劉換換，楊立春，張成閣，郝自遠(yuǎn)，李火根

（1.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 句容 212400）

YABBY家族是種子植物特有一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，暫未在苔蘚類(lèi)、石松類(lèi)和蕨類(lèi)植物的轉(zhuǎn)錄組和基因組中識(shí)別到Y(jié)ABBY家族的同源序列，在對(duì)植物的早期胚胎發(fā)育、果實(shí)發(fā)育、次生代謝物合成、逆境應(yīng)答、側(cè)生器官分化和背腹極性建立等方面均具有重要作用[1-3]。YABBY家族基因編碼的蛋白具有2個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：N端的Cys2/Cys2（C2C2）鋅指結(jié)構(gòu)域和C端的helix-loop-helix（bHLH），也稱(chēng)為YABBY結(jié)構(gòu)域[4-5]。目前已對(duì)眾多物種的YABBY家族進(jìn)行了成員分析和功能預(yù)測(cè)與驗(yàn)證。擬南芥Arabidopsis thaliana中共6個(gè)YABBY成員：CRABS CLAW（CRC）、YABBY1/FILAMENTOUS FLOWER（FIL）、YABBY2、YABBY3、YABBY5和INNER NO OUTER（INO），共 分 為5個(gè) 亞族：FIL/YABBY3、CRC、INO、YABBY2和YABBY5[6]。其中FIL/YABBY3、YABBY2、YABBY5基因不僅在植株地上部分的遠(yuǎn)軸區(qū)的特異表達(dá)，也在花器官中表達(dá)，如萼片、花瓣、雄蕊和心皮等，但在胚珠中不表達(dá)，因此，這3類(lèi)基因被稱(chēng)為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)YABBY基因（Vegetative genes）；CRC在被子植物的心皮、核心雙子葉植物的蜜腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用，INO參與植物胚珠的發(fā)育調(diào)控，被稱(chēng)為生殖生長(zhǎng)YABBY基因（Reproductive genes）[6-10]。不同物種的YABBY家族成員數(shù)量不同，但其功能與模式植物擬南芥仍然相似。如在單子葉植物玉米Zea mays中YABBY家族成員有13個(gè)，而小麥Triticum aestivum為21個(gè)；在雙子葉植物桃Prunus persica中有6個(gè)，葡萄Vitis vinifera為7個(gè)、石榴Punica granatum為6個(gè)、番茄Solanum Lycopersicon為9個(gè)、辣椒Capsicum annuum則有7～8個(gè)[11-18]。雙子葉植物的YABBY家族成員數(shù)量明顯少于單子葉植物。進(jìn)化研究表明，現(xiàn)存的開(kāi)花植物最后的共同祖先至少有5個(gè)YABBY成員[19]。

水稻Oryza sativa的8個(gè)YABBY成員，分別命名為YABBY1-7和披葉基因DROOPING LEAF（DL），編碼了170～314 aa，均預(yù)測(cè)定位到細(xì)胞核，其外顯子有6～7個(gè)。研究發(fā)現(xiàn)，水稻的YABBY家族出現(xiàn)4次片段重復(fù)事件，表明水稻基因組可能至少經(jīng)歷了2次基因組復(fù)制[20]。玉米YABBY家族的13個(gè)成員ZmYAB1-13同樣具有基因擴(kuò)張現(xiàn)象，ZmYAB1/12是OsDL的同源基因[12]。小麥YABBY家族中的18個(gè)基因編碼了185～297 aa，外顯子數(shù)目為5～7個(gè)。在TaYABBY啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到與植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素誘導(dǎo)和逆境脅迫有關(guān)的順式作用元件，基因具有明顯的組織表達(dá)特異性[21]。桃有6個(gè)YABBY基因，可分為CRC、INO、FIL/YAB3、YAB2和YAB5共5類(lèi)，成員具4～6個(gè)內(nèi)含子，啟動(dòng)子含有大量光應(yīng)答、激素響應(yīng)等順式作用元件，表明該家族基因的表達(dá)可能會(huì)受到環(huán)境、激素等的影響[14]。石榴（6個(gè)）和葡萄（7個(gè)）在進(jìn)化過(guò)程中沒(méi)有YABBY家族基因擴(kuò)張現(xiàn)象[15-16]。石榴YABBY家族成員具有7個(gè)外顯子，與擬南芥相似，結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，將石榴與雙子葉植物：擬南芥、大豆Glycine max、番茄和葡萄，單子葉植物：水稻、菠蘿Ananas comosus和玉米的YABBY家族進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)YABBY5亞族最小，且是雙子葉植物特有的[22]。

鵝掌楸屬Liriodendron隸屬木蘭科Magnoliaceae，主要包括2個(gè)自然種，即鵝掌楸L.chinense和北美鵝掌楸L.tulipifera。鵝掌楸屬植物為基部被子植物，在植物系統(tǒng)發(fā)生中處于關(guān)鍵位置，因此其進(jìn)化關(guān)系、花器官特征、花發(fā)育調(diào)控一直是研究的熱點(diǎn)[23-30]。YABBY家族對(duì)花早期發(fā)育、心皮、雄蕊、蜜腺等花器官發(fā)育調(diào)控均發(fā)揮重要作用，因此對(duì)鵝掌楸屬植物YABBY基因進(jìn)行分析研究是非常必要的。而且相比其他物種，目前在鵝掌楸屬植物中關(guān)于YABBY基因家族的鑒定與功能研究很少。基于此，本研究基于鵝掌楸基因組和北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，擬開(kāi)展北美鵝掌楸YABBY家族的生物信息學(xué)分析，并對(duì)其中的差異表達(dá)基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，以期為進(jìn)一步闡明北美鵝掌楸YABBY的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究所用植物材料為北美鵝掌楸（種源為佐治亞），來(lái)自于江蘇省句容市南京林業(yè)大學(xué)下蜀實(shí)習(xí)林場(chǎng)的鵝掌楸屬種源試驗(yàn)林，地理位置119°14′E，31°59′N(xiāo)。試驗(yàn)林營(yíng)建于1993年，試驗(yàn)林內(nèi)樹(shù)木均已成年。采集北美鵝掌楸根、莖、葉、花瓣、萼片、雄蕊和雌蕊組織，做好標(biāo)記，迅速置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室于超低溫冰箱中-80℃下保存。亞細(xì)胞定位材料為本實(shí)驗(yàn)室保存的本氏煙草Nicotiana benthamiana，pBI121-eGFP表達(dá)載體和P19輔助載體為本實(shí)驗(yàn)室保存的載體。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成

總RNA提取、完整性和濃度檢測(cè)參考天根生化科技有限公司離心柱型多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。按照PrimeScript RT Master Mix (Perfect real time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶日醫(yī)生物科技有限公司）的步驟獲得cDNA。

以反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為克隆目的基因中間片段的模板，根據(jù)北美鵝掌楸RNA-seq數(shù)據(jù)中LtYABBY1,5序列，使用Oligo7軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。配制50 μL反應(yīng)體系：2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix (10 mmol/L each)1 μL，cDNA模板2 μL，引物F/R各2 μL，Phanta Max Super-Fridelity DNA Polymerase 1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL，冰上操作，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸60 s/kb，35個(gè)循環(huán)；72℃徹底延伸5 min。目的片段的切膠回收和連接轉(zhuǎn)化參照EasyPure Quick Gel Extraction Kit試劑盒和pEASY-Blunt Cloning Kit克隆載體試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。挑選片段大小正確的克隆送至上海杰李生物技術(shù)有限公司測(cè)序，使用BioXM 2.6軟件和NCBI網(wǎng)站比對(duì)分析測(cè)序結(jié)果。

表1 擴(kuò)增PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR reactions

1.2.2 北美鵝掌楸LtYABBY1/5基因全長(zhǎng)擴(kuò)增

3′RACE和5′RACE PCR擴(kuò)增分別按照3′-Full RACE Core Set with PrimeScrip RTase Kit和SMARTer RACE5′/3′ Kit試劑盒進(jìn)行，采用巢式PCR反應(yīng)法，引物見(jiàn)表1。將3′RACE和5′RACE Inner PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并切膠回收PCR產(chǎn)物，連接、轉(zhuǎn)化、克隆檢測(cè)、測(cè)序及序列比對(duì)分析與1.2.1相同。

隨后，將中間片段、3′RACE和5′RACE擴(kuò)增得到的序列通過(guò)BioXM 2.6軟件進(jìn)行序列拼接，最終得到LtYABBY1/5基因的全長(zhǎng)。將全長(zhǎng)序列于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的ORF Finder網(wǎng)站進(jìn)行在線(xiàn)預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框（Open reading frame, ORF），根據(jù)預(yù)測(cè)的ORF設(shè)計(jì)引物，驗(yàn)證完整性，引物見(jiàn)表1。其中，LtYABBY5在中間片段擴(kuò)增時(shí)已經(jīng)獲得完整ORF，且測(cè)序正確，因此不需再進(jìn)行ORF驗(yàn)證試驗(yàn)。將驗(yàn)證后的ORF于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST Protein進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，結(jié)合比對(duì)結(jié)果、其他物種的序列以及保守結(jié)構(gòu)域，對(duì)目的基因進(jìn)行命名。

1.2.3 基因生物信息學(xué)分析

基因家族的生物信息學(xué)分析主要參考付鴻博等[31]所用的方法和軟件。通過(guò)ExPASy ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）、ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/） 和SignalP-5.0 Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）在線(xiàn)分析蛋白化學(xué)性質(zhì)、疏水性和信號(hào)肽；通過(guò)TMpred（http://sbcb.bioch.ox.ac.uk/TM_noj/TM_noj.html） 和TMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）在線(xiàn)分析蛋白跨膜區(qū)；通過(guò)SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html） 和SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/）在線(xiàn)預(yù)測(cè)分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；蛋白亞細(xì)胞定位通 過(guò)TargetP1.1 Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-1.1） 和WOLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)；通過(guò)Motif Scan（https://myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan）在線(xiàn)分析蛋白的結(jié)構(gòu)域；通過(guò)DNAMAN軟件進(jìn)行蛋白同源性比對(duì)分析，使用MEGA 10軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以北美鵝掌楸的根、莖、葉、花芽、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊共8個(gè)組織的cDNA為模板，檢測(cè)YABBY1,5基因的組織特異性表達(dá)。首先，使用20 μL體系驗(yàn)證引物的特異性擴(kuò)增：2×Taq Master Mix 10 μL，引物F/R各1 μL，cDNA模板50 ng，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。熱循環(huán)程序：94℃，5 min；94℃，30 s，60℃，30 s，72℃，30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7 min。RT-qPCR試驗(yàn)參照TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)試劑盒操作，配制10 μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，使用ABI Step one plus 熱循環(huán)儀，設(shè)置熱循環(huán)程序：95℃，1 min；95℃，5 s，60℃，34 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn)為95℃，15 s，60℃，1 min，95℃，15 s。以L(fǎng)cActin97作為內(nèi)參基因，使用相對(duì)定量表達(dá)法2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，并用ORIGIN軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。該部分試驗(yàn)步驟、分析方法參考文獻(xiàn)[32]。

1.2.5 亞細(xì)胞定位表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建

通用引物檢測(cè)pBI121-eGFP載體（表1），隨后，按照高純質(zhì)粒DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取質(zhì)粒。載體的酶切位點(diǎn)分別為XbaI、BamHI，體系為50 μL：10×QuickCut Buffer 5 μL，質(zhì) 粒DNA 1 μg，XbaI/BamHI各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL，37℃下反應(yīng)30 min，80℃下酶失活20 min。

使用CE Design軟件分別設(shè)計(jì)LtYABBY1,5基因的雙酶切引物（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得酶切產(chǎn)物。將pBI121-eGFP載體質(zhì)粒酶切產(chǎn)物與目的片段酶切DNA重組，配制20 μL反應(yīng)體系：線(xiàn)性化載體長(zhǎng)度×0.02 ng，插入片段片段長(zhǎng)度×0.04 ng，ExnaseⅡ 2 μL，5×CEⅡ Buffer 4 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL，37℃ PCR反應(yīng)30 min。取10 μL重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、菌落檢測(cè)，將測(cè)序正確、無(wú)變異位點(diǎn)的質(zhì)粒于-20℃下存放備用。

1.2.6 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草及亞細(xì)胞定位觀(guān)察

取5 μL重組質(zhì)粒加入100 μL剛?cè)诨霓r(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101，輕彈混勻，置于冰中20 min，液氮中速凍1 min，37℃下熱激5 min，冰上冰浴5 min，加入250 μL LB培養(yǎng)基，28℃，200 rpm孵育4 h，涂于含Kan抗生素的LB平板28℃下培養(yǎng)48 h。

選擇單克隆菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性克隆即為構(gòu)建完成的瞬時(shí)表達(dá)載體。將瞬時(shí)表達(dá)載體、陽(yáng)性對(duì)照空載體及輔助載體P19分別于雙抗（Kan和利福平抗生素）LB培養(yǎng)基中，28℃，200 rpm培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，4℃，5 000 rpm離心5 min，收集菌體，加入相同體積的緩沖液重懸，將瞬時(shí)表達(dá)載體與輔助載體P19按體積1∶1混合，暗培養(yǎng)2～3 h。用注射器將浸染液注射至本氏煙草葉片背面，暗培養(yǎng)8 h，光照培養(yǎng)2～3 d。剪下約0.3 cm×0.3 cm左右大小的葉盤(pán)，加入DAPI核染料進(jìn)行核染色，約10～15 min，放于載玻片上，葉片背面向上，滴入超純水，蓋上載玻片。于激光共聚焦顯微鏡（LSM710）下觀(guān)察蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 北美鵝掌楸YABB Y家族分析

在北美鵝掌楸的花蜜腺轉(zhuǎn)錄組中共發(fā)現(xiàn)YABBY家族成員6個(gè)，經(jīng)過(guò)蛋白家族數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein family, PFAM）（Pfam: PF04690）、保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（Conserved domain database,CDD）和基序序列預(yù)測(cè)（Multiple Em for Motif Elicitation, MEME）網(wǎng)站的分析，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)序列（Lchi07520）的結(jié)構(gòu)域不完整，故將其刪除，對(duì)剩余5個(gè)YABBY家族成員進(jìn)行后續(xù)分析。5個(gè)基因編碼的蛋白序列長(zhǎng)度為164～212 aa，外顯子數(shù)量為6～7個(gè)。Lchi28144僅有6個(gè)外顯子，其編碼的氨基酸長(zhǎng)度僅為164個(gè)，比其他成員短（表2），因此推測(cè)該基因編碼區(qū)部分缺失。根據(jù)Nr數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果，他們可能屬于YABBY1/FIL、YABBY2和YABBY5亞族。

表2 北美鵝掌楸YABBY家族基因概況Table 2 Identification of the YABBY family genes based on the RNA-seq and genome data of L.tulipifera

獲得北美鵝掌楸YABBY家族成員的氨基酸序列后，對(duì)其進(jìn)行序列比對(duì)。并在Plant TFDB數(shù)據(jù)庫(kù)（Plant transcription factors database）下載擬南芥YABBY家族成員的氨基酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，為北美鵝掌楸YABBY家族成員命名及分類(lèi)提供依據(jù)。由序列比對(duì)結(jié)果可知，Lchi28144基因在5′端序列缺失22 aa，這也解釋了該基因外顯子個(gè)數(shù)比其他成員少1個(gè)，說(shuō)明北美鵝掌楸YABBY家族成員的外顯子數(shù)量和長(zhǎng)度是比較保守的，外顯子均為7個(gè)（圖1A）。擬南芥的YABBY家族共6個(gè)成員，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，Lchi01041和Lchi01043屬 于YABBY5亞 族，Lchi28144屬于YABBY2亞 族，Lchi23476和Lchi24373屬 于YABBY1/FIL亞族（圖1B）。

圖1 北美鵝掌楸YABBY家族氨基酸序列比對(duì)（A）及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建（B）Fig.1 Alignment of the CDS sequences (A) and the phylogenetic tree of YABBY proteins of L.tulipifera and A.thaliana (B)

北美鵝掌楸YABBY家族的保守結(jié)構(gòu)域和Motif分析是在CDD和MEME網(wǎng)站進(jìn)行，將結(jié)果文件導(dǎo)出后使用TB tools進(jìn)行后續(xù)分析和繪圖。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，5個(gè)成員均屬于YABBY家族（圖2A—B）。Motif分析結(jié)果顯示5個(gè)成員均含有Motif1和Motif3，Lchi28144的5′端無(wú)Motif2，推測(cè)由于序列不全導(dǎo)致。同一亞族的基因結(jié)構(gòu)相似，如Lchi23476和Lchi24373結(jié)構(gòu)相似，但與其他亞族基因結(jié)構(gòu)不同。Motif2代表C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域的主要序列，Motif1代表YABBY結(jié)構(gòu)域的主要序列（圖2C）。

圖2 北美鵝掌楸YABBY家族進(jìn)化樹(shù)（A）及結(jié)構(gòu)域和基序分析（B, C）Fig.2 Phylogenetic trees (A), distribution of conserved domains and motifs (B, C) of YABBY proteins in L.tulipifera

2.2 北美鵝掌楸YABBY1,5基因全長(zhǎng)克隆

根據(jù)北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的表達(dá)量，選擇2個(gè)差異表達(dá)顯著的YABBY家族基因進(jìn)行 克 ?。篖chi23476（LtYABBY1）和Lchi01041（LtYABBY5），獲得全長(zhǎng)并分析蛋白的理化性質(zhì)。在擴(kuò)增LtYABBY5基因的中間片段時(shí)，已獲得完整ORF序列且序列正確，因此無(wú)須再進(jìn)ORF驗(yàn)證試驗(yàn)（圖1）。

LtYABBY1和LtYABBY5基因全長(zhǎng)為1 255和1 078 bp，ORF分 別 為633和558 bp，分 別 編碼了210和185 aa。2個(gè)蛋白均為親水性蛋白，LtYABBY1蛋白總分子式為C1031H1613N295O307S9，分子量為23 341.48 Da，理論等電點(diǎn)為7.14，疏水性平均值為-0.312。LtYABBY5蛋白總分子式為C913H1439N261O273S14，分子量為20 888.89 Da，理論等電點(diǎn)為8.13，疏水性平均值為-0.295。

2.3 北美鵝掌楸YABBY1,5基因生物信息學(xué)分析

采用ProtScale在線(xiàn)軟件分析北美鵝掌楸YABBY蛋白疏水性，結(jié)果顯示LtYABBY1、LtYABBY5均為親水蛋白（圖2A）。分別通過(guò)ExPASy TMpred和TMHMM在線(xiàn)分析2個(gè)蛋白的跨膜區(qū)、跨膜方向，ExPASy TMpred結(jié)果表明，預(yù)測(cè)LtYABBY1、LtYABBY5均具有1個(gè)跨膜區(qū)，但TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，2個(gè)YABBY蛋白無(wú)跨膜區(qū)域。結(jié)合二者結(jié)果，北美鵝掌楸LtYABBY1、LtYABBY5為非跨膜蛋白（圖2B—C）。

登錄SOPMA和SWISS-MODEL網(wǎng)站在線(xiàn)預(yù)測(cè)YABBY蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。YABBY1蛋白的α螺旋占22.86%，延伸鏈占11.90%，β轉(zhuǎn)角占4.29%，無(wú)規(guī)則卷曲占60.95%。YABBY5蛋白的α螺旋占24.32%，延伸鏈占17.30%，β轉(zhuǎn)角占5.41%，無(wú)規(guī)則卷曲占52.97%。

采用在線(xiàn)軟件SignalP-4.0 Server預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽，發(fā)現(xiàn)北美鵝掌楸的2個(gè)YABBY蛋白均不含信號(hào)肽及切割位點(diǎn)。蛋白亞細(xì)胞定位通過(guò)TargetP1.1 Server和WOLF PSORT在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)LtYABBY1亞細(xì)胞定位結(jié)果為細(xì)胞核，LtYABBY5則是在細(xì)胞核、胞溶酶體等細(xì)胞器中均有定位，需要結(jié)合亞細(xì)胞定位試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的結(jié)果（表3～4）。

表3 北美鵝掌楸YABBY蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析（TargetP1.1 Serve）Table 3 Prediction of the subcellular localization of YABBY proteins by the TargetP1.1 Serve online software %

表4 北美鵝掌楸YABBY蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析（WOLF PSORT）Table 4 Prediction of YABBY protein subcellular localization by WOLF PSORT online software

共下載14個(gè)與LtYABBY1同源性較高的蛋白序列，分別為麻雀花ArCRC（Aristolochia ringens，QKK36214.1）、沉水樟CmYABBY4（RWR87502.1）、蠟梅CpFIL（Chimonanthus praecox，AYO86708.1）、蓮NnYABBY4（XP_010264212.1）、橡膠樹(shù)HbYABBY1、HbYABBY4（XP_021635450.1、XP_021666324.1）、 葡 萄VvYABBY4（XP_002266233.1）、 木 薯MeYABBY1（XP_021622938.1）、可可樹(shù)TcYABBY1（Theobroma cacao，XP_007039924.1）、河岸葡萄VrYABBY1（XP_034702735.1）、黃麻CcYABBY（Corchorus capsularis，OMP02209.1）、博落回McYABBY（OVA06720.1）、開(kāi) 心 果PvYABBY1（Pistacia vera，XP_031267772.1）、雷蒙德氏棉GrYABBY1（XP_012439507.1），他們之間的同源性高達(dá)88.21%。15個(gè)與LtYABBY5同源性較高的蛋白序列，分別為葡萄VvYABBY5（XP_002285328.1）、蠟梅CpYABBY5-1（AYO86711.1）、蓮NnYABBY 5（XP_010254434.1、XP_010250140.1、XP_010250138.1、XP_010250139.1）、 木 薯MeYABBY5（XP_021634503.1）、 沉水樟CmYABBY5（RWR77395.1）、哥倫比亞錦葵HuYABBY5（XP_021275879.1）、黃麻CcYABBY（OMO81141.1）、可可樹(shù)TcYABBY（EOY31098.1、XP_007013479.2）、 榴 蓮DzYABBY5（Durio zibethinus，XP_022730873.1）、麻風(fēng)樹(shù)JcYABBY5（XP_012078813.1）、橡膠樹(shù)HbYABBY5（XP_021650878.1），他們的同源性達(dá)81.34%。LtYABBY1和LtYABBY5蛋白均具有完整的C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域（C-X2-C-X20-C-X1-H-C）和YABBY結(jié)構(gòu)域（圖3A—B）。

圖3 北美鵝掌楸YABBY蛋白的氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Multiple alignment of the amino acid sequences of LtYABBY with other YABBY proteins

將北美鵝掌楸YABBY1,5蛋白與同源性較高的蛋白、擬南芥6個(gè)成員進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，共31個(gè)蛋白序列（圖4）。結(jié)果顯示，LtYABBY1與麻雀花、蠟梅、沉水樟親緣關(guān)系較近，LtYABBY5與蓮、蠟梅、沉水樟的YABBY5蛋白親緣關(guān)系較近。

圖4 北美鵝掌楸YABBY蛋白的進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建Fig.4 Construction of the phylogenetic tree of LtYABBY with other YABBY proteins

2.4 組織表達(dá)特異性分析

對(duì)北美鵝掌楸LtYABBY1,5基因進(jìn)行半定量PCR分析，其中，LtYABBY1基因在葉片、花芽、萼片和雌蕊中均有較亮條帶，而LtYABBY5基因僅在根和莖中無(wú)條帶，在其他6個(gè)組織中均有表達(dá)（圖5A）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，LtYABBY1基因整體表達(dá)水平較高，尤其在花芽和雌蕊中大量表達(dá)，葉片和萼片中表達(dá)水平也較高，與半定量PCR結(jié)果一致，在花瓣中也有一定表達(dá)，莖次之；LtYABBY5基因整體表達(dá)水平較低，在葉片、花芽、雌蕊和萼片中均有少量表達(dá)（圖5B）。

圖5 北美鵝掌楸YABBY-like基因在不同組織中的表達(dá)量Fig.5 Detection of the expression of YABBY-like genes of L.tulipifera in different tissues

2.5 LtYABBY1,5亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞定位采用注射本氏煙草葉片的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化表達(dá)法，取注射后的葉片于載玻片上，葉背面朝上，置于激光共聚焦顯微鏡下拍攝。根據(jù)北美鵝掌楸YABBY蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果，推測(cè)LtYABBY1,5蛋白為核定位，因此對(duì)注射后的煙草葉片進(jìn)行DAPI染色，觀(guān)察時(shí)共使用5個(gè)通道，分別為DAPI、GFP自發(fā)熒光、明場(chǎng)Bright field、葉綠素?zé)晒釩hlorophyll和疊加場(chǎng)Merged。pBI121-eGFP為空載陽(yáng)性對(duì)照，在細(xì)胞膜、細(xì)胞核、葉綠體等細(xì)胞器均可看到其熒光。LtYABBY1,5蛋白僅在細(xì)胞核上檢測(cè)到熒光信號(hào)，二者為核定位蛋白（圖6）。

圖6 北美鵝掌楸YABBY1,5蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.6 The subcellular localization of LtYABBY1 and LtYABBY5 proteins

3 討 論

北美鵝掌楸中共鑒定到6個(gè)YABBY成員，屬于YABBY1/FILAMENTOUS FLOWER (FIL)、YABBY2、YABBY5共3個(gè)亞族，說(shuō)明本物種中YABBY家族沒(méi)有發(fā)生基因擴(kuò)張。LtYABBYs基因編碼了164～212個(gè)氨基酸，與前人研究發(fā)現(xiàn)YABBY蛋白較小的結(jié)果一致。預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，符合轉(zhuǎn)錄因子的特性。外顯子數(shù)量為7個(gè)，與已有研究的物種相似，說(shuō)明YABBY家族的結(jié)構(gòu)較為保守，推測(cè)功能也相對(duì)保守。

與擬南芥的5個(gè)亞族相比，北美鵝掌楸缺失CRC、INO亞族，二者均為花特異性YABBY基因，主要參與植物胚珠、心皮的發(fā)育調(diào)控[9-10]。CRC是在擬南芥中識(shí)別的首個(gè)與蜜腺發(fā)育密切相關(guān)的關(guān)鍵基因，crc突變體的蜜腺缺失，心皮不融合，果莢變粗變短[4,9]。水稻OsDL基因是AtCRC的同系物，其功能得到了深入研究，參與水稻花器官、葉片和芒的發(fā)育，dl突變體會(huì)導(dǎo)致心皮發(fā)育成雄蕊，葉片不能形成中脈[33]。毛茛目花菱草Eschscholtzia californica CRC同源基因在花發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中表達(dá)，但在花開(kāi)放期，僅在雌蕊中表達(dá)[34]?；勘蛔又参餆o(wú)油樟Amborella trichopoda的雌花中CRC同源基因的表達(dá)模式與其他被子植物中的表達(dá)模式相似，在雄花花絲中也鑒定出了AmbCRC轉(zhuǎn)錄本[35]。大多數(shù)木蘭類(lèi)植物的CRC位于單子葉植物和雙子葉植物分支的基部，推測(cè)在單子葉植物和真雙子葉植物最近的共同祖先中可能發(fā)生重復(fù)事件，木蘭類(lèi)植物與被子植物分離后CRC亞族發(fā)生了亞功能化和新功能化[36]。CRC亞族在心皮發(fā)育調(diào)控中的功能可能是被子植物中較原始的功能，其在蜜腺中的作用可能是進(jìn)化而來(lái)[2]。本研究在北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組和鵝掌楸的基因組數(shù)據(jù)中沒(méi)有識(shí)別到CRC亞族基因，推測(cè)可能與植物的進(jìn)化過(guò)程相關(guān)。

北美鵝掌楸LtYABBY1在花芽和雌蕊中表達(dá)量極高，與水稻的YABBYs基因表達(dá)模式相似，說(shuō)明北美鵝掌楸的YABBY1基因可能具有參與雌蕊形成和花器官發(fā)育的功能。綠竹Bambusa oldhamiiBoYAB1基因編碼167 aa，與水稻OsYABBY1的同源性為88.76%，異源表達(dá)分析和原位雜交結(jié)果表明，該基因可能參與了葉片發(fā)育和開(kāi)花時(shí)間的調(diào)控[37]。玉米YABBY家族的ZmYAB1/12是水稻OsDL的同源基因，其表達(dá)具有明顯的組織特異性，除了ZmYAB1不在雌穗表達(dá)外，其余成員在生殖器官中的表達(dá)量均明顯高于營(yíng)養(yǎng)器官。ZmYAB5/7/9/13基因整體表達(dá)水平比較高，而ZmYAB3/4/8基因則幾乎不表達(dá)[12]。北美鵝掌楸LtYABBY1基因整體表達(dá)水平較高，尤其是在繁殖器官花芽、雌蕊中大量表達(dá)。而LtYABBY5基因整體表達(dá)水平較低，與玉米的表達(dá)模式不同，具有物種特異性，不同植物間表達(dá)模式明顯不同，但在繁殖器官表達(dá)量是高于營(yíng)養(yǎng)器官的。通過(guò)研究木蘭類(lèi)植物的YABBY家族發(fā)現(xiàn)YABBY5不是雙子葉植物所特有的，在7個(gè)木蘭類(lèi)植物中鑒別到22個(gè)YABBY5基因，說(shuō)明YABBY5基因存在于基部被子植物、木蘭類(lèi)植物和真雙子葉植物中，YABBY基因可能是來(lái)源于早期被子植物的YABBY5基因[36]。番茄SlYABBY5基因編碼182 aa，預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞核，結(jié)果初步證實(shí)SlYABBY5參與番茄的生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)非生物逆境脅迫[38]。小麥的YABBY家族成員在根中表達(dá)量偏低或不表達(dá)，在穗部和籽粒中的表達(dá)量高于其余組織，TaYAB1/2/6在穗部的表達(dá)量隨時(shí)間推移逐漸上升，TaYAB3/4/5在穗部的表達(dá)量隨時(shí)間推移呈下降趨勢(shì)[21]。小麥與北美鵝掌楸的YABBY基因表達(dá)模式有相似的地方，在營(yíng)養(yǎng)器官中低表達(dá)。水稻的YABBY7主要在雌蕊中特異性表達(dá)，這表明YABBY7可能參與調(diào)控雌蕊的形成，YABBY1/2/6主要在花、葉鞘和胚乳中表達(dá)，YABBY3/4/5也主要在花器官和胚胎中表達(dá)[20]。以上研究結(jié)果表明，被子植物中YABBY家族成員的結(jié)構(gòu)和功能比較保守，但在進(jìn)化過(guò)程中基因也表現(xiàn)出了結(jié)構(gòu)和功能的多樣性。

本研究中北美鵝掌楸共鑒定到6個(gè)YABBY成員，僅克隆和分析了其中2個(gè)基因，其他成員未進(jìn)行進(jìn)一步分析。經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)LtYABBY1在花芽中特異表達(dá)，推測(cè)該基因可能參與了北美鵝掌楸花芽的早期分生組織的發(fā)育調(diào)控，但是后續(xù)功能驗(yàn)證試驗(yàn)尚未開(kāi)展。北美鵝掌楸為蜜源植物，花蜜量豐富，目前已鑒定到Y(jié)ABBY家族的CRC基因?qū)γ巯侔l(fā)育極其重要，但卻未在北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)該成員，原因仍需要進(jìn)一步分析。下一步研究工作將繼續(xù)對(duì)YABBY家族成員進(jìn)行分析、鑒定和功能分析，以期為北美鵝掌楸發(fā)育調(diào)控提供理論支持。

4 結(jié) 論

北美鵝掌楸YABBY家族共6個(gè)成員，編碼了164～212 aa，外顯子7個(gè)，屬于YABBY1/FILAMENTOUS FLOWER (FIL)、YABBY2、YABBY5共3個(gè)亞類(lèi)。克隆LtYABBY1,5基因的全長(zhǎng)1 255、1 078 bp，分別編碼了210、188 aa，均為親水蛋白與非跨膜蛋白。LtYABBY1和LtYABBY5為核定位蛋白。LtYABBY1在北美鵝掌楸的花芽和雌蕊高表達(dá)，LtYABBY5整體表達(dá)水平較低，據(jù)此推測(cè)LtYABBY1可能參與了北美鵝掌楸花芽的早期分生組織的發(fā)育調(diào)控。