孫曉梅，梅 雯，何 冰，羅中貴，孫如麗，熊 偉，趙 一*

（1.楚雄彝族自治州人民醫(yī)院病理科，云南楚雄 675000；2.大理大學基礎醫(yī)學院，云南大理 671000）

彌漫大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是淋巴造血系統(tǒng)最常見的惡性淋巴瘤之一，是非霍奇金淋巴瘤最常見的類型，占非霍奇金淋巴瘤的30%～40%〔1〕。DLBCL 具有高度侵襲性和異質性，可發(fā)生于結內或結外任何部位，病情進展快、惡性程度高。若同一病例出現(xiàn)MYC 與Bcl-2 異位或MYC 與Bcl-6 異位稱其為“雙打擊”淋巴瘤；若MYC、Bcl-2、Bcl-6 三者基因重排同時陽性，則稱其為“三打擊”淋巴瘤，“雙打擊”淋巴瘤和“三打擊”淋巴瘤惡性度高、化療效果和預后均較差〔2-3〕。利妥昔單抗聯(lián)合CHOP（以下簡稱“RCHOP”）化療方案大大提高了DLBCL 患者的完全緩解率及5 年生存率，但由于DLBCL 具有異質性、復雜免疫表型及分子遺傳學等，部分難治性復發(fā)患者的治療效果并不理想，仍然嚴重影響著患者生存率〔4〕。目前對于難治性復發(fā)患者，干細胞移植是一種有效的治療方法，由于許多患者不符合干細胞移植條件，限制了它的應用〔5〕。因此，研究DLBCL 發(fā)病機制及預后相關指標對于治療方案的選擇具有重要的指導意義。

線粒體轉錄延伸因子（mitochondrial transcription elongation factor，TEFM）又稱為C17orf42，是對細胞周期調控、細胞增殖及凋亡調節(jié)具有重要作用的蛋白因子，在線粒體DNA 的轉錄過程中起正調控作用，TEFM 為mtDNA 復制提供引物，在線粒體轉錄延伸和抗轉錄終止中發(fā)揮調節(jié)作用，對細胞能量代謝至關重要〔6〕。王唯斯等〔7〕基于生物信息數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)TEFM mRNA 在腦膠質瘤中高表達，其表達量與世界衛(wèi)生組織分級、病理類型具有相關性，提示TEFM 基因在細胞內的功能可能類似于細胞癌基因。DLBCL 在能量代謝方面存在明顯異質性，線粒體與DLBCL 的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關，或許能為DLBCL 的治療提供理論指導和新的策略〔8〕。研究〔9〕表明，BCR 信號通路、Bcl-6 和自噬等調節(jié)BCR-DLBCL 亞型細胞的有氧糖酵解過程，高度活化的線粒體功能基因和高表達的脂肪酸代謝關鍵基因等調節(jié)OxPhos-DLBCL 亞型細胞的氧化磷酸化過程。Ki-67 為淋巴瘤增殖活性指標，Bcl-6 是凋亡抑制因子，功能與Ki-67 相似。Bcl-6 基因突變和染色體易位是腫瘤發(fā)生的基礎，異常表達Bcl-6 可直接調節(jié)細胞分化、增殖和凋亡，促進腫瘤生長。Bcl-2 是一種抗凋亡分子，其過表達使細胞抵抗正常凋亡，從而具有致瘤作用。TEFM 是一種促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的蛋白因子，在線粒體基因轉錄調控中發(fā)揮重要調節(jié)作用。Ki-67、Bcl-6 及Bcl-2均對DLBCL 細胞增殖及凋亡起重要調控作用，它們是否與其他腫瘤增殖因子如TEFM 相互作用共同參與DLBCL 的發(fā)生、發(fā)展有待進一步證實。基于此，本研究旨在探討Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 及TEFM 在DLBCL 中的表達及其與患者臨床病理特征的相互關系，為DLBCL 的臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集楚雄彝族自治州人民醫(yī)院DLBCL 病理組織樣本41 例和反應性增生淋巴組織樣本42 例，記錄上述樣本對應患者的臨床病理參數(shù)信息和預后信息。診斷標準參照2017 年世界衛(wèi)生組織修訂的《造血與淋巴組織腫瘤分類（第4版）》（中文譯名）〔10〕，所有入選病例均為初診病例，手術前均未經(jīng)過化療和放療。納入標準：①經(jīng)活檢組織病理學確診為DLBCL 者；②臨床病歷資料完整者。排除標準：①并發(fā)其他惡性腫瘤者；②蠟塊組織過少者；③年齡小于18 歲者。

1.2 試劑一抗為兔抗TEFM 抗體（Gene Tex 公司，克隆號：822004102）；Ki-67（批號：20220413）、Bcl-6（批號：20220719）、Bcl-2（批號：20220916）、DAB 顯色試劑盒（批號：20220804）均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；二抗（批號：20210519）。

1.3 免疫組織化學方法3 μm 石蠟切片后68 ℃烤箱烘烤2 h，分別使用TO 透明（Ⅰ）、TO 透明（Ⅱ）脫蠟（各10 min），然后依次在無水乙醇（Ⅰ）、無水乙醇（Ⅱ）、95%乙醇（Ⅰ）、95%乙醇（Ⅱ）中浸潤（各3 min），在85%乙醇中浸潤2 min 后使用蒸餾水沖洗2 min。將切片放入乙二胺四乙酸緩沖液中高溫修復抗原后滴加3%過氧化氫溶液于玻片中阻斷內源性過氧化物酶活性，10 min 后使用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3 次，每次沖洗5 min，滴加一抗，37 ℃孵育1 h；PBS 沖洗3 次，滴加二抗，37 ℃孵育30 min；PBS 沖洗3 次后DAB顯色5 min，蒸餾水沖洗終止顯色；使用Mayer 蘇木素輕度復染細胞核3～5 min，蒸餾水沖洗后PBS 返藍，沖洗脫水后吹干載玻片，中性樹膠封片，PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.4 判讀標準Bcl-6、Bcl-2、TEFM 采用定性判斷，隨機選取10 個高倍視野，根據(jù)著色強度和視野中陽性細胞所占比例進行評分〔11〕。著色強度評分：無著色計0 分，淺黃色計1 分，棕黃色計2 分，棕褐色計3 分；陽性細胞所占比例評分：＜25%計1 分，25%～50%計2 分，＞50%計3 分。將著色強度評分和陽性細胞所占比例評分相乘：0～1 分為陰性，2～4分弱陽性，5～8 分為中等陽性，9～12 分強陽性，其中，陰性和弱陽性歸為低表達，中等陽性和強陽性歸為高表達。Ki-67 采用定量判定，將陽性細胞所占比例≥50%歸為高表達，＜50%歸為低表達。所有病理結果均經(jīng)2 名以上病理學專家采用雙盲法診斷。

1.5 統(tǒng)計分析采用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，比較Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 及TEFM 蛋白在反應性增生淋巴組織與DLBCL 組織間的表達差異用χ2檢驗；探究Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 及TEFM 蛋白表達水平與DLBCL 臨床病理特征的關系用χ2檢驗及Fisher 確切概率法；考察TEFM 與Ki-67、Bcl-6、Bcl-2表達的相關性用Spearman 秩相關分析，相關系數(shù)R＞0 表示正相關，R＜0 表示負相關，R=0 表示零相關，檢驗水準α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 和TEFM 蛋白表達情況對DLBCL 組織和反應性增生淋巴組織樣本進行Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 和TEFM 蛋白表達差異分析。結果顯示，與反應性增生淋巴組織相比，Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 蛋白在DLBCL 組織中高表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Ki-67、Bcl-6 和TEFM 定位于細胞核，Bcl-2 定位于細胞核及細胞質。在反應性增生淋巴組織中，Ki-67 僅在生發(fā)中心高表達，而DLBCL 由于淋巴結構被腫瘤細胞取代而遭到破壞，無正常淋巴結結構，和反應性增生淋巴組織相比，Ki-67 在腫瘤部位彌漫強陽性（≥75%）表達。在反應性增生淋巴組織中，Bcl-2 生發(fā)中心陰性，而在DLBCL 組織中可表現(xiàn)為彌漫陽性表達，成為非生發(fā)中心起源的標志物。在反應性增生淋巴組織中，Bcl-6 通常表達于生發(fā)中心，而在DLBCL 組織中，同樣表現(xiàn)為彌漫陽性表達，是腫瘤細胞非生發(fā)中心起源的標志物。TEFM 蛋白在反應性增生淋巴組織中和DLBCL 中表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

表1 Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 和TEFM 蛋白在DLBCL 組織和反應性增生淋巴組織中的表達情況

圖1 Bcl-2、Bcl-6、Ki-67 和TEFM 蛋白在反應性增生淋巴及DLBCL 組織中的表達情況

2.2 Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 和TEFM 蛋白表達水平與DLBCL 臨床病理相關性分析通過對DLBCL 患者預后影響因素統(tǒng)計分析可知，DLBCL 患者Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 和TEFM 蛋白表達水平與年齡、性別、B 癥狀、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）數(shù)值、結外器官受累情況及復發(fā)情況均無相關性（P ＞0.05），DLBCL 組織中TEFM 及Ki-67 蛋白表達水平與原發(fā)部位相關（P=0.049＜0.05）。見表2。

表2 Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 和TEFM 蛋白表達水平與DLBCL 臨床病理相關性分析

2.3 TEFM 與Ki-67、Bcl-2、Bcl-6 表達的相關性分析通過統(tǒng)計分析TEFM 與Ki-67、Bcl-2、Bcl-6 表達的相關性可知，TEFM 蛋白表達與Ki-67、Bcl-6表達呈正相關（P＜0.05，R＞0）。見表3。

表3 TEFM 與Ki-67、Bcl-2、Bcl-6 表達的相關性分析

2.4 影響DLBCL 患者預后因素分析治療結束后隨訪3 年，DLBCL 患者生存21 例，生存率為51.22%（21/41）。單因素分析結果顯示，DLBCL 患者3 年生存率與性別、B 癥狀、LDH 數(shù)值、結外器官受累情況、復發(fā)情況和原發(fā)部位無相關性（P ＞0.05），與Ki-67、Bcl-2 和Bcl-6 表達情況亦無相關性（P＞0.05），僅與患者年齡有相關性（P＜0.05），年齡≥60歲的患者生存率較低，僅為28.57%。見表4。

表4 影響DLBCL 患者預后因素分析

3 討論

DLBCL 是非霍奇金淋巴瘤最常見的類型，多表現(xiàn)為單個或多個淋巴結或結外部位快速生長的異質性及侵襲性腫瘤。雖然大多數(shù)DLBCL 患者可以通過6～8 個周期的R-CHOP 化療方案治愈，但仍有部分難治性復發(fā)患者。隨著高通量測序和精準醫(yī)學的發(fā)展，對DLBCL 形態(tài)學、免疫表型譜及分子發(fā)病機制的認識逐漸擴大，多種異?；虮话l(fā)現(xiàn)，從分子水平研究有關預后和潛在治療靶點標志物對于DLBCL 精準診療有重要指導意義。

Ki-67 蛋白是一種與腫瘤細胞增殖密切相關的核蛋白，存在于細胞周期的所有活躍階段，但在靜止細胞G0 期中不存在，目前Ki-67 的表達作為評價淋巴瘤增殖活性的指標已廣泛應用于臨床，Ki-67 與DLBCL 亞型相關的結果仍存在爭議〔12-13〕。研究表明，Ki-67 表達水平是DLBCL 化療患者不良生存率的一個預測因素〔14-16〕，Ki-67 高增殖指數(shù)（80%）與DLBCL 患者總體生存率縮短顯著相關，與治療不良反應相關性不顯著〔17〕。周穎等〔18〕回顧性分析接受R-CHOP 化療方案的DLBCL 患者Ki-67的表達及其與預后的相關性，結果表明Ki-67 低表達組的總生存時間（overall survival，OS）和無進展生存期（progression free survival，PFS）明顯長于高表達組，Ki-67 的表達水平是影響OS 的獨立預后因素。Tang 等〔19〕采用免疫組織化學方法檢測了274例DLBCL 組織中Bcl-2 和Ki-67 的表達發(fā)現(xiàn)，Bcl-2/Ki-67 指數(shù)與DLBCL 患者的OS 和PFS 縮短顯著相關，特別是對于生發(fā)中心B 淋巴細胞樣亞型的DLBCL，Bcl-2 和Ki-67 共表達的患者生存率明顯降低；Pǎtra?cu 等〔20〕同樣發(fā)現(xiàn)Bcl-2、Ki-67 陰性表達患者的OS 和無病生存期較長。吳紅衛(wèi)等〔21〕分析58 例DLBCL 患者Ki-67 表達水平，結果顯示Ki-67 表達水平與性別、年齡、LDH 數(shù)值、結外病變、臨床分期及國際預后指數(shù)評分無關，Ki-67 高表達組與低表達組相比預后較差。

Bcl-2 是線粒體介導凋亡通路中的關鍵蛋白，具備穩(wěn)定線粒體膜通透性作用，是一種抗凋亡分子，在靜止的B 淋巴細胞和T 淋巴細胞上表達，但在正常的生發(fā)中心細胞上不表達〔22〕。Bcl-2 在22%～80%的DLBCL 中表達，Bcl-6 和Bcl-2 陽性率已被報道與不良預后相關〔23〕。在“雙打擊”淋巴瘤中以C-MYC、Bcl-2 基因同時異常最常見，C-MYC 及Bcl-2 基因異常表達可增強DLBCL 侵襲性，影響患者近期療效和預后〔24〕。有研究〔25-28〕表明Bcl-2 蛋白可以作為DLBCL 患者預后因子，Bcl-2 和Bcl-6 在DLBCL 中高表達，Bcl-2 和Bcl-6 陽性表達與患者近期療效與預后不良相關，對患者監(jiān)測病情發(fā)展、治療方案選擇有現(xiàn)實意義〔29〕，Bcl-2 和Bcl-6 蛋白表達水平與DLBCL 患者的OS 和無病生存期顯著相關〔30〕?；驍U增和易位是導致DLBCL 中Bcl-2蛋白過表達的共同機制，但Bcl-2 蛋白在DLBCL 中的表達及對患者生存率的影響仍存在爭議。此外，Bcl-2 蛋白過表達對生發(fā)中心來源的DLBCL（GCBDLBCL）和活化B 淋巴細胞來源的DLBCL（ABCDLBCL）預后價值有所不同。Bcl-6 是一種編碼95 kDa 的Kruppel 型鋅指蛋白，Bcl-6 蛋白是成熟B 淋巴細胞在生發(fā)中心反應過程中所需的轉錄抑制因子，可影響淋巴濾泡生發(fā)中心B 淋巴細胞的反應和增生，對生發(fā)中心的發(fā)育和維持至關重要，而生發(fā)中心是產生有效的體液免疫反應所必需的。Bcl-6基因突變和染色體易位是腫瘤發(fā)生的基礎，Bcl-6已成為DLBCL 的關鍵治療靶點，其功能與Ki-67相似，Bcl-6 的異常表達可直接調節(jié)細胞的分化、增殖和細胞凋亡來影響DLBCL〔31〕。此外，Bcl-6 基因還通過調節(jié)其他基因（如C-MYC、信號轉導及轉錄激活因子和Bcl-2）的表達來調節(jié)腫瘤的生長〔32-33〕。除Ki-67、Bcl-2 和Bcl-6 表達水平與DLBCL 患者預后密切相關，Snuderl 等〔34〕認為年齡是影響患者預后的獨立危險因素，高齡患者預后較差。本研究結果顯示，DLBCL 組織中Ki-67、Bcl-2 和Bcl-6 表達水平明顯高于反應性增生淋巴組織，與既往研究〔30〕結果相符，進一步分析Ki-67、Bcl-2 和Bcl-6表達水平與影響DLBCL 患者預后的影響因素可知，三者的蛋白表達量與性別、年齡、B 癥狀、LDH數(shù)值、結外器官受累情況及復發(fā)情況均無相關性，Ki-67 蛋白表達水平與原發(fā)部位相關，結外表達水平高于結內，其內在聯(lián)系及機制有待進一步探究。此外，單因素分析結果顯示，DLBCL 患者3 年生存率與性別、B 癥狀、LDH 數(shù)值、結外器官受累情況、復發(fā)情況和原發(fā)部位均無相關性，僅與患者年齡有相關性，年齡≥60 歲的患者3 年生存率較低，與既往文獻〔34〕報道一致。

TEFM 是線粒體基因轉錄調控中的重要蛋白因子，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，在線粒體基因轉錄調控中發(fā)揮重要調節(jié)作用〔8〕。研究〔19，35-36〕提示TEFM 基因在細胞內的功能可能類似于細胞癌基因，有研究結果表明，肝癌組織中TEFM 蛋白和mRNA 表達水平顯著上調，且TEFM 基因的高表達與預后不良相關，此外TEFM mRNA 表達水平與性別、血清甲胎蛋白水平、血管浸潤程度顯著相關〔35〕。Wan 等〔36〕研究表明TEFM 是促進肝癌生長和轉移的重要致癌基因，TEFM 表達升高通過激活ROS/ERK 信號促進肝癌細胞生長和轉移，其表達水平增加與肝癌患者預后不良有關。TEFM 基因在DLBCL中的表達水平如何，以及是否與其他腫瘤增殖因子如Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 相互作用共同參與DLBCL發(fā)生、發(fā)展目前尚無文獻報道。本研究結果顯示，DLBCL 組織與反應性增生淋巴組織樣本中的TEFM 表達水平差異無統(tǒng)計學意義，進一步分析TEFM 表達水平與影響DLBCL 患者預后的影響因素可知，其蛋白表達量與性別、年齡、B 癥狀、LDH數(shù)值、結外器官受累情況及復發(fā)情況均無相關性，TEFM 表達水平與原發(fā)部位相關，具體原因有待進一步考究，且TEFM 表達與Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 表達呈正相關，三者的異常表達如何調節(jié)細胞的分化、增殖和細胞凋亡來影響DLBCL 有待后續(xù)進一步研究。由于本研究樣本量有限，在大樣本中是否存在這樣的內在聯(lián)系及其內在機制有待進一步更深入的探討。是否可以通過檢測TEFM 的表達情況，為DLBCL 患者尋找新治療方案提供理論依據(jù)仍需進一步研究。

綜上所述，Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 在DLBCL 患者中高表達，TEFM 表達與Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 在DLBCL 進展的過程中可能具有協(xié)同作用，Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 可作為DLBCL 預后不良的重要指標，也可作為預測患者預后的有效指標。DLBCL 的精準治療依賴于分子標志物的指導，隨著高通量技術的飛速發(fā)展，對于DLBCL 療效和預后分子標志物的多項研究均取得了不錯的成果。DLBCL 作為高度異質性的惡性腫瘤，目前常規(guī)病理檢測往往不能為臨床治療提供足夠的信息，將傳統(tǒng)臨床病理因素與新型生物標志物聯(lián)合起來，對于研究DLBCL 發(fā)生、發(fā)展中的分子機制及精準靶向診療有重要意義。