劉振寧 許蘊怡 胡麗環(huán) 劉志輝 胡錦興 李華 關平

廣州市胸科醫(yī)院檢驗科（廣州 510095）

目前病原學檢測方法對結核診斷效率不高：涂片簡單、快速，但檢出率低、不能區(qū)分死菌活菌、不能排除非結核分枝桿菌；培養(yǎng)作為診斷的金標準，檢出率略高于涂片，但耗時長；分子檢測快速，方法學也逐漸趨向簡便，但檢出率與培養(yǎng)相當而仍不理想；其總檢出率均不足60%［1-2］。因此研究人員一直在探討檢出率更高、操作更簡便的實驗診斷方法。具備快速、經濟、簡便的抗體檢測成為了其中一個選擇。現階段雖然結核抗體的檢測性能不佳，容易導致誤診漏診［3-4］，但抗體檢測具備的優(yōu)點，尤其在新冠傳染病的診斷中取得的巨大成功［5］，使得人們在結核病診斷一直沒有放棄這方面的努力［6］。我們在蛋白芯片的檢測過程中發(fā)現調整臨界值可改善診斷性能，因而進行抗體檢測研究。由于當前抗體檢測性能尚有不足，且結核病的發(fā)生發(fā)展主要與細胞免疫相關［7-8］，有研究指出我們的檢測指標對結核病診斷具有較好的意義［9］，因此本項目從細胞免疫的角度出發(fā)，對CD45+CD3+淋巴細胞、CD45+CD64+單核細胞、CD161+細胞以及RF 進行分析。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料根據《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準-肺結核診斷（WS 288-2017）》，選取本院2021年初次收治且未抗結核治療的肺結核患者202 例作為結核病組，男119 例，女83 例，年齡18～65 周歲，無合并其他感染性疾病、惡性腫瘤和免疫性疾病。全部患者均經過痰涂片、痰培養(yǎng)確診，或臨床診斷為肺結核。另外，選取同期本院的體檢健康者120 例作為健康對照組。男72 例，女48 例，年齡20～65 周歲，均經過臨床診斷，排除了結核病。

1.2 儀器與試劑LE-01-B 型生物芯片閱讀儀購于西安聯(lián)爾科技有限公司；5810R 高速冷凍離心機購于德國eppendorf 公司；BD-Accuri-C6 流式細胞儀購于美國BD 公司；結核蛋白芯片檢測系統(tǒng)試劑盒購于西安聯(lián)爾科技有限公司；CD161 檢測試劑購于深圳聯(lián)合醫(yī)學科技有限公司。

1.3 方法結核五項檢測流程如下。提取血清，采用結核蛋白芯片檢測系統(tǒng)試劑盒，取出芯片，滴加4 滴三羥甲基氨基甲烷緩沖液，完全滲入后加待檢血清100 μL，血清滲入后加6 滴三羥甲基氨基甲烷緩沖液，滲入后滴加6 滴膠體金標記的羊抗人IgG，最后加入6 滴三羥甲基氨基甲烷緩沖液，通過LE-01-B 型生物芯片閱讀儀進行檢測，儀器軟件自動判讀結果。

流式細胞檢測流程如下。采集新鮮的抗凝全血，轉移100 μL 至流式管，加入12 μL 混合抗體（CD3、CD45、CD64 和CD161 抗體），震蕩混勻后在室溫下避光孵育20 min。在上述流式管加入紅細胞裂解液2 mL，震蕩混勻后在室溫下避光孵育5 min，2 000 r/min 離心5 min，除去上清液后加入磷酸鹽緩沖液（PBS）2 mL，震蕩混勻后2 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，加入200 μL PBS，震蕩混勻后用流式細胞儀進行檢測。用軟件FlowJo 分析流式結果，分別篩選出淋巴細胞（CD45+CD3+）、單核細胞（CD45+CD64+）、CD161+細胞，計算淋巴細胞比例（CD45+CD3+%）、單核細胞比例（CD45+CD64+%）和CD161+細胞比例（CD161+%），最后利用TensorFlow 的Keras 庫構建深度學習網絡分類模型［9］計算結核菌感染風險指數RF。RF 值=淋巴細胞百分比/單核細胞百分比×淋巴細胞百分比。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行分析。以最小值和最大值描述數據的離散程度，四分位數描述數據的集中趨勢。如果符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；偏態(tài)分布計量資料秩和檢驗，統(tǒng)計量的比較采用t檢驗。通過受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線的曲線下面積（area under the curve，AUC）分析各項檢測指標診斷結核病的臨床價值。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組間各抗體、細胞比例及其感染風險指數的比較由于各檢測項目含有非正態(tài)分布數據，本研究采用秩和檢驗進行分析。計算結核組和健康組的最小值、最大值及其四分位數。兩組間的38KD、CFP10、ESAT-6 比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），16KD、LAM、CD45+CD3+%、CD45+CD64+%、CD161+%、RF 的差異有統(tǒng)計學意義（P均為0）。見表1。

表1 兩組間5 種抗體、3 種細胞比例及其感染風險指數的比較Tab.1 Comparison of five antibodies, three cell ratios and infection risk index between the two groups

2.2 各檢測項目的ROC 曲線結果繪制ROC 曲線，計算各檢測項目的AUC，各檢測項目ROC 曲線下面積分別為RF：0.884；CD45+CD3+%：0.860；CD45+CD64+%：0.834；16KD：0.748；LAM：0.680；CD161+%：0.667；CFP10：0.564；ESAT-6：0.535；38KD：0.525。見圖1。

圖1 5 種抗體、3 種細胞比例及其統(tǒng)計風險指數診斷結核的ROC 曲線Fig.1 ROC curve of 5 kinds of antibodies，3 kinds of cell ratio and statistical risk index in diagnosis of tuberculosis

2.3 各檢測項目最佳臨界值下的診斷性能指標數據通過ROC 曲線得出16KD、38KD、CFP10、ESAT-6、LAM、CD45+CD3+% 、CD45+CD64+% 、CD161+%、RF 的最佳臨界值分別為1.031、1.074、1.075、1.062、1.161、78.480、14.250、34.765、0.469。各檢測項目在最佳臨界值下的診斷性能指標見表2。

3 討論

結核病是由結核分枝桿菌引起的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染性疾病，是2019年之前導致人類死亡最多最古老的傳染病之一［10-12］。盡管相關研究已經進行了差不多一個世紀，取得了進展，但尚未明確用于診斷和監(jiān)測疾病進展過程中，重復性較好、易于量化的檢測指標［13］。而目前結核抗體的診斷價值不大，易導致誤診漏診，細胞免疫方面的檢測還未有明確結論。本項目顯示，結核抗體中，最佳臨界值下16KD 的臨床診斷價值最高，細胞免疫相關指標中RF、CD45+CD3+%、CD45+CD64+%在肺結核臨床診斷中具有較高的臨床應用價值。通過本研究結果，在結核病診斷中，可以先用快速、經濟、簡便的結核抗體16KD 進行快速篩查，再用RF、CD45+CD3+%、CD45+CD64+%三個指標彌補16KD 的缺陷。

有研究表明，主要以LAM、38KD 及16KD 三項聯(lián)合定性檢測初治結核病患者血清抗體的蛋白芯片技術敏感度為66.2%～69.2%［14-15］，而16KD、38KD、CFP-10、ESAT-6 和LAM 五項聯(lián)合的定性檢測抗體的敏感度為71.2%［16］。上述結果與我們目前在臨床實際應用的情況相符。然而，在我們嘗試定量檢測分析結核抗體得出最佳臨界值后，結核五項各指標的臨床診斷價值均得到提升，其中16KD 的臨床診斷價值為五項最高，AUC 為0.748，最佳臨界值為1.031，靈敏度（82.18%）高于多項聯(lián)合的定性檢測（表2）。早期、快速、準確的診斷對于控制結核病流行具有顯著效果［17］，所以不應放棄研究取樣方便、操作簡單快速的結核抗體檢測。我們的研究成果表明定量檢測可以顯著提升結核抗體的臨床診斷價值，最佳臨界值的單項16KD 定量檢測足以替代多項聯(lián)合的定性檢測，為臨床提供更高的診斷價值，更便捷、更快速、更經濟的檢測方案。

表2 各檢測項目診斷性試驗評價指標分析Tab.2 Analysis of diagnostic test evaluation index of each test item

CD161 是一種C 型凝集素樣受體，CD161+細胞是人類記憶Th17 細胞的標志，是表現炎癥活性的細胞亞群，有結果表明，在結核菌刺激下，CD161+亞群的百分率下降［18-19］。相關研究報道，包括CD36、CD38、CD44、CD263、CD55、CD33、CD18 和CD161在內的大分子里，CD161 是區(qū)分結核患者的最佳標志物，CD161+T 細胞的百分比明顯低于健康對照組，感染風險指數RF 的靈敏度和特異度在72%左右［20］。另有研究發(fā)現結核患者CD45+單個核細胞數表達較高，有助于結核病的診斷［21］。單核細胞屬于先天免疫系統(tǒng)，CD64+單核細胞在結核患者中的表達顯著升高，敏感度為76.6%，特異度為73.3%，在對抗結核桿菌方面發(fā)揮著關鍵作用［22］。有學者研究指出，結核患者CD3+淋巴細胞的百分比顯著低于健康對照組［20］。結核患者免疫功能的不同易導致結核抗體的階段特異性，患者體內免疫細胞相關指標可隨著疾病的發(fā)展而發(fā)生變化［23-24］。在此背景，我們選擇了CD45+CD3+淋巴細胞、CD45+CD64+單核細胞、CD161+細胞以及RF 作為檢測結核病的相關指標。上述研究結果的細胞表達趨勢基本與我們的研究結果相符合。CD45+CD3+%、CD45+CD64+%和RF 的AUC 均大于0.83，臨床診斷價值較高（圖1）。其中由CD45+CD3+淋巴細胞、CD45+CD64+單核細胞、CD161+細胞建立的結核菌感染風險指數RF 臨床診斷價值最高，最佳臨界值0.469，靈敏度75.74%略高于相關報道的72%，特異度92.50%則顯著高于72%，其余診斷評價指標均較高（表2）。我們的結果表明，結核抗體16KD可與CD45+CD3+%、CD45+CD64+%、RF 結合使用，優(yōu)勢互補。

免疫學檢測是病原學檢測的有力補充，病原學檢測用于結核病的鑒別診斷，確保不出錯，免疫學檢測用于結核病的初篩，盡量不漏診，二者可聯(lián)合檢測，綜合判讀，彌補不足。本實驗通過ROC 曲線得出各指標的最佳臨界值，篩選出在結核病診斷中具有重要臨床價值的指標，為臨床提供了一種新穎、便捷、快速、經濟的診斷解決方案，解決當前結核病診斷的局限性，為進一步的大樣本研究提供基礎。但本研究仍存在不足，如未分析其他肺部疾病與上述指標的關系，樣本量未足夠大，代表性未足夠強，還需繼續(xù)對16KD 與免疫細胞的臨床價值深入研究。

【Author contribution】LIU Zhenning：Conceptualization，Methodology，Writing-Original Draft. XU Yunyi：Writing-Review & Editing，Resources. HU Lihuan：Investigation，Validation. LIU Zhihui：Data Curation，Supervision. HU Jinxing：Project Administration. LI Hua：Software，Validation. GUANG Ping：Resources，Supervision.