保護iBRB，抑制血管滲漏。先前研究已證實缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）作為PI3K/Akt信號通路的關鍵下游蛋白，通過誘導下游蛋白質EPO的表達來阻止高糖環(huán)境下血-視網膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）的破壞，同時促進營養(yǎng)物質和氧氣轉運，從而保護細胞免受缺氧損傷，抑制血管生成[23-24]。另外有學者發(fā)現EPO還可通過抑制HIF-1α/VEGF信號通路，保持iBRB的完整性并減弱血管滲漏[25-26]。適量的EPO可以選擇性下調IL-1β、TNF-α、IL-6、VEGF等炎癥相關因子，可保護實驗性DR模型BRB完整性[27]。

2.2 氧化應激通路核因子相關因子2（NF-E2-related factor，Nrf2）/抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）信號通路 Nrf2/ARE信號通路是一種普遍存在的、進化保守的信號通路[28-29]。Nrf2作為氧化應激的感受器，在抗氧化應激中起重要作用[30]。Nrf2對氧化應激高度敏感，可特異性識別并結合ARE，促進相關抗氧化基因的轉錄，激活血紅素氧化酶（heme oxidase，HO-1）和醌氧化還原酶（quinone oxidoreductases，NQO-1），清除多余的氧自由基，減輕氧化應激損傷[31]。研究發(fā)現，EPO可過通過影響實驗性DR大鼠氧化應激通路相關分子，提高Nrf2、HO-1和NQO-1的表達水平，減少超氧化物和其他自由基產生，下調谷胱甘肽過氧化物酶，降低磷酸化Akt和熱休克蛋白水平，降低視網膜Ang-2表達，減少靶細胞氧化應激和亞硝化應激，從而減少DR神經細胞損傷以及周細胞的凋亡[32]。

2.3 非受體型絡氨酸蛋白激酶（non-receptor tyrosine protein kinases，JAK）/信號轉導和轉錄激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）信號通路 JAK/STAT信號通路參與細胞的增殖、分化、凋亡，在免疫反應、炎癥反應及微血管內皮細胞損傷中發(fā)揮重要作用[33]。細胞實驗發(fā)現，上調JAK通路后可以有效促進EPO引起的RPE胞質Ca2+內流，從而維持BRB的穩(wěn)定[34]。EPO通過抑制參與JAK/STAT信號通路的分子，包括重組人B細胞淋巴瘤因子2XL（recombinant human B-cell leukemia/lymphoma XL，Bcl-xL）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic protease，Caspase）-3、Caspase-9、蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase type 2A，PP2A）、抑癌基因p53、磷酸酶基因（phosphatase gene，PTEN）和沉默信息調節(jié)因子（silent information regulator 1，SIRT1）等，抑制細胞凋亡，發(fā)揮血管神經保護作用，延緩早期DR進展[11,35]。Wang等[36]發(fā)現，EPO能有效抑制高糖介導的視網膜神經節(jié)細胞（retinal ganglion cells，RGC）中Caspase-9和Caspase-3的上調，降低Bax/Bcl-2比值，從而抑制RGC的凋亡。

2.4 細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路 ERK信號通路是細胞生物學中研究最多的信號通路之一[37]，控制著許多重要的細胞生物學過程。既往研究證實，表皮生長因子通過與其受體結合后激活腎素血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）/絲裂原活化蛋白激酶-胞外信號調節(jié)激酶（mitogen-activated protein kinase-extracellular signal-regulated kinase，MEK），激活的 MEK 使ERK磷酸化，進入細胞核影響基因轉錄翻譯[38]。免疫組化分析證實，DR早期缺氧環(huán)境下VEGF可激活ERK的磷酸化，細胞中磷酸化ERK-1/2與總ERK-1/2的比值顯著降低，調節(jié)血管通透性和細胞遷移，從而促進內皮細胞的增殖及新生血管形成，而EPO可通過逆轉這一比值發(fā)揮其血管保護作用[39]。Shen等[40]發(fā)現，EPO可能通過ERK通路下調Bax，上調Bcl-2相關死亡促進因子磷酸化和Bcl-xL表達，發(fā)揮視網膜神經保護作用。鋅是人體中第二豐富的微量元素，在視網膜神經纖維層、RPE和脈絡膜中廣泛存在，參與視網膜的多種功能，在視網膜生理和病理過程中起著重要作用，如光傳導、視覺周期和神經傳導等[41]。ZnT8作為鋅的轉運蛋白之一，可將細胞內的鋅轉運至細胞外，在調節(jié)細胞鋅穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。Xu等[39]研究表明，EPO通過激活ERK通路上調ZnT8的表達，維持細胞內鋅的穩(wěn)態(tài)，保護高糖環(huán)境下視網膜細胞免受過量鋅引起的損傷，提高細胞活力，減少細胞凋亡。

2.5 氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路 JNK蛋白是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的成員，由 MAPK8、MAPK9和MAPK10 3個基因編碼，此信號通路調控多種生理過程，包括炎癥反應、細胞分化、細胞增殖、細胞死亡等[42-43]。JNK信號通路由多種細胞內外刺激（如細胞因子、病原體、激素、氧化應激、DNA損傷等）激活，它們可使多種細胞質和核底物發(fā)生磷酸化，如MAPK3的磷酸化[44]。Qi等[45]通過用EPO干預敲除酪氨酸蛋白磷酸酶非受體1型（tyrosine protein phosphatase nonreceptor 1，PTPN1）和 PTPN11基因編碼的細胞發(fā)現，EPO可通過提高PTPN1和PTPN11的表達水平來抑制JNK信號通路，從而顯著逆轉高糖誘導的RGC凋亡，發(fā)揮神經保護作用。Zhang等[46]通過細胞實驗發(fā)現，EPO通過阻斷缺氧誘導JNK的磷酸化，上調緊密連接蛋白和閉合蛋白的表達，保護BRB，從而減少血管滲漏，延緩DR進展。

3 EPO在PDR中的發(fā)病作用機制

Samson等[35]研究顯示，轉染EPOsiRNA的RPE細胞中VEGF表達下調。視網膜缺氧且VEGF高表達是PDR的主要誘導因素，EPO可增強VEGF的作用，從而促進新生血管形成，使PDR進一步惡化[34，47]。Gholamhossein等[48]和He等[13]發(fā)現，PDR患者血漿EPO水平明顯高于NPDR患者，EPO水平與DR分期相關，同時PDR患者視網膜增殖膜中EPOR表達顯著高于視網膜靜脈阻塞患者，且PDR患者術后最佳矯正視力與EPOR表達呈正相關，進一步提示EPO與PDR患者的預后相關。

4 EPO的相關應用

目前，基于靶向EPO的相關應用仍處于實驗階段，有學者發(fā)現視網膜下注射腺相關病毒介導表達人源EPO（AAV2-CMV-hEPO）的基因，可使血清中具有生物活性的EPO蛋白增加，從而發(fā)揮其血管神經保護作用[49]。EPO衍生的肽ARA290[50]、氨甲酰化EPO（CEPO）[47]通過抑制RGC及小膠質細胞凋亡和延緩血管退行性病變，使實驗性DR大鼠的視網膜電圖b波振幅和振蕩電位下降，從而發(fā)揮血管神經保護作用。Li等[51]通過對5例DR患者行EPO玻璃體腔注射，發(fā)現短期內療效可觀，但存在樣本量較少的局限性。因此，攜帶EPO基因或其他特定基因的AAV2載體有望成為DR長期預防或輔助治療的潛在治療方式，但EPO在DR中的臨床應用仍然需要大量的臨床試驗來驗證。

5 小結

DR是糖尿病的常見并發(fā)癥，可引起不可逆的視網膜損傷。EPO作為一種糖基化細胞因子，在DR發(fā)展早期具有明顯的血管神經保護作用。在PDR中，可導致病理性血管的生成以及BRB的破壞，加劇PDR的進展。在DR發(fā)病機制中EPO所參與的各種信號通路并不是孤立存在的，往往存在多個信號通路間的協同作用。近年來，針對DR雖然有非常成熟的治療方式，如抗VEGF藥物和皮質類固醇藥物玻璃體腔注射、視網膜激光光凝、玻璃體切除術等，但仍然存在大部分DR患者出現治療效果不佳以及預后不理想的情況。DR發(fā)病機制中EPO相關信號通路的不斷探索為DR的治療提供了更多潛在的靶點，這些發(fā)現對延緩DR進展以及治療具有非常重要的臨床意義。