黃佳偉，梁 雁，韋慧鮮，阮碧芳

（廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，廣西 南寧 530000）

葛根系豆科植物野葛（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）的干燥根[1]。研究發(fā)現(xiàn)，葛根中含有葛根素、芒果苷、大豆苷、三萜類、香豆素、皂苷等化合物[2]，其中葛根素具有抗氧化、保護(hù)肝臟、抗腫瘤等多種藥理作用[3-5]，可用于冠心病、心肌梗死等心腦血管病和糖尿病的治療，具體表現(xiàn)為擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，改善心肌缺血，降低血糖以及清除氧自由基等[6-7]。

由葛根制成的相關(guān)藥品、保健食品、化妝品已在市場(chǎng)上銷售多年，具有良好的市場(chǎng)基礎(chǔ)。如何從葛根中環(huán)保、高效、低成本地提取葛根素是近年的研究熱點(diǎn)[8]。目前，葛根素的提取方法主要有微波法、浸提法、溶劑分離法、乙醇提取法、超聲波提取法等[9-13]，這些提取方法只能在一定程度上利用機(jī)械碎裂、熱效應(yīng)、空化效應(yīng)的手段破壞葛根細(xì)胞壁，存在得率低、浪費(fèi)提取溶劑的缺點(diǎn)。酶法提取技術(shù)高效快速、條件溫和，且能通過破壞植物細(xì)胞壁加速細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出，不但能較大程度地提高提取物得率，同時(shí)還能保持其原有的功效。

本研究將纖維素酶提取和超聲波提取聯(lián)合應(yīng)用于葛根中葛根素的提取，強(qiáng)化兩種提取方法的優(yōu)勢(shì)，以葛根素得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、酶解時(shí)間等提取工藝參數(shù)，找到更為環(huán)保、提取效率更高的葛根素提取方法，為葛根的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

葛根素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：上海源葉生物科技公司；乙醇（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；葛根，市售；纖維素酶（50 U/mg）：上海源葉生物科技公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-5500 紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；SB-5200D 超聲波清洗儀：寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；FW135 粉碎機(jī)：泰斯特儀器有限公司；RE5220 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：常州杰博森儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葛根素樣品溶液的制備

精密稱取經(jīng)粉碎并過3 號(hào)篩（50 目）的葛根粉末2.5 g，按一定液料比（乙醇∶葛根粉末）加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，然后再加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的纖維素酶，50 ℃水浴酶解一定時(shí)間，酶解結(jié)束后，95 ℃水浴滅活5 min，于30～80 ℃下超聲處理20～70 min，然后進(jìn)行真空抽濾，并利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)濾液進(jìn)行濃縮，用無水乙醇將濃縮液定容至100 mL，即得粗提葛根素樣品溶液。

1.2.2 葛根素含量的測(cè)定

1.2.2.1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取葛根素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量20 mg，用乙醇溶解并定容至25 mL 容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為800 μg/mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品母液，將標(biāo)準(zhǔn)品母液稀釋至1.6、3.2、4.8、6.4、8.0、9.6 μg/mL，分別于250 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。得到葛根素質(zhì)量濃度（c）與吸光度值（A）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.077 3c+0.012（R2=0.999 55）。

1.2.2.2 葛根素得率的計(jì)算

精密移取提取樣液，稀釋至適宜濃度，使之在250 nm 吸光度值的線性范圍內(nèi)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算葛根素質(zhì)量濃度，葛根素得率按照以下公式計(jì)算。

式中：c為葛根素質(zhì)量濃度，μg/mL；V為樣品體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為葛根粉的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

固定液料比30∶1（mL/g）、纖維素酶添加量0.5%、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、酶解時(shí)間50 min、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度60 ℃，分別考察液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g））、纖維素酶添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%、80%）、酶解時(shí)間（30、40、50、60、70、80 min）、超聲時(shí)間（20、30、40、50、60、70 min）、超聲溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）對(duì)葛根素得率的影響。

1.2.4 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)液料比（A）、纖維素酶添加量（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、酶解時(shí)間（D）、超聲時(shí)間（E）、超聲溫度（F）進(jìn)行關(guān)鍵因素的篩選，以葛根素得率作為響應(yīng)值。每個(gè)因素有高低兩個(gè)水平。Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment design for puerarin extraction

1.2.5 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果，篩選出對(duì)葛根素得率具有顯著影響的因素，其他非顯著因素條件保持不變，以各因素的效應(yīng)大小確定爬坡的方向和步長(zhǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14]，根據(jù)葛根素得率的高低確定具有顯著影響因素的最佳提取范圍。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，固定纖維素酶添加量0.4%，酶解時(shí)間70 min，將液料比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲時(shí)間（C）、超聲溫度（D）設(shè)為自變量，葛根素得率設(shè)為響應(yīng)值，利用Box-Behnken 試驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平的優(yōu)化試驗(yàn)。因素及水平編碼如表2所示。

表2 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken response surface experiments for puerarin extraction

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007、Origin 8、Design Expert 11 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)葛根素得率的影響

如圖1 所示，隨著乙醇所占比例的不斷增大，葛根素得率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，液料比為30∶1（mL/g）時(shí)，葛根素得率達(dá)到最大值，液料比在30∶1～60∶1（mL/g）時(shí)，葛根素得率隨著乙醇所占比例的增大而降低，這可能是乙醇占比的增加，使細(xì)胞內(nèi)外葛根素濃度差變大，葛根素不斷溶出；液料比增大到一定范圍后，其他物質(zhì)如糖類、蛋白質(zhì)也相繼擴(kuò)散出來[15]，形成粘附性膠團(tuán)附于葛根粉末表面，導(dǎo)致其得率下降。因此，選取液料比20∶1、30∶1、40∶1（mL/g）進(jìn)行后續(xù)篩選試驗(yàn)。

圖1 液料比對(duì)葛根素得率的影響Fig. 1 Effect of liquid-solid ratio on the yield of puerarin

2.1.2 纖維素酶添加量對(duì)葛根素得率的影響

酶反應(yīng)提取作為新型的提取技術(shù)，具有高效節(jié)能、操作簡(jiǎn)單方便、反應(yīng)溫和的優(yōu)勢(shì)，常用于中成藥有效成分的提取應(yīng)用[16-17]。如圖2 所示，反應(yīng)前期，隨著纖維素酶添加量的不斷增加，葛根素得率顯著提高，纖維素酶添加量為0.5%時(shí)，葛根素得率達(dá)到最大值，而后繼續(xù)增加纖維素酶添加量，葛根素得率卻開始降低，原因可能是過多纖維素酶的加入，大量大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)等溶出[18]，阻塞了溶出孔，酶解效率降低，導(dǎo)致葛根素得率下降。因此，選擇纖維素酶添加量0.4%、0.5%、0.6%進(jìn)行后續(xù)篩選試驗(yàn)。

圖2 纖維素酶添加量對(duì)葛根素得率的影響Fig. 2 Effect of cellulase adding amount on the yield of puerarin

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛根素得率的影響

如圖3 所示，反應(yīng)前期，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，葛根素得率不斷提高，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，葛根素得率達(dá)到最大值，之后葛根素得率呈下降趨勢(shì)，原因是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，葛根粉中其他可溶于乙醇的成分如極性小分子也在不斷溶出，與葛根素競(jìng)爭(zhēng)溶劑，使其溶出受限。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%進(jìn)行后續(xù)篩選試驗(yàn)。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛根素得率的影響Fig. 3 Effect of ethanol content on the yield of puerarin

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)葛根素得率的影響

如圖4 所示，葛根素得率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。在酶解時(shí)間為60 min時(shí)，葛根素得率達(dá)到最大值，之后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，葛根素得率反而降低，原因可能是當(dāng)酶解時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，酶解底物過多，酶反應(yīng)趨于穩(wěn)定[19]；隨著葛根細(xì)胞壁破裂，黏性物質(zhì)釋放，致使葛根素溶出受阻。因此，選擇酶解時(shí)間50、60、70 min 進(jìn)行后續(xù)篩選試驗(yàn)。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)葛根素得率的影響Fig. 4 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of puerarin

2.1.5 超聲時(shí)間對(duì)葛根素得率的影響

如圖5 所示，反應(yīng)前期，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，葛根素得率不斷提高，在40 min 時(shí)達(dá)到最大值，隨后葛根素得率下降，原因可能是超聲時(shí)間過長(zhǎng)，引起細(xì)胞空間構(gòu)型改變[20]，葛根素溶出受限，導(dǎo)致其得率下降。因此，選擇超聲時(shí)間30、40、50 min 進(jìn)行后續(xù)篩選試驗(yàn)。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)葛根素得率的影響Fig. 5 Effect of ultrasonic time on the yield of puerarin

2.1.6 超聲溫度對(duì)葛根素得率的影響

如圖6 所示，反應(yīng)前期，隨著超聲溫度的升高，葛根素得率不斷提高，超聲溫度為60 ℃時(shí)，葛根素得率達(dá)到最大值，之后葛根素得率反而不斷下降。原因可能是超聲溫度過高時(shí)，葛根素部分結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致葛根素得率下降。因此，選擇超聲溫度50、60、70 ℃進(jìn)行后續(xù)篩選試驗(yàn)。

圖6 超聲溫度對(duì)葛根素得率的影響Fig. 6 Effect of ultrasonic temperature on the yield of puerarin

2.2 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以葛根素得率為響應(yīng)值，采用Plackett-Burman 法進(jìn)行顯著因素篩選試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4 可知，模型的F 值=24.97＞1，P 值＜0.01，R2=0.96 7=0.929，表明模型設(shè)計(jì)合理；6 個(gè)因素對(duì)葛根素得率的影響程度大小為：A＞E＞C＞F＞D＞B；液料比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、超聲時(shí)間（E）、超聲溫度（F）對(duì)葛根素得率影響顯著（P＜0.05），纖維素酶添加量（B）和酶解時(shí)間（D）對(duì)葛根素得率影響不顯著。

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman experiment design and results

表4 Plackett-Burman 試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析Table 4 Statistical analysis of Plackett-Burman test

對(duì)表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到6 個(gè)因素和響應(yīng)值葛根素得率的多元一次回歸方程：Y=7.53+0.76A-0.056B+0.19C+0.072D-0.22E-0.19F。從方程可知：在顯著性因素中，液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)為正效應(yīng)，即隨著取值的增大，葛根素得率呈升高趨勢(shì)；超聲時(shí)間和超聲溫度為負(fù)效應(yīng)，即隨著取值的增大，葛根素得率為降低趨勢(shì)。在非顯著性因素中，纖維素酶添加量為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)取其低水平，酶解時(shí)間為正效應(yīng)，應(yīng)取其高水平。

因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，固定纖維素酶添加量0.4%，酶解時(shí)間70 min。選擇液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度4 個(gè)因素進(jìn)一步考察，分析這4 個(gè)因素及其相互作用對(duì)葛根素得率的影響。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

由表5 可知，隨著液料比（A）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）逐漸增大，超聲時(shí)間（E）和超聲溫度（F）逐漸減小，葛根素得率呈先升高后降低的趨勢(shì)。試驗(yàn)組3 的葛根素得率最大，因此，選取試驗(yàn)組3 作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of the steepest climbing test

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果及方差分析

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，將4 個(gè)自變量設(shè)計(jì)成四因素三水平共29 組試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表6。

使用Design Expert 11 軟件對(duì)表6 的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，將葛根素得率作為響應(yīng)值，與各個(gè)因素進(jìn)行回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=8.73 +0.14A +0.3B -0.27C +0.14D -0.21AB +0.1AC -0.42AD-0.078CD-0.88A2-0.66B2-0.19C2-0.32D2。方差分析結(jié)果見表7。

表6 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 6 Box-Behnken experiment design and results

由表7 可知，模型P＜0.000 1，模型可信度高，同時(shí)失擬項(xiàng)不顯著（P=0.123 2）＞0.05，說明該方程擬合合理，模型可用于實(shí)際值的預(yù)測(cè)。B、C、AD、A2、B2、D2對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著（P＜0.01），A、D、AB、C2對(duì)響應(yīng)值的的影響顯著（P＜0.05）。以上結(jié)果說明：乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間是影響葛根素提取的2 個(gè)主要因素，液料比和超聲溫度次之；液料比與乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比與超聲溫度的交互作用對(duì)葛根素的得率有顯著影響（P＜0.05），其他因素交互作用的P 值均大于0.05，對(duì)葛根素的得率無顯著影響?；貧w方程的R2=0.957 4，=0.914 7，說明該模型可以用于解釋91.47%響應(yīng)值的變化，即模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合程度較好，可在該模型基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)因素條件優(yōu)化，用于預(yù)測(cè)葛根素的最優(yōu)提取工藝。

表7 Box-Behnken 試驗(yàn)回歸方程方差分析表Table 7 Analysis of variance of regression equation for Box-Behnken test

2.4.2 響應(yīng)面圖形分析

響應(yīng)面圖的坡度顯示了因素對(duì)響應(yīng)值的影響，坡度越陡峭，即傾斜度越大，表明兩個(gè)因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。對(duì)比響應(yīng)面圖的坡度陡緩趨勢(shì)可知（圖7），乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）對(duì)葛根素得率影響較大，其次是超聲時(shí)間（C）和超聲溫度（D），液料比（A）的響應(yīng)面曲面相對(duì)平緩，說明液料比對(duì)葛根素得率影響相對(duì)較小。乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）與液料比（A）之間的交互作用對(duì)葛根素得率影響顯著（P＜0.05），當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較小時(shí)，液料比對(duì)葛根素得率影響較大，隨著液料比的增大，葛根素得率快速升高，而乙醇體積分?jǐn)?shù)增大后，葛根素得率又降低；液料比（A）與超聲時(shí)間（C）的交互作用對(duì)葛根素得率影響不顯著，隨著液料比增大和超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，葛根素得率出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；液料比（A）與超聲溫度（D）的交互作用對(duì)葛根素得率影響極顯著（P＜0.01），葛根素得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）與超聲時(shí)間（C）的交互作用對(duì)葛根素得率的影響不顯著，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高和超聲時(shí)間延長(zhǎng)，葛根素得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）與超聲溫度（D）的交互作用對(duì)葛根素得率的影響不顯著，葛根素的得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度的升高呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢(shì)；超聲溫度（D）與超聲時(shí)間（C）的交互作用對(duì)葛根素得率影響不顯著，葛根素得率呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢(shì)。

圖7 各因素間的交互作用對(duì)葛根素得率影響的響應(yīng)面圖Fig. 7 Response surface diagram of the effects of factors interaction on the yield of puerarin

2.5 葛根素提取最佳工藝條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)過Plackett-Burman 試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)，最后由Box-Behnken 試驗(yàn)預(yù)測(cè)得到，在固定纖維素酶添加量0.4%，酶解時(shí)間70 min 的情況下，葛根素提取的最佳工藝條件為：液料比29.13∶1（mL/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)52.41%，超聲時(shí)間31.78 min，超聲溫度63.82 ℃。在上述條件下模型預(yù)測(cè)的葛根素得率為8.89 mg/g。為了便于實(shí)際操作，將提取條件修正為：液料比30∶1（mL/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)52%，超聲時(shí)間31 min，超聲溫度64 ℃。按照修訂后條件進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，葛根素平均得率為8.78 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值僅有1.23%的誤差，數(shù)據(jù)重復(fù)性較好，證實(shí)Design Expert 11 軟件構(gòu)建的以葛根素得率為響應(yīng)值的模型是有效可靠的。

3 結(jié)論

中成藥中有效成分的藥效保留主要取決于對(duì)中成藥原藥的提取、分離、純化技術(shù)，而傳統(tǒng)的提取方法已無法滿足中成藥提取后藥物質(zhì)量控制的要求，這也是阻礙中成藥實(shí)現(xiàn)藥物現(xiàn)代化的原因之一。本研究通過纖維素酶對(duì)植物細(xì)胞壁酶解的特點(diǎn)，在超聲波輔助的溫和條件下，通過Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選出影響顯著的因素，從最陡爬坡試驗(yàn)得出最大響應(yīng)值區(qū)域，并將其作為Box-Behnken 響應(yīng)面法的分析中心點(diǎn)，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，通過優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)，確定提取葛根中葛根素的最佳工藝參數(shù)為：液料比30∶1（mL/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)52%，超聲時(shí)間31 min，超聲溫度64 ℃。在該工藝條件下，葛根素平均得率為8.78 mg/g，與理論值基本相符，表明采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化從葛根中提取葛根素的工藝是可行的。