仝凱旋, 蓋麗娟, 霍思宇, 謝瑜杰, 吳興強,范春林, 陳 輝*,, 呂美玲

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.北京合眾恒星檢測科技有限公司，北京 100176；3.安捷倫科技 (中國) 有限公司，北京 100102)

農(nóng)藥殘留分析黃金標準的三重四極桿質(zhì)譜是農(nóng)殘檢測的首選[1]，但在使用多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)時需要使用標準溶液預(yù)先編輯每種目標化合物的采集方法，再加上分辨率較低，導(dǎo)致同時檢測的農(nóng)藥數(shù)量上受到很大限制[2]，因此為了提高復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的檢測能力，高分辨質(zhì)譜(HRMS)正日益成為各實驗室的常用監(jiān)測手段[3]。

質(zhì)量分辨率對于避免假陰性和假陽性結(jié)果以及提高定量準確性非常重要[4]。與三重四極桿質(zhì)譜相比，高分辨質(zhì)譜主要在分辨率和質(zhì)量精度方面有了大幅度提升，可以在全掃描模式下有著與三重四極桿相同或更高的靈敏度和選擇性[5-6]，更重要的是通過全掃描模式采集的數(shù)據(jù)不僅可以通過已有數(shù)據(jù)庫進行靶向性分析，還可以通過解卷積對未知化合物進行非靶向篩查，大大提高了風險發(fā)現(xiàn)能力[4]。高分辨質(zhì)譜在提高靈敏度方面更多的是優(yōu)化采集模式[7-8]。除了優(yōu)化采集模式，篩查參數(shù)的優(yōu)化也可以有效提高檢測效果[9]。但在報道的應(yīng)用高分辨質(zhì)譜進行農(nóng)藥殘留篩查的文獻中，尚未見對篩查參數(shù)進行優(yōu)化的報道。為此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，以歐盟農(nóng)殘檢測能力驗證定量篩查項目中涉及的適用液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測的173 種農(nóng)藥為例，選擇洋蔥基質(zhì)，重點對應(yīng)用LC-QTOF/MS 進行篩查時的篩查參數(shù)，包括離子個數(shù)選擇模式，共流出匹配得分 (co-elution score) 以及峰高閾值進行了優(yōu)化，并將優(yōu)化后的篩查參數(shù)應(yīng)用于2020 年歐盟組織的水果蔬菜中農(nóng)藥殘留檢測能力驗證。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

173 種農(nóng)藥標準品：純度≥98% (天津阿爾塔科技有限公司)；甲酸和乙酸銨為質(zhì)譜純 (美國Fisher 公司)；乙腈和甲苯為色譜純 (美國Fisher 公司)；乙酸和氯化鈉、無水硫酸鈉和無水硫酸鎂均為分析純 (北京化工廠)；Carbon/NH2柱 (美國Agilent 公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290 Infinity II LC-6545 Q-TOF/MS 液質(zhì)聯(lián)用儀，配有雙噴射電噴霧離子源 (美國Agilent公司)；SR-2DS 水平振蕩器 (日本TATEC 公司)；KDC-40 低速離心機 (中國安徽中佳公司)；AH-30 全自動均質(zhì)儀、Fotector Plus 高通量全自動固相萃取儀和MPE 高通量真空平行濃縮儀 (中國廈門?？苾x器有限公司)；N-EVAP 112 氮吹濃縮儀(美國Organomation Associates 公司)；Milli-Q 超純水機 (美國Millipore 公司)；PL602-L 電子天平 (瑞士Mettler-Toledo 公司)。

1.3 標準溶液的配制

分別稱取10 mg (精確至0.01 mg) 各農(nóng)藥標準品于10 mL棕色容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 的標準儲備液，于 -18 ℃避光保存；使用時根據(jù)需要，移取適量儲備液，用甲醇稀釋，配制所需濃度的標準工作液，于4 ℃避光保存。

1.4 樣品前處理

參照文獻方法提取[10]：稱取洋蔥樣品10 g，置于80 mL 離心管中，加入含體積分數(shù)1%乙酸的乙腈溶液40 mL，于2000g下均質(zhì)1 min；加入1 g 氯化鈉，4 g 無水硫酸鎂，振蕩10 min，在3 150g下離心5 min；取上清液20 mL，置于平行濃縮儀上于37 ℃、150 r/min 條件下蒸發(fā)濃縮至約2 mL (待凈化)。

凈化：在Carbon/NH2柱中加入約2 cm 高的無水硫酸鈉，放到自動固相萃取儀上，先用4 mLV乙腈:V甲苯=3 : 1 混合溶劑淋洗固相萃取 (SPE)柱，棄去流出液，再用2 mL 上述溶劑洗滌樣液瓶3 次，并將洗滌液移入Carbon/NH2柱中。最后再用25 mL 上述溶劑洗脫，合并洗脫液于試管中。置于平行濃縮儀上于37 ℃、150 r/min 條件下蒸發(fā)濃縮至約0.5 mL，用氮氣吹干，加入1 mL的V乙腈:V水=3 : 2 溶液，混勻，經(jīng)0.2 μm 濾膜過濾，定容至1 mL 待測。

1.5 儀器檢測條件

色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱 (100 mm ×2.1 mm，3.5 μm)；柱溫40 ℃；進樣體積5 μL。流動相A 相為體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液 (含5 mmol/L乙酸銨)，B 相為乙腈。洗脫程序：0 min，1%B；3 min，30%B；6 min，40%B；9 min，40%B；15 min，60%B；19 min，90%B；23 min，90%B；23.01 min，1%B，保持4 min。流速0.4 mL/min。

質(zhì)譜條件：Dual AJS ESI 源；正離子全掃描；全掃描范圍m/z50～1000；毛細管電壓4000 V；霧化氣體為氮氣；霧化氣壓力0.14 MPa；鞘氣溫度375 ℃；鞘氣流速11.0 L/min；干燥氣流速12.0 L/min；干燥氣溫度325 ℃；碎裂電壓145 V。

All Ions MS/MS 模式條件可以選擇多個碰撞能量通道進行采集，0～0.5 min 時，碰撞能設(shè)置為0 V；0.5 min 時，碰撞能分別為0、15 和35 V，碰撞能為0 V 時可以獲得加合離子或前體離子的信息，設(shè)置為15 和35 V 可以獲得二級質(zhì)譜信息。

1.6 定性和定量分析

使用Qualitative workflows 軟件進行定性分析，對加合離子質(zhì)量偏差和保留時間偏差，二級碎片離子選擇個數(shù)及其與加合離子保留時間偏差、信噪比、共流出匹配得分和峰高等參數(shù)設(shè)置后與個人化合物數(shù)據(jù)庫與譜庫(PCDL)進行匹配，軟件自動給出定性結(jié)果。

根據(jù)定性結(jié)果，在MassHunter 定量軟件中建立定量方法，將樣品中的陽性化合物與基質(zhì)中添加的標準品進行比對進一步確證，對于確證的化合物，用外標法進行定量。

2 結(jié)果與討論

根據(jù)歐盟SANTE/11312/2021 指南中對液相色譜-高分辨質(zhì)譜定性確證的要求[11]，對定性離子個數(shù)的選擇、共流出匹配得分和峰高閾值3 個篩查參數(shù)進行了優(yōu)化。

2.1 離子個數(shù)選擇模式優(yōu)化

本研究優(yōu)化了質(zhì)譜庫中最大特征離子數(shù)量，從2 選1 到6 選1，最終篩查出的化合物個數(shù)如圖1 所示，隨著可選特征離子數(shù)量的增加，陽性檢出的化合物數(shù)量也隨之增加，當選擇離子數(shù)為5 選1 和6 選1 時，考察的173 種農(nóng)藥均可陽性檢出。這是因為當可選離子數(shù)量少時，由于基質(zhì)效應(yīng)等原因，豐度高的離子也可能受到干擾未檢出，這就使得該化合物未滿足篩查需求出現(xiàn)假陰性。例如，氟啶蟲胺腈在2 選1 模式下未篩出，當可選離子數(shù)在3 個以上時則可以篩出。霜脲氰和異噁唑草酮在3 選1 模式下未篩出，可選離子在4 個以上則可以篩出。氟樂靈在4 選1 模式下未篩出，可選離子在5 個以上時才可篩出。如果繼續(xù)增加可選離子個數(shù)，在實際篩查中陽性檢出化合物個數(shù)不一定增加，反而篩查時間隨之增長。同時也比較了5 選2 模式下的篩查情況，僅有160 種農(nóng)藥陽性檢出，說明合格碎片離子最小數(shù)量設(shè)定越高越不利于化合物陽性檢出。因此，選擇最大特征離子數(shù)為5 選1 作為最優(yōu)篩查參數(shù)。

圖1 質(zhì)譜庫中最大特征離子數(shù)量對化合物篩查的影響Fig.1 Effect of maximum number of characteristic ions in mass spectrometry library on compound screening

2.2 共流出匹配得分優(yōu)化

共流出匹配得分同樣是化合物篩查時的重要參數(shù)之一。在所選的All ions MS/MS 采集模式下，所有通過質(zhì)譜碰撞池的分子加合離子被施加低、中、高不同的碰撞能量。低能量(0 V)下, 分子加合離子保持原有狀態(tài)；在中高能量下，加合離子碎裂成碎片離子。對于同一化合物，都是經(jīng)過相同的色譜柱，因此色譜流出曲線是相同的，因而提取不同碰撞能下同一化合物的分子加合離子和碎片離子的色譜流出曲線是一致的[12]。根據(jù)這一特征，可以對兩類離子通過解卷積進行歸屬，當二者的歸一化色譜流出曲線完全重合時共流出匹配得分設(shè)為100 分。實際采集中，由于加合離子強度和碎片離子強度可能存在較大的差異，尤其在色譜峰的起點和落點，碎片離子可能存在因強度低未檢出的情形，這時的共流出匹配得分會較低。另外，基質(zhì)的復(fù)雜程度也會影響碎片離子色譜峰的提取，因此需要通過對一系列目標化合物的提取選擇合適的共流出匹配得分以便自動化篩查。圖2 為啶蟲脒的離子共流出匹配得分示意圖。

圖2 啶蟲脒的離子共流出匹配得分圖Fig.2 The ion co-elution diagram of acetamiprid

圖3 給出了不同共流出匹配得分參數(shù)設(shè)置下，洋蔥中173 種農(nóng)藥陽性檢出情況。從圖3 可以看出，隨著對碎片離子共流出匹配得分閾值設(shè)置的提高，假陰性檢出的農(nóng)藥數(shù)量也隨之增多，共流出匹配得分為10 時假陰性率為0，當共流出匹配得分設(shè)為90 時假陰性率增至11.6%。例如，保棉磷、毒死蜱、霜脲氰等11 種化合物只在共流出匹配得分設(shè)為90 時未檢出，氟喹唑和戊唑醇在共流出匹配得分設(shè)為45 及以下時才能檢出，辛硫磷和氟樂靈在共流出匹配得分30 及以下才能檢出，甲萘威、甲硫威砜、稻豐散、三唑醇和異噁唑草酮則需要將共流出匹配得分設(shè)為10 才可檢出。因此，本研究將碎片離子的共流出匹配得分設(shè)置為10。雖然較低的共流出匹配得分可能會增加篩出農(nóng)藥數(shù)量，導(dǎo)致在實際樣品中出現(xiàn)假陽性，從而增加數(shù)據(jù)處理時間，但可以最大程度地降低篩查未知化合物時的假陰性率。

圖3 共流出匹配得分對化合物篩查的影響Fig.3 Effect of co-elution score on compound screening

2.3 峰高閾值優(yōu)化

在進行化合物篩查時可以在峰高過濾器設(shè)置絕對峰高或者絕對峰面積閾值，只有當目標化合物的峰高或峰面積超過設(shè)定閾值時才會陽性檢出。本研究選擇優(yōu)化100、1000、5000 和10 000共4 個絕對峰高值，具體陽性檢出和假陰性情況見圖4，當峰高過濾器的絕對峰高值設(shè)為10 000時假陰性率達到7.5%，當峰高值降低至5000 時，假陰性率降至2.9%，此時保棉磷、丙硫磷等8 種農(nóng)藥才可檢出；而當絕對峰高設(shè)為100 和1000 時無假陰性結(jié)果，此時丙硫菌唑、氟啶蟲酰胺、甲基立枯磷、甲基異柳磷和霜脲氰才可檢出。雖然絕對峰高值為100 和1000 時陽性檢出化合物個數(shù)相等，但峰高閾值設(shè)置越高，假陽性化合物出現(xiàn)頻次越低，可以減少數(shù)據(jù)處理的時間。為了減少實際樣品篩查時假陽性率，綜合考慮，選用絕對峰高值1000 為最優(yōu)篩查參數(shù)。

圖4 峰高閾值對化合物篩查的影響Fig.4 Effect of peak height threshold on compound screening

3 方法學(xué)驗證

3.1 標準曲線、篩查限與定量限

通過向洋蔥空白樣品中添加173 種農(nóng)藥混合標準工作溶液，建立了5 點基質(zhì)匹配標準曲線，以加合離子峰作為定量離子峰，在前述色譜-質(zhì)譜條件下進行測定，并用優(yōu)化后的最優(yōu)篩查參數(shù)進行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果表明，所考察的農(nóng)藥化合物在試驗濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以應(yīng)用于定量分析。173 種農(nóng)藥線性情況及決定系數(shù)見表1。

表1 173 種農(nóng)藥的篩查限、定量限、線性范圍、決定系數(shù)、回收率及相對標準偏差(n=5)Table 1 Screening detection limits (SDLs), limit of quantification (LOQ), linear range, R2, recovery and RSD of 173 pesticides (n=5)

續(xù)表1Table 1 (Continued)

續(xù)表1Table 1 (Continued)

續(xù)表1Table 1 (Continued)

方法的篩查限是基于SANTE/11312/2021 的要求，不同添加水平下，每個水平重復(fù)20 次，某個水平下有95%以上樣品能被篩查出，則認為該水平為此化合物的篩查限。173 種農(nóng)藥的篩查限見表1，其中有167 種農(nóng)藥的篩查限在0.001～0.005 mg/kg 之間，占全部目標化合物的96.5%，其余化合物的篩查限在0.01～0.025 mg/kg 之間，表明該方法有著較高的靈敏度。

通過向洋蔥空白樣品中添加不同水平的混合標準工作溶液，將信噪比≥10 對應(yīng)的添加水平定為目標化合物的定量限(LOQ)，具體見表1，則添加的173 種農(nóng)藥中有167 種的LOQ ≤ 0.01 mg/kg，其余化合物的LOQ 在0.05 mg/kg 以下。需要指出的是，由于篩查限的確定方法跟傳統(tǒng)的篩查限 (信噪比 ≤ 3) 確定方法不同，因此表1 中篩查限和定量限之間不存在明確的數(shù)學(xué)關(guān)系，但所有篩查限均不大于該化合物在所測基質(zhì)中的定量限。

3.2 方法的回收率與重復(fù)性

采用空白洋蔥樣品作為驗證基質(zhì)，進行0.01、0.02 和0.1 mg/kg 3 個水平的添加回收試驗，采用1.4 節(jié)方法進行樣品前處理，以及1.5 節(jié)的儀器方法進行樣品檢測，每個添加水平重復(fù)5 次，則洋蔥基質(zhì)中173 種農(nóng)藥在3 個添加水平下分別有153、168 和165 種農(nóng)藥的平均回收率在70%～120%之間，所有農(nóng)藥的相對標準偏差均在20%以內(nèi)，表明該方法適用于洋蔥基質(zhì)中，詳細結(jié)果見表1。

4 歐盟能力驗證樣品測定

為了進一步驗證本研究所建立的篩查和定量方法的準確性和可靠性，筆者實驗室參加了2020 年歐盟組織的洋蔥中農(nóng)藥殘留能力驗證 (EUPT-FV22)[13]。

EUPT-FV22 提供強制農(nóng)藥清單與自愿農(nóng)藥目標清單，組織者從清單列表中選擇20 種左右農(nóng)藥添加到洋蔥樣品中，參加實驗室首先對洋蔥樣品中農(nóng)藥殘留進行定性篩查，隨后需要對篩查結(jié)果準確定量后進行上報。

按照前述最佳篩查參數(shù)對洋蔥樣品采集數(shù)據(jù)進行分析，共定性篩查出15 種農(nóng)藥，將這些農(nóng)藥導(dǎo)入定量軟件中再次確認后，用5 點基質(zhì)匹配標準曲線進行準確定量，結(jié)果見表2。除殺線威由于多個參與實驗室上報結(jié)果偏差過大，穩(wěn)健值較低而取消評價外，其余農(nóng)藥平均z 得分的絕對值均小于1.2，符合EUPT 規(guī)定的對定量結(jié)果的要求。

根據(jù)EUPT-FV22 組織方反饋的結(jié)果，此次能力驗證共添加19 種農(nóng)藥，17 種農(nóng)藥來自于強制清單，2 種來自于自愿清單，實際評價農(nóng)藥16 種(強制清單中殺線威不參與評價，自愿清單農(nóng)藥均不參與評價)。共有176 個實驗室參加該能力驗證，全部檢出19 種農(nóng)藥的有17 個實驗室，全部檢出所有17 種強制清單農(nóng)藥的有95 個實驗室。筆者實驗室檢出了全部19 種農(nóng)藥 (除表2 外，另有4 種農(nóng)藥，包括氯硝胺和咯菌腈結(jié)果為LCQTOF/MS 在ESI 負模式下測得，氯苯胺靈和七氟菊酯結(jié)果由氣相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜測得，均不在本文討論)，無假陽性，屬于A 類良好實驗室，表明本次優(yōu)化的篩查方法適合應(yīng)用于洋蔥基質(zhì)。

表2 EUPT-FV22 最終上報結(jié)果Table 2 The final report results of EUPT-FV-22

5 結(jié)論

本研究以洋蔥中173 種農(nóng)藥篩查為例，通過對篩查參數(shù)中的離子個數(shù)選擇模式、共流出匹配得分以及峰高閾值進行優(yōu)化，應(yīng)用液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜確定了洋蔥中農(nóng)藥殘留快速篩查的最佳參數(shù)，同時對方法學(xué)參數(shù)進行了評價，建立了洋蔥中173 種農(nóng)藥殘留的快速篩查和準確定量方法。該方法成功應(yīng)用于2020 年歐盟組織的洋蔥中農(nóng)藥殘留能力驗證，定性篩查結(jié)果準確，無假陰性和假陽性，并且定量結(jié)果準確可靠，表明該方法適用于洋蔥樣品中多種農(nóng)藥殘留的快速篩查與定量，并可為其他果蔬基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的風險監(jiān)測提供參考。