譚靜雯 田為一 高 睿 盛嘉棋 任雨杰 甄樹聰

（鹽城工學院土木學院，江蘇鹽城 224001）

近年來，如何處理好水資源與能源危機一直是一個居高不下的熱點問題，顯然污水再生利用是一個極為重要的途徑[1-3]。在運用不同方法對污水進行再生利用的過程中，發(fā)現(xiàn)相比于常規(guī)的污水生物處理工藝技術，運用微藻深度處理污水是一個較為可取的方法，不僅因為可以利用菌藻共生系統(tǒng)中微藻在生長過程中可以吸收污水中氮、磷等營養(yǎng)物質并將其轉化為有機物或沉淀這一特性，還因為可以利用其細胞中含油量較高這一優(yōu)點，萃取油脂并轉化成生物柴油，真正做到處理水廠尾水的同時緩解部分的能源匱乏問題[4-7]。本研究通過觀察幾種常見微藻在尾水中的生長差異并萃取油脂，對藻種的產油性能進行評價，為日后研究尾水可持續(xù)培養(yǎng)微藻并將其作為生物柴油奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

1.1.1 試驗儀器。紫外分光光度計、顯微鏡、培養(yǎng)箱、離心機等。

1.1.2 試驗材料。試驗水樣來自鹽城市城東污水廠尾水。試驗所用藻種均由指導老師提供，分別為銅綠微囊藻（藻種編號PCC-7806）、銅綠微囊藻（藻種編號FACHB-469）、有毒銅綠微囊藻（藻種編號PCC-7820）、蛋白核小球藻（藻種編號FACHB-5）。

1.1.3 試驗試劑。氨氮標準溶液、納氏試劑、酒石酸鉀鈉溶液、磷標準使用溶液、抗壞血酸溶液、鉬酸鹽溶液、無水乙醇。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設置與接種。選用容積為1 L的錐形瓶作為培養(yǎng)容器，用江蘇省鹽城市城東污水廠的尾水作培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)4種不同藻類，記為4組。A組為PCC-7806，B組為PCC-7820，C組為FACHB-469，D組為FACHB-5。污水廠尾水中的氨氮濃度和總磷濃度為TN=2.41 mg/L、TP=8.12 mg/L。

試驗前用離心機將4種藻類以5 000 r/min的速度離心15 min，棄去上清液，再用無菌水洗滌3次，分別接入已滅菌的4組培養(yǎng)基中，放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用雙側可調光源，光強控制在4 500～5 000 lx，進行24 h光照，溫度控制在25.0～26.5℃[8]，每日手動對其進行搖晃2～3次，使得營養(yǎng)均衡。A組初始藻密度約為3.32×106個/mL，B組初始藻密度約為2.12×106個/mL，C組初始藻密度約為3.51×106個/mL，D組初始藻密度約為2.88×106個/mL。并分別在培養(yǎng)過程中的第1、3、5、7、9、11、13和15天對其數(shù)量及尾水中氮磷的含量進行檢測。

1.2.2 微藻的生長曲線。4種不同微囊藻的細胞密度采用血球計數(shù)板計數(shù)的方法進行計數(shù)，并繪制微囊藻的生長曲線圖。

1.2.3 微藻氨氮濃度變化的測定。采用納氏試劑分光光度法測定[9]。在8個50 mL比色管中，先配置好氨氮含量分別為0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0和100μg的溶液并加蒸餾水至標線。再先后加入1 mL的酒石酸鉀鈉溶液和1 mL的納氏試劑搖勻。靜置10 min后，在波長為420 nm下，用20 mm比色皿，以零濃度溶液為參比，測量吸光度，并繪制出校準曲線。再將4種待測液體各取50 mL按照和校準曲線相同的步驟測量4種微囊藻的吸光度，并得到其氨氮濃度的數(shù)值。

1.2.4 微藻總磷濃度變化的測定。采用鉬酸銨分光光度法測定[10]。在7個50 mL比色管中，分別加入0.00、0.50、1.00、3.00、5.00、10.0、15.0 mL的磷酸鹽標準溶液并加蒸餾水至50mL標線。向比色管中加入1 mL 10%抗壞血酸溶液，混勻。30 s后加2 mL鉬酸鹽溶液充分混勻，放置15 min。用30 mm比色皿于700 nm波長處，以零濃度溶液為參比，測量吸光度，并繪制出校準曲線。再將4種待測液體取適量經消解后分別加入50 mL比色管中，用水稀釋至標線。按照和校準曲線相同的步驟測量4種微囊藻的吸光度，并得到其總磷濃度的數(shù)值。

1.2.5 微藻比生長速率的測定。在藻種培養(yǎng)的第1天和最后1天分別取少量藻液，用分光光度計測量4種藻液在波長680 nm下的吸光度值，平行測量5次取平均。按以下公式計算4種藻種的比生長速率（d-1）：

式中，A1為接種培養(yǎng)第1天的吸光光度值OD680，A2為培養(yǎng)最后1天的吸光光度值OD680，T1和T2分別表示培養(yǎng)開始和結束的時間。

1.2.6 微藻生物量的測定。采用水廠尾水作培養(yǎng)基培養(yǎng)微藻，待其生長到指數(shù)生長末期收獲，將離心管在90℃烘箱中烘干至恒重（M1），取100 mL均勻藻液置于上述離心管中經離心機4000 r/min離心5 min。后用滅菌的蒸餾水清洗3次，清洗后經-20℃冰箱內冷凍2 h，然后將產物放置于烘箱中烘干至恒重（M2）。最后經過研磨，得到干藻粉。置于-20℃冰箱中凍存?zhèn)溆肹11]。按以下公式計算生物量：

生物量（g/L）=（M2-M1）×10

1.2.7 微藻油脂含量的測定。參考文獻[12]中的乙醇法，將其略微改動，用來提取4種微藻中的油脂。取培養(yǎng)至指數(shù)生長末期的一定量干藻體，充分研磨后每克加入5 mL 96%的乙醇，振蕩搖勻。將混合溶液放入離心管在4 000 r/min的轉速下離心5 min，吸取上清液于已恒重的燒杯內，剩余的殘渣再加入5 mL 96%的乙醇離心吸取上清液于之前的燒杯里。將燒杯放置于水浴鍋中快速去除多余溶劑，取出后再放置于90℃的烘箱中干燥2 h，取出燒杯至冷卻后再稱重。按以下公式計算藻種油脂質量分數(shù)（%）：

油脂含量分數(shù)（%）=（油脂質量/干藻體質量）×100

1.2.8 微藻油脂產率的計算。單位時間的油脂產率（mg/（L·d））可由下式計算[13]：

油脂產率=干藻體質量×油脂含量/培養(yǎng)時間

2 結果與分析

2.1 微藻的生長曲線

根據所測數(shù)據，A組（PCC-7806）初始藻密度約為3.32×106個/mL，B組（PCC-7820）初始藻密度約為2.12×106個/mL，C組（FACHB-469）初始藻密度約為3.51×106個/mL，D組（FACHB-5）初始藻密度約為2.88×106個/mL?？芍谧畛跖囵B(yǎng)時C組的藻數(shù)量最多，其次是A組，接著是D組，而數(shù)量最少的則是B組。根據數(shù)據繪制出如下4種微囊藻生長曲線圖（圖1）。

圖1 4種微藻生長曲線

由圖1可知，在最初的幾天培養(yǎng)過程中，這4種藻類均是呈指數(shù)生長的趨勢，在第5天之前，這4種藻的數(shù)量關系仍保持著C組最多，B組最少的關系。在第5天的時候，B組藻的數(shù)量超過了D組藻的數(shù)量，但這2種藻的數(shù)量仍均小于A組和C組的數(shù)量，C組仍是最多的。到了第7天，A、B、C組達到了藻數(shù)量的最大值，A組藻數(shù)量最多，C組次之，其次是D組，最后是B組。到第9天，D組藻的數(shù)量達到了最大值，且其最大值大于A組在第7天時的最大值。在之后的幾天里，4種藻類的數(shù)量均呈現(xiàn)出下降趨勢，在第15天時，最終測出A組藻密度約為47.12×106個/mL，B組藻密度約為38.66×106個/mL，C組藻密度約為42.93×106個/mL，D組藻密度約為61.52×106個/mL。

最終是D組藻的數(shù)量最多，其余依次是A組、C組、B組。

2.2 微藻氮磷濃度變化情況

根據所測數(shù)據制作出如下4種微囊藻在尾水中氨氮、總磷濃度變化表。如表1、表2所示。

表1 4種微藻在尾水中氨氮濃度變化 單位：mg/L

表2 4種微藻在尾水中總磷濃度變化 單位：mg/L

由表1可以看出，4種微藻在最初時氨氮濃度相等，均為2.41 mg/L。在第3天的時候B組消耗的氨氮最多，其次是A組和C組，最后是D組。到達第5天時，D組的消耗超過了B組和C組，僅次于A組。在接下來的幾天中，水中氨氮含量持續(xù)下降，但下降趨勢明顯緩慢于前7天，且逐漸趨于平緩。最終在第15天時，水中氨氮含量最多的是B組，接著是C組，其次是A組，最后是D組，也就是說D組消耗的氨氮最多，B組消耗的氨氮含量最少。具體變化趨勢見圖2。

圖2 4種微藻在尾水中氨氮濃度變化

由表2可以看出，4種微囊藻在最初時總磷濃度相等，均為8.12 mg/L。在第3天的時候可知D組消耗的磷最多，其次是C組和A組，最后是B組。到達第5天時，A組的消耗超過了C組，僅次于D組。在接下來的幾天中，水中磷的含量持續(xù)下降，下降趨勢總體上較為接近，并無很明顯的波動，最終在第15天時，水中磷含量最多的是B組，接著是C組，其次是A組，最后是D組，可知D組消耗的磷最多，B組消耗的磷含量最少。具體變化趨勢可見圖3。

圖3 4種微藻在尾水中總磷濃度變化

2.3 微藻生長速率、生物量以及油脂含量的分析

藻種的生物量以及油脂含量是分析藻種產油高低的重要指標，在相同的培養(yǎng)條件下，藻種的生物量與油脂含量并非呈正相關的趨勢。離心收集100 mL藻液得到的濕藻體，通過冷凍干燥、研磨的干藻利用乙醇法提取其油脂，每組數(shù)據平行測定5次求其平均，得到其油脂含量。藻種生長速率、生物量和油脂含量的比較結果如表3所示。

表3 4種微藻的比生長速率、生物量以及油脂含量的比較

由表3可知，比生長速率最高的藻種是A組PCC-7806，為0.60 d-1。其次是D組和B組，分別為0.57 d-1和0.53 d-1。最低的則是C組，為0.52 d-1，所有藻種的比生長速率都大于0.5 d-1。4種微藻的生物量在1.04～2.27 g/L，其中最大的是A組，為2.27 g/L，其他藻種的生物量從大到小依次為D組1.39 g/L，B組1.13 g/L，C組1.04 g/L。

通過比較比生長速率與生物量的數(shù)據可知，生長速率高的藻種，生物量也高。因此，比生長速率最快的是A組，而它的生物量也是最高的。其他依次為D組、B組，而比生長速率最慢的是C組，它的生物量也是最低的。由此可見，它們的生物量都與比生長速率成正比。

而在相同培養(yǎng)條件下各個藻種油脂的含量累積都不同，即使是相同屬的藻種也不一樣。由表3可知，4種微藻的油脂含量最高的是D組，為28.07%，比最低的A組油脂含量9.95%高出了18.12個百分點。而C組和B組的油脂含量也較高，分別為27.31%和16.15%。

通過比較生物量以及油脂含量的數(shù)據可以發(fā)現(xiàn)：在培養(yǎng)藻種的過程當中，A組的生物量最高，是最低的C組的2.18倍，油脂含量卻是最低的，僅有9.95%。而生物量最低的C組，油脂含量卻很高，達到了27.31%，與油脂含量最高的D組僅相差0.76%。此現(xiàn)象表明僅從藻種的生物量與油脂含量來判斷4種藻種油脂累積的情況還不夠，需要引進綜合指數(shù)更高的油脂產率，才能更好地對藻種的產油情況進行評價。

2.4 微藻產油潛力評價

評價微藻的產油潛力，微藻的油脂產率是很重要的一個性能指標，它是微藻的生長情況、生物產率與油脂含量的綜合反映。為此觀察4種微藻在培養(yǎng)時間為15 d的油脂積累情況，4種微藻油脂產率的比較結果如圖4所示。

圖4 4種微藻的油脂產率比較

由圖4可知，D組油脂產率最高，為27.79 mg（/L·d）。A組和C組也有較高的油脂產率，分別為16.14 mg（/L·d）和20.29 mg（/L·d），最低的是B組，只有13.07 mg（/L·d）。由此可知，D組FACHB-5最適合作產油藻的候選藻種，研究價值較高。

3 結論

（1）選取4種微藻，考察其在污水廠尾水的培養(yǎng)條件下的生長情況、對氨氮和磷的去除效果進行研究，結果表明：D組蛋白核小球藻的密度最大，生長速率最快，其余依次是A組PCC-7806、C組FACHB-469，最小的是B組PCC-7820。4種藻類在污水中對TN的去除效果一般，對TP的去除比較理想，其中蛋白核小球藻對磷的去除率是最高的，達到了87.1%，這也與藻種在污水中的生長速率一致。由此可見，此藻種對于污水的耐受性較高，采用污水廠尾水培養(yǎng)藻類以治理市政污水的方法可行。

（2）4種藻類中，蛋白核小球藻的油脂含量是最高的，達到了28.07%。而根據其余藻類的生物量和油脂含量分析：微藻的生物量高，油脂含量卻不高。例如A組PCC-7806的生物量最高，是生物量最低的C組FACHB-469的2.18倍，而它的油脂含量卻是最低的，僅有9.95%。而生物量最低的C組FACHB-469，油脂含量卻很高，達到了27.31%。最后由4種藻的油脂產率來看，D組蛋白核小球藻的油脂產率最高，達到了27.79 mg/（L·d）。其余油脂產率從高到低依次為20.29、16.14、13.07 mg/（L·d）。

（3）綜合研究所得的各項指標來分析，蛋白核小球藻（FACHB-5）的生長情況、對于污水的處理效果以及油脂含量與產率均最好。因此，可選其為優(yōu)勢藻種，對其優(yōu)化培養(yǎng)條件以期為生產市政污水處理的新能源作原料。

4 展望

在全球經濟高速發(fā)展的今天，水污染、能源嚴重短缺等問題越來越突出，開發(fā)可持續(xù)的綠色能源成為當前解決這些問題的重要途經。由于微藻產油的效率高、含量高等優(yōu)點，產油微藻成為了當前比較理想的生物質原料。但目前發(fā)展微藻產油還存在著許多難題，例如微藻培養(yǎng)的成本過高效率低下、微藻回收的成本過高等問題[14-15]。由此可見，如將產油微藻的培養(yǎng)和市政污水處理相耦合，不僅可以降低微藻培養(yǎng)的成本過高問題，還可以實現(xiàn)污水的治理和回收再利用；再通過研究新的光生物反應器，可以更好地優(yōu)化產油微藻的培養(yǎng)條件，提高培養(yǎng)效率，增加微藻的生物量；針對微藻的回收問題，還可以深入研究更好地回收方法，對后續(xù)的回收再利用具有重要意義。將以上方面深入研究，可以促進微藻低成本高效率的培養(yǎng)與回收，推動微藻制油的產業(yè)化發(fā)展，為全球的能源短缺以及環(huán)境污染等問題貢獻力量。