鄒海龍，羅琳琳，周潤東，3，唐海鵬，馬 杰，韋獻雅*

(1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院種苗研究所，成都 611333；2.成都啟蟄農(nóng)業(yè)有限公司，成都 611333；3.西昌學院農(nóng)業(yè)科學學院，四川 西昌 615000)

地果 (Ficustikoua)又名伏夏果、野地瓜等[1]，為?？撇ぬ}蜜亞科、榕屬無花果亞屬,是一種多年生匍匐木質(zhì)藤本，屬于雌雄異株植物[2-3]。產(chǎn)于我國四川 、湖北 、廣西、貴州、湖南 、云南和西藏 ，國外在印度和中南半島有分布[4-5]。地果的莖段為棕褐色，節(jié)略有膨大。分枝多，生長快，攀附力也很強， 果實呈球形狀，直徑2～3cm，果實初期呈青色帶小點，成熟褐紅色帶小點，甜度高且果肉呈現(xiàn)顆粒般[6]。營養(yǎng)豐富，是集食用、藥用、綠化、觀賞于一體等多用途經(jīng)濟作物，其蛋白質(zhì)中氨基酸種類組成合理，其中3種抗疲勞支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)含量占總氨基酸的29．08%，且有“水果之王”等多種美譽[7]。

全株可藥用，果實富含微量元素，具人體健康必需的膳食纖維，膳食纖維可促進腸蠕動，有利于改善消化不良及慢性便秘患者的癥狀，適合及長期臥床者。莖葉用于風熱咳嗽、水腫、經(jīng)閉、痢疾、帶下病;花用于遺精、滑精。根用于清熱利濕、黃疸等[8-10]。目前生產(chǎn)上地果采用扦插和壓條繁殖，繁殖周期長，且易感染多種病毒，使地果體內(nèi)積累多種病毒，從而導致地果產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低，種性退化，—般減產(chǎn)30%～50%[11]。其生長周期長且?guī)Р≈贻^多嚴重制約了野生地果的生產(chǎn)發(fā)展，急需脫毒快繁技術進行品種提純復壯。國內(nèi)外尚無高抗病毒地果。采用莖段組織培養(yǎng)脫毒地果苗，成為防治病毒，提高地果產(chǎn)量和品質(zhì)及縮短育苗周期的首選方法[12]。

研究通過莖段脫毒的方法，通過處理莖段表面、莖段分生組織剝?nèi)?、初代增殖培養(yǎng)(基本培養(yǎng)基為 MS 附加不同比例的激素)、壯苗培養(yǎng)等一系列實驗操作及培養(yǎng)基配方優(yōu)化，建立四川盆周山區(qū)野生地果快繁體系[13]。該項研究為野生地果的快速繁殖建立快繁技術體系，為實際生產(chǎn)提供了支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料及培養(yǎng)條件

實驗材料為四川盆周山區(qū)野生地果，2021年9月收獲，2022年3月份芽點萌發(fā)待用。無菌培養(yǎng)條件為：日溫23～25 ℃，夜溫16～20 ℃，光照時數(shù)12 h/d，光照強度2000～3000Lx條件下培養(yǎng)。

1.2 材料預處理

1.2.1 選材預處理 應選優(yōu)良單株作莖段剝離材料。放置在光照培養(yǎng)箱中處理(25～30℃，16h光照；8h黑暗，25～26℃)1周。

1.2.2 外植體消毒與莖段剝離方法 將當年生且茁壯的野生地果嫩莖剪取的2～3cm的放入燒杯中，用自來水清洗3次，后在燒杯口蒙上紗布，加1～2滴洗潔精，用自來水沖洗0.5h后，放入無菌燒杯中。在超凈工作臺中用75%酒精中浸30～40s，再用無菌水清洗3次，以保證無酒精殘留。用升汞液消毒18～30min，取出用無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干材料表面水分。在解剖鏡下用手術刀等工具輕、準、快速地剝?nèi)ビ兹~。切取帶1～2個葉原基的生長點。接種于MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L瓊脂培養(yǎng)基上，pH 5.8～6.0。每瓶接種2個帶芽莖段，每個處理10瓶，重復3次。接種后15d觀察記錄不同消毒處理的污染率、褐化率、成活率。

1.3 初代增殖培養(yǎng)

將組培苗轉接于植物生長調(diào)節(jié)劑設置的4種培養(yǎng)基梯度中且重復3次。每瓶轉苗5株，每個處理10瓶，20d后觀察生長情況。

MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L

1.4 壯苗培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)的獲取的叢生芽，存在數(shù)量多芽長約0.5cm，較為弱小，需要進行壯苗培養(yǎng)以提高無菌苗的質(zhì)量。將增殖的苗，轉入壯苗設置的4種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復3次。在第15d、30d、45d觀察生長情況。

MS+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+6-BA0.5mg/L +瓊脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L +瓊脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L +瓊脂7g/L+蔗糖30g/L

1.5 生根培養(yǎng)

當壯苗處理后的苗高為4cm以上時，將其從基部切下，按照生根培養(yǎng)基的4個梯度進行接種，重復3次。每瓶接種5株，每個處理10瓶在30d后觀察生長情況。

MS+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+IBA0.05mg/L +NAA0.1mg/L +瓊脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+IBA0.1mg/L+NAA0.2mg/L+ 瓊脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L+ 瓊脂7g/L+蔗糖30g/L

1.6 馴化移栽

在溫度25～30℃、相對濕度75%～90%的溫室大棚進行馴化[14]，移栽前，將生根的組培苗放入煉苗實驗室，放置7d后將瓶蓋扯開一半，繼續(xù)鍛煉2d，再將瓶口完全揭開，繼續(xù)煉苗5d。移栽時，將苗根部的培養(yǎng)基用自來水洗掉[15],用0.1%高錳酸鉀浸泡消毒2min并用清水淋洗[16];最后移栽到4種不同的基質(zhì)中，每個處理為100株生根組培苗，20d后觀察 基質(zhì)配方：①椰糠：蛭石=2：1(CK);②營養(yǎng)土：椰糠：蛭石3:1:1;③營養(yǎng)土：椰糠：蛭石=2：1：1;④營養(yǎng)土：椰糠：蛭石=1：1：1。

1.7 統(tǒng)計分析方法

實驗數(shù)據(jù)處理使用Excel 2010、SPSS 19．0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

增殖倍數(shù)=增殖后芽的總數(shù)/接種的外植體個數(shù)

生 根 率 (%) = 生 根 苗 數(shù)/培 養(yǎng) 總 苗 數(shù) × 100%

平均根數(shù) = 所有根數(shù)之和/生根苗數(shù)

污染率(%) = 接種污染數(shù)/接 種總數(shù) × 100%

死亡率(%) = 未污染死亡數(shù)/未污染 總數(shù) × 100%

褐化率(%) = 未污染褐化數(shù)/未污染總 數(shù) × 100%

2 結果與分析

2.1 酒精及升汞消毒時間

本研究設計了消毒時間梯度。外植體轉入后 15 d 觀察并記錄存活數(shù)，由于設置的消毒時間梯度分布較大，升汞的消毒時間較長，因此污染相對較低，但由于褐化率高，導致了死亡率偏高。從表1可以看出，消毒最佳方法是處理5：75%酒精消毒30s +無菌水清洗3次+升汞溶液30min+無菌水清洗5次，這種消毒方法污染率僅為16.7%，褐化率為11.2%，成活率為83.2%未污染的莖段顏色正常，沒有出現(xiàn)壞死現(xiàn)象。酒精的消毒時間過長容易將外植體整株褐化變色，升汞消毒時間過長容易出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，培養(yǎng)2～3d后莖段直接死亡，因此合適的消毒方式不僅看污染率，還要看后期的生長狀態(tài)。

表1 不同消毒方式對莖段的影響

2.2 初代增殖培養(yǎng)

不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑組合增殖培養(yǎng)20d后，各處理的萌芽率均能正常萌芽，不同的濃度對萌芽的情況差異顯著。從表2可以看出處理4：MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+ 瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，萌芽率達到了96%，增殖倍數(shù)在2.96，莖段長勢強，芽分蘗能力強，生長正常，可能是野生地果對6-BA濃度敏感度低，需要較高濃度有利于莖段分蘗，對NAA濃度非常敏感，容易生長，增殖系數(shù)達到了2.96，這可能是地果內(nèi)部激素充足，足夠組培苗生長。

表2 不同培養(yǎng)基對莖段萌芽的影響

2.3 壯苗培養(yǎng)

增殖培養(yǎng)后的地果苗較弱，進一步將地果苗進行培養(yǎng)，在前人同科品種研究基礎上，使用4種不同配方培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)，分別記錄了15d、30d、45d的生長情況。結果發(fā)現(xiàn)處理4效果最好：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L + 瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，莖段明顯增粗，且深長，新芽茁壯，葉片寬大，葉色濃綠，并且組培苗長勢正常，這可能是添加激素充足，使得組培苗生長茁壯，分蘗和長勢正常。

表3 不同培養(yǎng)基對壯苗的影響

2.4 生根培養(yǎng)

通過壯苗處理的后苗轉接到生根的植物生長調(diào)節(jié)劑的梯度中，進行生根培養(yǎng)，第30d的觀察后所有處理的組培苗生長趨于正常。結果表明，處理1和3 對組培苗的生根率和平均生根數(shù)的影響顯著，處理3的 ：MS+IBA0.1mg/L +NAA0.2mg/L +瓊脂7g/L +蔗糖25g/L，其生根效果好，根系多，根系粗長。使用NAA的配方中，有明顯生根情況，且濃度增加其長勢好，生根數(shù)量多。但NAA到達0.5mg/L時生長受到抑制，因此處理3是最好的生根處理。生根階段使用處理3，移栽時候非常容易清洗根部培養(yǎng)基，因根系粗長且較多，增加移栽成活率。

2.5 最佳移栽基質(zhì)

移栽采用了進口的椰糠、蛭石等混合代替園土為基質(zhì)，通過大棚馴化溫室高密度栽植組培苗，全程通過物聯(lián)網(wǎng)進行調(diào)控溫、濕、光、水、肥等，盡最大程度提供最佳的培養(yǎng)條件。

試驗采用優(yōu)質(zhì)低位泥炭土運用到脫毒野生地果種苗的生產(chǎn)中，試驗效果良好。以野生地果組培苗為材料，經(jīng)過栽培基質(zhì)配制試驗，證明在相同栽培條件和管理措施下，不同材料配制栽培基質(zhì)中，最優(yōu)栽培基質(zhì)為“營養(yǎng)土：椰糠：蛭石=2：1：1”，比傳統(tǒng)對照采用“蛭石+珍珠巖=2:1”的基質(zhì)，縮短了一半的生長周期，經(jīng)濟效益明顯增加。

表4 不同培養(yǎng)基對生根培養(yǎng)的影響

表5 不同材料配制栽培基質(zhì)對脫毒野生地果種苗繁育的影響

3 討論

野地果的快速繁殖可提供技術保障，為生產(chǎn)應用提供支撐。將組培快繁技術運用到四川野生地果品種，應選擇合適的培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑及培養(yǎng)條件，用前沿的技術完善該品種的快繁。根據(jù)文獻報道，6-BA 能促進地果愈傷組織誘導與分化，但地果在組織培養(yǎng)中對 6-BA 和 NAA 的濃 度配比要求不同，這可能與地果不同地區(qū)和培養(yǎng)條件等因素有關。過高的 NAA 濃度也會抑制地果分蘗，適宜的較低濃度的 NAA 能和 6-BA 起到協(xié)同增益的作用，既能 促進地果分蘗的發(fā)生，又能促進地果組培苗生長。李芊夏[7]研究認為，添加 6-BA 和 NAA 的培養(yǎng)基更能促進地果的分蘗。本實驗表明，在初代增殖階段，NAA 濃度為 0.1mg/L 時，6-BA 濃度為 2.0mg/L 時，增殖效果最好；NAA濃度為0.05mg/L 時，6-BA濃度0.5mg/L，增殖效果差。

此外，本實驗表明，最佳壯苗培養(yǎng)基為MS+ 瓊脂 7 g/L+蔗糖 30 g/L，當加6-BA2.0mg/L和NAA0.2mg/L后， 芽茁壯，分蘗和長勢正常，本研究結 果可為四川當?shù)氐毓麅?yōu)良種苗的快速繁殖 提供技術支撐，同時為四川種質(zhì)資源保存、組培 擴繁、品種改良、育種等研究奠定基礎，促進四川周邊地區(qū)地果產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

圖1 不同時期生長情況注：A.外植體消毒苗；B.初代增殖苗；C.壯苗培養(yǎng)；D.生根苗培養(yǎng)；E移栽苗。