夏會(huì)楠 李東曉 趙玉陽 王春霞 鄭素月 郭金英

（河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038）

食用菌俗稱蘑菇又名蕈菌，是一種可食用的大型真菌，不僅味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，還含有藥食同源的生理活性成分，可用于食品加工、保健品開發(fā)以及醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)等領(lǐng)域[1]。目前，我國(guó)食用菌栽培技術(shù)已十分成熟，但品種較少。食用菌品種選育的主要手段有原生質(zhì)體融合、雜交、野生菌馴化等[2-3]。原生質(zhì)體融合又被稱為體細(xì)胞雜交技術(shù)[4-5]，20世紀(jì)70年代開始應(yīng)用于食用菌領(lǐng)域。隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為培育出高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)良新品種，學(xué)者將原生質(zhì)體融合技術(shù)逐漸應(yīng)用到食用菌菌株（品種）改良以及選育中。武秋穎等[6]以高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的平菇Pleurotus ostreatus菌株CCEF89 和適應(yīng)性強(qiáng)的杏鮑菇Leurotus eryngii菌株P(guān)L7 為試驗(yàn)材料，建立原生質(zhì)體PEG 融合體系，通過拮抗反應(yīng)試驗(yàn)及Rep-PCR 分子鑒定方法鑒定融合子，然后選擇菌絲長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的融合子進(jìn)行出菇試驗(yàn)，以此選育平菇新菌株，同時(shí)為食用菌育種提供新的種質(zhì)資源。原生質(zhì)體融合技術(shù)也是改進(jìn)真菌菌株代謝物譜和生物量產(chǎn)量的有效手段[7]。駢永茹等[8]采用單因素及正交試驗(yàn)方法，優(yōu)化巨大側(cè)耳Pleurotus giganteus原生質(zhì)體制備條件，為巨大側(cè)耳雜交育種，全基因測(cè)序以及遺傳轉(zhuǎn)化提供優(yōu)良菌株。REN 等[9]采用原生質(zhì)體制備結(jié)合化學(xué)誘變法改良靈芝菌株，改良后靈芝菌株的多糖及三萜類化合物合成能力強(qiáng)，且具有穩(wěn)定遺傳性。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，原生質(zhì)體融合技術(shù)將會(huì)為食用菌育種提供一個(gè)廣闊的平臺(tái)[10]。

筆者概述原生質(zhì)體制備、融合方法及原生質(zhì)體融合技術(shù)在新品種選育上的應(yīng)用，展望未來應(yīng)用前景，為食用菌遺傳育種提供參考。

1 原生質(zhì)體制備及再生

1981年食用菌溶壁酶的出現(xiàn)，使原生質(zhì)體融合育種技術(shù)取得突破性進(jìn)展[7]。食用菌在進(jìn)行原生質(zhì)體制備時(shí)，原生質(zhì)體再生率易受外界條件影響，如菌齡、酶含量、酶解時(shí)間以及酶解溫度。RAMAN 等[4]通過GPE（聚乙二醇）誘導(dǎo)融合技術(shù)進(jìn)行靈芝Ganoderma lucidum種間雜交，當(dāng)酶解時(shí)間為2.5 h 時(shí)原生質(zhì)體再生率最高，原生質(zhì)體產(chǎn)量為6.40×105個(gè)/mL。許琳等[10]以靈芝Ganoderma lucidum（赤芝及無柄靈芝）為試驗(yàn)材料，采用單因素及正交試驗(yàn)，優(yōu)化原生質(zhì)體制備條件，結(jié)果表明，赤芝菌絲菌齡為10 d，酶解溫度為35 ℃，酶解時(shí)間為3 h時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為9.75×107個(gè)/mL。李良敏等[7]優(yōu)化糙皮側(cè)耳Pleurotus ostreatus、雙孢蘑菇Agaricus bisporus、中國(guó)美味蘑菇A.sinodeliciosus的原生質(zhì)體制備方法，將鋪有玻璃紙的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d 的菌絲轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿后，直接加入溶壁酶，酶解60 min，獲得原生質(zhì)體106～107個(gè)/mL。此方法節(jié)省時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，不易污染。

2 原生質(zhì)體融合方法

2.1 原生質(zhì)體自發(fā)融合

原生質(zhì)體可以自發(fā)性融合，人為去除細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體之間具有胞間連絲，由于胞間連絲黏連或者伸縮使得同類的兩個(gè)細(xì)胞發(fā)生融合，進(jìn)而產(chǎn)生融合體。研究表明，適度的干旱條件有利于原生質(zhì)體的融合[8]，但原生質(zhì)體自發(fā)融合仍比較困難。

2.2 人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合

人為干預(yù)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的原生質(zhì)體，不僅能促進(jìn)其融合，還提高融合效率[8-9，11]。研究者常采用物理及化學(xué)方法來促進(jìn)原生質(zhì)體融合。聚乙二醇常被用作促進(jìn)原生質(zhì)體融合的化學(xué)誘導(dǎo)劑[12-13]；物理方法有離心、振動(dòng)、電刺激[14-18]。

3 原生質(zhì)體融合技術(shù)在食用菌遺傳育種中的應(yīng)用

3.1 食用菌顏色遺傳規(guī)律研究應(yīng)用

食用菌品種繁多，色澤多樣，如金針菇有白色、黃色，真姬菇有白色、灰色。為滿足人們對(duì)食用菌顏色喜好，菇體顏色也成為食用菌育種的重要目標(biāo)性狀[5]。武秋穎等[6]進(jìn)行交配型的原生質(zhì)體單核菌株配對(duì)雜交獲得F1 代，將F1 代子實(shí)體的孢子單核菌株與親本進(jìn)行回交配對(duì)，觀察菇體顏色，分析子實(shí)體顏色遺傳規(guī)律。謝寶貴等[14]分析白色、黃色金針菇Flammulina velutipes雜交品種菇體顏色遺傳規(guī)律，發(fā)現(xiàn)黃色、白色是一對(duì)相對(duì)性狀，受一對(duì)等位基因控制。劉新銳等[15]以柱狀田頭菇Agrocybe cylindracea白色變種Ag.c0002、野生型Ag.c0067 為親本，進(jìn)行兩者原生質(zhì)體單核菌株雜交，結(jié)果表明，柱狀田頭菇菇體顏色是受一對(duì)等位基因控制。盛春鴿等[16]以白黃側(cè)耳Pleurotus cornucopiae的白色菌株CCMSSC00358 及深灰色菌株CCMSSC00406 為試驗(yàn)材料，采用自交、回交的方式研究子實(shí)體顏色遺傳規(guī)律，結(jié)果表明，白黃側(cè)耳的顏色性狀為數(shù)量性狀，灰色對(duì)白色為不完全顯性，由不同位點(diǎn)上的兩對(duì)基因控制。張澤華[17]以桃紅側(cè)耳Pleurotus djamor的粉紅色菌株CCMSSC00450、灰褐色菌株CCMSSC04445 為試驗(yàn)材料，研究其顏色遺傳規(guī)律，將通過原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得的不同交配型的單核菌株配對(duì)雜交得F1 代，根據(jù)F1 子實(shí)體顏色，推斷相對(duì)性狀的顯隱性，再通過單孢回交的方法構(gòu)建測(cè)交群體進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明桃紅側(cè)耳子實(shí)體顏色是由多基因控制。原生質(zhì)體單核化雜交為子實(shí)體顏色遺傳規(guī)律研究以及后續(xù)食用菌育種提供基礎(chǔ)，將不同優(yōu)良性狀組合到雜交子中，根據(jù)市場(chǎng)需求制定育種目標(biāo)，將其應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)際中，為食用菌顏色定向育種提供理論依據(jù)[14-15]。

3.2 選育食用菌優(yōu)良菌株應(yīng)用

隨著食用菌產(chǎn)業(yè)化的不斷發(fā)展，豐富食用菌種質(zhì)資源，培育高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定遺傳的菌株是食用菌育種的重要目標(biāo)之一。王波[3]采用原生質(zhì)體制備技術(shù)獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的黃色金針菇Flammulina velutipes，已大面積用于生產(chǎn)。刑振楠等[12]利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高的香菇Lentinus subnudus菌株，經(jīng)過DUS測(cè)試可以進(jìn)行推廣。

3.3 食用菌雜交育種應(yīng)用

根據(jù)不同的育種目標(biāo)，通過滅活處理原生質(zhì)體進(jìn)行不同屬之間的原生質(zhì)體融合獲得新的重組子，選育出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)雜交新菌株[13]。錢可晴[18]采用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行玉木耳Auricularia cornea與冰糯耳Auricularia heimuer雜交，獲得穩(wěn)定遺傳的純白色黑木耳優(yōu)良菌株，不僅為生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株，也為后續(xù)雜交育種提供優(yōu)良的種質(zhì)資源。SINGH等[2]進(jìn)行雙孢蘑菇Agaricus bisporus、姬松茸Agaricus blazei原生質(zhì)體融合子篩選，并研究?jī)?yōu)質(zhì)融合子的菌絲形態(tài)、生長(zhǎng)速度。陳小紅等[19]為獲得茯苓育種的漆酶轉(zhuǎn)化體系，以靈芝Ganoderma lucidum與茯苓Wolfiporia cocos為試驗(yàn)材料，通過原生質(zhì)體親本滅活處理將靈芝的漆酶基因轉(zhuǎn)入茯苓中獲得優(yōu)良茯苓新菌株。肖在勤等[20]進(jìn)行金針菇Flammulina velutipes與鳳尾菇Pleurotus pulmonarius原生質(zhì)體融合育種，選育出遠(yuǎn)緣原生質(zhì)體融合菌株金鳳221，該結(jié)果引起食用菌界廣泛關(guān)注。蔡佺佑[21]為獲得兼具秀珍菇與巨大口蘑共同優(yōu)良特性的新菌株，進(jìn)行秀珍菇Pleurotus geesteranus與巨大口蘑Tricholoma giganteum的原生質(zhì)體融合育種。鄭錦榮[22]、吳曉華[23]進(jìn)行金針菇Flammulina velutipes、巨大口蘑Tricholoma giganteum原生質(zhì)體融合育種，獲得生長(zhǎng)周期短的巨大口蘑新菌株以及高溫下可以生長(zhǎng)的金針菇新菌株。

4 展 望

原生質(zhì)體融合技術(shù)自應(yīng)用以來備受科研工作者的重視與關(guān)注，科研工作者經(jīng)過不計(jì)其數(shù)的試驗(yàn)獲得許多新品種。通過原生質(zhì)體融合育種雜交獲得穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗蟲的優(yōu)良菌株，能穩(wěn)定遺傳的少之又少[24-25]。并且，仍有很多食用菌品種尚未建立相應(yīng)的雜交體系，不利于原生質(zhì)體融合育種技術(shù)的發(fā)展[26-27]。但隨著分子生物技術(shù)（酯酶同工酶、RAPD、分子標(biāo)記、原生質(zhì)體滅活）在原生質(zhì)體融合領(lǐng)域的發(fā)展，家族間遠(yuǎn)緣雜交將取得重大進(jìn)展，原生質(zhì)體融合技術(shù)也將在食用菌領(lǐng)域迅速發(fā)展[28-29]。