韓佳芮，徐艷梅，郝麗娟，高燕霞

（1.河北科技大學，石家莊 050091；2.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院，石家莊 050200）

藥物在生產(chǎn)制備過程中會產(chǎn)生或者引入雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會嚴重影響人們的身體健康，因此，藥品的安全性不僅取決于活性原料藥的毒理學特性，還取決于其所含雜質(zhì)。近年來，藥物中基因毒性雜質(zhì)(GTI)是一個熱門話題，基因毒性雜質(zhì)是指痕量就能直接或間接損傷細胞DNA、引起基因突變、染色體斷裂或染色體重排的雜質(zhì)[1]。

磺酸酯為磺酸的有機酯，含有R—SO2O—官能團?；撬狨ヮ惢衔锸菨撛诘幕蚨拘噪s質(zhì)，在藥物生產(chǎn)過程中很容易引入，因為苯磺酸鹽等起始原料中含有磺酸酯類雜質(zhì)；在藥物合成中間體或者副產(chǎn)物中會產(chǎn)生磺酸酯類雜質(zhì)；在清洗儀器時使用低級醇或以低級醇為溶劑，與磺酸類化合物等發(fā)生化學反應也會生成磺酸酯類雜質(zhì)[2?4]?；撬狨ヮ愲s質(zhì)在經(jīng)過體內(nèi)代謝后毒性極強，在藥物研發(fā)和生產(chǎn)過程中應該嚴格控制。國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)于1987 年將甲基磺酸乙酯(EMS)列入致癌物清單，歸為2B 類致癌物，1999 年將甲基磺酸甲酯(MMS)列入致癌物清單，歸為2A類致癌物[5]。

2007年，甲磺酸奈非那韋藥物中基因毒性雜質(zhì)甲磺酸乙酯超標，甲磺酸乙酯超標的原因是用乙醇清洗原料藥儲存罐時，乙醇沒有烘干，殘留下來的乙醇與原料藥中的甲基磺酸發(fā)生反應，生成甲基磺酸乙酯，被患者攝入體內(nèi)會嚴重影響到患者的身體健康[2]。甲磺酸奈非那韋事件引起國內(nèi)外制藥企業(yè)和監(jiān)管部門對磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的廣泛關(guān)注。2008 年，歐洲藥物管理局(EMA)和美國食品藥品管理局(FDA)引入了毒理學關(guān)注閾值(TTC)，即可接受風險攝入量，把1.5 μg/d 作為基因毒性雜質(zhì)的最大攝取量[6?7]，用來作為限制藥物研發(fā)和生產(chǎn)過程中引入的基因毒性雜質(zhì)的標準。

測定痕量水平的基因毒性雜質(zhì)，需要高靈敏度和高選擇性的分析方法，這給藥物研發(fā)和分析帶來了巨大的挑戰(zhàn)[8]。目前磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的測定方法主要有高效液相色譜(HPLC)法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法、氣相色譜(GC)法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法。

1 高效液相色譜法

高效液相色譜法能夠在短時間內(nèi)對復雜樣品進行分離，是藥物分析中最經(jīng)典、最常用的方法，廣泛應用于醫(yī)學藥物、食品、環(huán)境、農(nóng)業(yè)等各個方面，具有快速、高效、高靈敏度等特點[9?10]。高效液相色譜法在檢測機構(gòu)和制藥企業(yè)的日常藥品檢測中具有適用性，值得廣泛推廣應用。

焦?jié)嵉萚11]建立了HPLC法測定注射用長春西汀中對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯含量的方法，對流動相和色譜柱進行考察，選擇Waters ODS2 C18色譜柱，可以很好地避免樣品峰拖尾對待測組分的干擾，提高了檢測的靈敏度。結(jié)果顯示，2種基因毒性雜質(zhì)均具有良好的線性關(guān)系，準確度好，檢出限分別為0.015、0.023 μg/mL。王建等[12]建立了HPLC法測定更昔洛韋縮合物中基因毒性雜質(zhì)，對檢測波長、緩沖溶液、流動相、流速、色譜柱進行了考察，測定對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯的含量，線性關(guān)系良好，檢出限分別為15.852、15.848 ng/mL。孫樸等[13]建立了液相色譜-紫外法測定氫溴酸西酞普蘭中的基因毒性雜質(zhì)對甲苯磺酸乙酯，線性關(guān)系良好，精密度良好，定量限和檢出限分別為0.025 6、0.012 4 μg/mL。江凡等[14]采用HPLC法測定布林佐胺中基因毒性雜質(zhì)，對緩沖液和流動相進行了考察，選擇磷酸-水體系作為流動相，用三乙胺調(diào)節(jié)pH 值，可以減少流動相對儀器和色譜柱的損傷，同時使雜質(zhì)能夠很好地分離，對甲苯磺酸異丙酯檢出限為0.008 5 μg/mL，專屬性良好，線性關(guān)系良好。謝衛(wèi)鋒等[15]建立了測定托吡司特中基因毒性雜質(zhì)的高效液相色譜法，優(yōu)化了流動相和最大吸收波長。測定結(jié)果表明，對甲苯磺酸異丙酯、對甲苯磺酸仲丁酯、對甲苯磺酸乙酯三種基因毒性雜質(zhì)線性關(guān)系良好，檢出限分別為0.016 7、0.015 8 和0.016 8 μg/mL。舒理建等[16]建立了HPLC 法測定苯磺貝他斯汀片中基因毒性雜質(zhì)，對色譜柱進行考察，選用ACE 3 C8色譜柱，苯磺酸乙酯與苯磺酸異丙酯分離效果好，線性關(guān)系良好，檢出限分別為0.000 032、0.000 064 mg/mL。

高效液相色譜法操作簡單，靈敏度高，專屬性強，準確可靠，在很大程度上節(jié)省了檢測成本和檢測時間，用于磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的測定具有很好的應用價值。

2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是把液相色譜和質(zhì)譜結(jié)合在一起使用。液相色譜作為分離系統(tǒng)，在對藥品進行化學分析測定時，樣品首先在液相色譜中初步分離，然后在質(zhì)譜中再次分離，通過離子化把離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開；質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)，通過質(zhì)譜檢測得到質(zhì)譜圖。把液相色譜與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，解決了被液相色譜分離的組分的定性問題及質(zhì)譜樣品需預處理、程序復雜、耗時長的問題，充分發(fā)揮兩者的綜合優(yōu)勢。近年來，LC-MS 技術(shù)越來越完善，在藥物分析、環(huán)境監(jiān)控、食品成分檢測等方面得到了廣泛的應用[17?18]。

基因毒性雜質(zhì)含量極低，且種類較多，導致分離檢測較為困難，高效液相色譜法難以準確測定。液相色譜-質(zhì)譜法具有高選擇性、高靈敏度的特點，LC-MS 法是藥物分析檢測的高效和切實可行的技術(shù)手段，在基因毒性雜質(zhì)研究中已有很多報道。黃偉民等[19]對質(zhì)譜、溶劑、流動相等條件進行了考察，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定樟腦磺酸酯類的基因毒性雜質(zhì)，難以滿足檢測要求，因此，建立LC-MS法測定硫酸氫氯吡格雷原料藥中基因毒性雜質(zhì)左旋樟腦磺酸甲酯和左旋樟腦磺酸異丙酯，線性關(guān)系良好，兩者檢出限均為1.67 ng/mL，定量限均為5.00 ng/mL。曹麗曉等[20]建立了LC-MS 法對新型VMAT2 抑制劑LPM3770164 中的基因毒性雜質(zhì)進行定量檢測，對分析方法、色譜條件和質(zhì)譜條件分別進行考察，測定樟腦磺酸甲酯(MCS)、樟腦磺酸乙酯(ECS)的含量，結(jié)果線性關(guān)系良好，靈敏度高。宋太發(fā)等[21]選擇Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱，采用ESI 離子源，正離子模式采集，多反應離子檢測，建立LC-MS/MS法測定加替沙星中基因毒性雜質(zhì)，對甲基苯磺酸乙酯線性關(guān)系良好，檢出限和定量限分別為0.000 74 ng和0.000 93 ng。駱美玉等[22]選用Waters XTerra RP18色譜柱，以甲醇-水為流動相，采用APCI 離子源，負離子模式檢測，建立LC-MS/MS法檢測鹽酸吉西他濱中基因毒性雜質(zhì)，甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯質(zhì)量濃度在20～200 μg/L 范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，檢出限和定量限均別為4、10 μg/L。舒詩會等[23]建立LC-MS/MS 法對拉科酰胺原料中基因毒性雜質(zhì)進行檢測，對質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，選擇[M+NH4]+(m/z204.0)作為母離子，采用MRM模式，對流動相和稀釋劑進行優(yōu)化，解決了離子響應不穩(wěn)定和回收率偏低的問題，結(jié)果顯示對甲苯磺酸甲酯線性關(guān)系良好，定量限為2.62 ng/mL。石小娜等[24]建立LC-MS/MS 法測定鹽酸法舒地爾中兩種基因毒性雜質(zhì)5-異喹啉磺酸甲酯和5-異喹啉磺酸乙酯，對溶劑進行了考察，選用50%的乙腈-水溶液作為稀釋液，實驗結(jié)果表明兩種基因毒性雜質(zhì)線性關(guān)系良好，檢出限分別為0.2 ng/mL 和0.02 ng/mL。Jin等[25]建立HPLC-APCI-MS/MS法測定藥物中15 種磺酸酯類雜質(zhì)，在MRM 模式下利用大氣壓化學電離對雜質(zhì)定量，不需要衍生反應，能夠在一次HPLC 運行中同時測定15 種基因毒性雜質(zhì)，該方法檢測快速、準確、靈敏。Zhou等[26]建立衍生-高效液相色譜-紫外法測定甲磺酸中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的含量，對衍生反應進行優(yōu)化，以二乙基二硫代氨基甲酸鈉(DDTC)作為衍生試劑，溶劑為含有少量NaOH 的二甲基乙酰胺(DMA)，該方法線性關(guān)系良好。

隨著液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的廣泛應用，推動了接口技術(shù)不斷發(fā)展優(yōu)化，出現(xiàn)了四極桿質(zhì)譜儀、四極桿離子阱質(zhì)譜儀等多種類型的質(zhì)譜檢測器。四極桿-靜電場軌道阱(Q-Orbitrap)質(zhì)譜是將四極桿-靜電場軌道阱結(jié)合，是近年來發(fā)展起來的高靈敏度、高分辨率、高質(zhì)量精度的質(zhì)譜技術(shù)之一[27?28]。劉暘等[29]建立高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱法對鹽酸法舒地爾中的基因毒性雜質(zhì)5-異喹啉磺酸甲酯和5-異喹啉磺酸乙酯進行測定，對質(zhì)譜質(zhì)量分析器進行了考察，選用Q-Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀，同時對質(zhì)譜條件和色譜條件進行優(yōu)化，采用ESI離子源，正離子模式，在流動相中加入甲酸，加強對化合物的電離，改善色譜峰形。結(jié)果顯示，兩種基因毒性雜質(zhì)的線性關(guān)系良好，檢出限分別為0.66、0.30 μg/g，定量限分別為2.0、1.0 μg/g。該方法簡便、快速、專屬性好、靈敏度高，可用于鹽酸法舒地爾的檢測。液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜(LC-QQQ-MS/MS)法廣泛應用于痕量物質(zhì)的分析測試，具有靈敏度高、準度高、特異性高等特點。曹琳等[30]建立液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法測定苯磺酸氨氯地平中基因毒性雜質(zhì)，對流動相和離子源進行考察，選擇了質(zhì)譜兼容的流動相，采用ESI源，測定苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯和苯磺酸異丙酯的含量，四種雜質(zhì)在1～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，苯磺酸甲酯定量限為20 ng/mL，其它三種基因毒性雜質(zhì)定量限為1 ng/mL，方法靈敏度高、準確度和精密度良好。

3 氣相色譜法

氣相色譜是一種以氣體作為流動相的色譜法，廣泛應用于易分離氣體和易揮發(fā)的成分，靈敏度高，專屬性強，芳基磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)大多為難揮發(fā)性雜質(zhì)或不揮發(fā)雜質(zhì)，氣相色譜多用于測定烷基磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)[31]。

鄭飛等[32]建立了GC 法測定沙格列汀原料藥中基因毒性雜質(zhì)，對氣相色譜條件進行選擇和優(yōu)化，采用毛細管氣相色譜法測定，檢測器為氫火焰離子化檢測器，選擇甲醇為溶劑，可以很好地達到分離效果；采用直接進樣法進行檢測，測定甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯的含量，結(jié)果顯示，線性關(guān)系良好，該法操作方便快捷，結(jié)果準確可靠。侯奇?zhèn)サ萚33]建立衍生GC法同時檢測草酸艾司西酞普蘭中甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯三種甲磺酸烷基酯，以NaI-H2O作為碘化衍生試劑，采用氫火焰離子化(FID)檢測器，頂空進樣，在衍生化過程中，樣品與碘化鈉也發(fā)生衍生化反應，干擾檢測，以乙腈為溶劑，三種甲磺酸烷基酯線性關(guān)系良好，準確度好。但是，甲磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定，單純采用GC 法檢測分析結(jié)果不夠準確，難以滿足對甲磺酸酯類雜質(zhì)的痕量檢測。

4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法適用于易揮發(fā)、半揮發(fā)化合物的分析，把氣相色譜作為質(zhì)譜的進樣器，樣品在氣相色譜柱中分離，把質(zhì)譜作為檢測器，樣品分離以后在質(zhì)譜儀中進行分析檢測，能準確地分析復雜混合物[34?36]。氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用彌補了氣相色譜對未知化合物定性能力差的缺點，利用分析速度快、靈敏度高、準確度好的質(zhì)譜作為檢測器，廣泛應用于科學研究、工業(yè)生產(chǎn)、藥品、食品等領域的檢測[37?38]。

包小紅等[39]采用三重四級桿質(zhì)譜檢測器，以DB-5MS 毛細管柱為色譜柱，流速是恒線速度控制模式，不分流進樣，樣品無須預處理，建立GC-MS/MS 法對泊沙康唑中基因毒性雜質(zhì)對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸異丙酯、BS-1中間體-2和BS-1中間體-3 殘留量進行測定，4 種基因毒性雜質(zhì)的線性關(guān)系良好。但由于樣品存在大量非揮發(fā)性基質(zhì)，會造成氣相進樣口污染，因此需要合適的預處理減少基質(zhì)的干擾。許多研究人員采用衍生化的方式，將磺酸酯衍生為較為穩(wěn)定的、揮發(fā)性的物質(zhì)。姚彤等[40]建立了GC-MS/MS 法測定鹽酸吉西他濱中2 種甲磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯，以碘化鈉為衍生試劑，對色譜柱進行考察，采用背景噪音低的VF-WAX ms 毛細管色譜柱，對內(nèi)標物進行考察，以甲磺酸正丁酯作為內(nèi)標物，兩種磺酸酯類雜質(zhì)線性關(guān)系良好。與LC-MS/MS 法相比，GCMS/MS 專屬性好、靈敏度高，更適于鹽酸吉西他濱中基因毒性雜質(zhì)的檢測。Zhang 等[41]提出了GCMS 法同時測定甲磺酸伊馬替尼中基因毒性雜質(zhì)，采用萃取離子色譜法定量甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯，線性關(guān)系良好。在進樣前采用在線柱前衍生法，減少了基質(zhì)干擾，與直接進樣相比，大大提高了靈敏度。董海峰等[42]建立的頂空-GC-MS 法，分別對色譜柱、柱流量和進樣時間進行了優(yōu)化，選擇了最優(yōu)的色譜條件，在頂空瓶內(nèi)衍生，檢測苯磺酸左旋氨氯地平片中3種苯磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)苯磺酸甲酯，苯磺酸乙酯和苯磺酸異丙酯，結(jié)果顯示三種雜質(zhì)線性關(guān)系良好，檢出限為0.03～0.13 mg/kg，定量限為0.14～0.25 mg/kg。李炎等[43]建立在線衍生頂空進樣GC-MS法測定沙芬酰胺原料藥中基因毒性雜質(zhì)甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯、甲磺酸丙酯和甲磺酸丁酯，對方法的耐用性進行考察，耐用性良好，5種基因毒性雜質(zhì)線性關(guān)系良好，檢出限為0.3～1.3 ng/mL，定量限為0.9～4.3 ng/mL。高潔等[44]同樣建立了頂空HS-20 GC-MS 聯(lián)用法，檢測甲磺酸鹽類原料藥中甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯與甲磺酸丙酯四種甲磺酸烷基酯雜質(zhì)，四種雜質(zhì)線性關(guān)系良好，檢出限在0.01～0.10 ng 之間。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度高，準確可靠，在測定磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)中的應用將會更加廣泛。

5 結(jié)語

在原料藥的合成過程中，需要使用大量的起始原料、工藝中間體和試劑才能得到最終原料藥，其中一些物質(zhì)、中間體和試劑，以及合成過程的副產(chǎn)物，都有可能產(chǎn)生基因毒性雜質(zhì)，并以低水平的雜質(zhì)存在于活性成分或最終藥品中，對人們的健康造成很大的危害。對痕量基因毒性雜質(zhì)進行檢測和分析，不僅對儀器的要求很高，而且對分析方法的特異性要求也很高。隨著研究的深入，將會有更加高效便捷的檢驗技術(shù)和方法應用于磺酸酯類雜質(zhì)的檢測，逐步實現(xiàn)藥物中磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的精準檢測和有效控制，為藥物的安全性提供了必要的技術(shù)支持，以保障人民的用藥安全。