范軍強，武軍艷，劉麗君，馬驪，楊剛，蒲媛媛，李學(xué)才，孫萬倉?

1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，蘭州 730070；2省部共建干旱生境作物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730070

0 引言

【研究意義】氣孔是植物適應(yīng)逆境的重要葉片結(jié)構(gòu)。氣孔開閉直接影響植物體內(nèi)部的CO2及水分含量，進而影響光合作用及蒸騰作用的速率，逆境下的氣孔關(guān)閉導(dǎo)致植物光合作用下降，同化產(chǎn)物供應(yīng)減少，因此，氣孔調(diào)節(jié)在碳同化和有關(guān)水分的生理活動中具有重要作用，在植物用水效率及碳和水循環(huán)方面具有重要意義[1]，同時，在植物應(yīng)對逆境脅迫中也發(fā)揮重要作用[2]。了解氣孔的響應(yīng)機制與植物抗寒性的變化規(guī)律，對解析植物在低溫逆境下的適應(yīng)性有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】氣孔隨著環(huán)境溫度的變化而發(fā)生運動[3]。低溫環(huán)境脅迫使氣孔趨于關(guān)閉，直接引起氣孔導(dǎo)度的變化[4]。植物通過其體內(nèi)大量的生理代謝抵抗非生物脅迫引起的內(nèi)環(huán)境動態(tài)變化。低溫不但會引起氣孔的異常開閉[5]，同時還可以提高ABA的含量[6]，通過增加氣孔中二氧化碳的濃度，間接降低氣孔開度，影響光合作用[7]。夜間低溫條件下，番茄葉片氣孔導(dǎo)度和氣孔面積顯著降低[8]，對開花期水稻孕穗進行低溫處理，低溫脅迫越強，氣孔導(dǎo)度的值就越小[9]。目前為止，發(fā)現(xiàn)各種生物和非生物脅迫因素可能會迅速改變氣孔開度，而對這些刺激的反應(yīng)取決于保衛(wèi)細胞內(nèi)復(fù)雜的信號傳輸網(wǎng)絡(luò)[10]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)并鑒定了氣孔調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵信號節(jié)點[11]。這些分子在特定的生境中，在亞細胞定位和遷移、蛋白質(zhì)翻譯后修飾、細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)變化、離子通道開閉和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等環(huán)境因子的持續(xù)波動下，對氣孔進行精確調(diào)控[12]。據(jù)報道，冬性油菜品種的凈同化率和 CO2交換率高于春性品種[13]，這是氣孔對低溫的反應(yīng)而非適應(yīng)[14]，表明氣孔開度的調(diào)節(jié)對抗寒性有重要作用。有學(xué)者補充煙草葉片在保衛(wèi)細胞增加外源鈣吸收基礎(chǔ)上表現(xiàn)出冷誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，此反應(yīng)不會發(fā)生在冷敏感的品種中[7]?！颈狙芯壳腥朦c】北方地區(qū)甘藍型冬油菜越冬前地上部與地下部會逐漸停止生長[15]，葉片逐漸干枯死亡[16]。此時，葉片中發(fā)生復(fù)雜的代謝活動，從而適應(yīng)冬季低溫環(huán)境。氣孔作為光合作用、呼吸作用、蒸騰作用的門戶直接影響越冬前的生物量積累[17]，間接影響冬油菜對越冬時環(huán)境的適應(yīng)。2000年起，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)等對北方甘藍型冬油進行了抗寒性品種改良研究，但是，改良品種在低溫脅迫后的氣孔運動是否發(fā)生變化，尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以抗寒性不同的 14個甘藍型冬油菜品種為材料，對低溫條件下不同抗寒性材料氣孔運動特性與抗寒性進行相關(guān)性分析，探究甘藍型冬油菜抗寒性與氣孔運動特征存在的關(guān)系，為解析強冬性甘藍型冬油菜抗寒機理提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用 14個抗寒性不同的甘藍型冬油菜品種為研究材料，其中10個來源于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，4個來自天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。各品種基本信息見電子附表1。

1.2 試驗設(shè)計

2021年8月21日將供試材料種子置于培養(yǎng)皿中萌發(fā)，于2021年8月25日統(tǒng)一移栽至直徑為25 cm、高度為12 cm的樹脂花盆中。每盆裝入4 kg已加水?dāng)嚢杈鶆虻挠缁|(zhì)，每盆種3穴，每穴1苗，放置于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)百草園生長。六葉期取樣處理及觀測。

處理：試驗共設(shè)3個處理，分別為24℃處理12 h、0℃處理 1 h和 0℃處理 12 h（全部盆栽均需先置于24℃培養(yǎng)12 h），處理過程中光照及水分條件一致。每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

采樣：處理結(jié)束后快速采樣。第2片葉用于氣孔觀察。每株展開的第3片葉用于生理指標(biāo)的測定。第4片葉用于葉片相對含水量的測定。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 半致死溫度（LT50）測定 試驗材料于 24℃培養(yǎng)12 h后，用打孔器將展開的第3片葉上打3個直徑為5 mm的葉圓片（注意避開葉脈），裝入10 mL離心管中，并加入0.2 mL去離子水，對照只加入去離子水，分別置于0℃、-4℃、-8℃、-12℃和-16℃條件下處理30 min，每個溫度設(shè)置3個重復(fù)。取出后再加入10 mL去離子水，室溫震蕩1 h，用電導(dǎo)儀測處理樣品的電導(dǎo)率C1和對照的電導(dǎo)率C0。置于120℃烘箱20 min，冷卻至室溫后，測電導(dǎo)率C2，相對電導(dǎo)率（relative electric conductivity，REC）＝(C1-C0)/(C2-C0)×100%。

1.3.2 生理指標(biāo)測定 使用烘干法測定葉片相對含水量；氮藍四唑法（NBT）測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）；使用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）；采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）；采用硫代巴比妥酸法（TBA）測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量；采用磺基水楊酸浸提-酸性茚三酮顯色法測量游離脯氨酸（proline，Pro）含量[18]。生理指標(biāo)的測定設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，不設(shè)置技術(shù)重復(fù)。

1.3.3 氣孔制片及觀察測量 氣孔制片：采用改良后的指甲油涂抹撕取法[19]。選用不含色素的透明指甲油，在植株展開的第2片葉片下表皮葉脈左側(cè)上下居中的固定位置均勻涂抹一個薄層，大小約為1 cm×1 cm的矩形。晾干10 min左右（時間長短因環(huán)境條件不同），涂抹痕跡邊緣會出現(xiàn)離口。剪下長寬適宜的透明膠帶，膠面平貼于涂抹部位，輕輕撕下后貼于載玻片上，制片完成。

制片觀察：使用正倒置一體顯微鏡（型號為Echo Revolve FL）拍照觀察，放大倍數(shù)為 40×10。使用ImageJ軟件測量，測量指標(biāo)包括氣孔孔隙長（stomatal pore length）、氣孔孔隙寬（stomatal pore width）、氣孔孔隙面積（area of stomatal pore）、氣孔孔隙周長（circumference of stomatal pore）、氣孔器長（stomatal apparatus length）、氣孔器寬（stomatal apparatus width）、氣孔器面積（area of stomatal apparatus）、氣孔器周長（circumference of stomatal apparatus）、保衛(wèi)細胞寬（guard cell width）、視野內(nèi)氣孔數(shù)（number of pores in visual field）、氣孔開度（stomatal aperture）、氣孔關(guān)閉率（stomatal closure rate），具體意義見圖1。其中，氣孔開度=氣孔孔隙長×氣孔孔隙寬，視野內(nèi)氣孔數(shù)指在400倍放大下圓形視野內(nèi)的氣孔個數(shù)（圓形視野面積：0.2409 mm2），氣孔關(guān)閉率=視野中關(guān)閉氣孔的數(shù)量/視野中全部氣孔數(shù)。每張制片測定3個視野，3個視野內(nèi)的全部氣孔均需測量全部12個指標(biāo)。

圖1 氣孔指標(biāo)Fig.1 Stomatal index

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析方法

1.4.1 Logistic回歸方程分析 對測定的相對電導(dǎo)率進行Logistic回歸分析，回歸模型為：

其中，y為相對電導(dǎo)率，t代表處理溫度，k為細胞傷害率的飽和容量，a、b為方程參數(shù)。因本試驗中細胞傷害率消除了干擾，故k值為100。為確定a、b值，將Logistic方程轉(zhuǎn)化為：

則方程轉(zhuǎn)化為y′與t之間的線性方程，即：y′=ln(a)-by

1.4.2 綜合評價數(shù)據(jù)分析 參照蒲媛媛等[20]方法計算單項指標(biāo)耐寒系數(shù)，耐寒系數(shù)（K）=（低溫測定值/常溫測定值）。多重比較采用Tukey b的方法進行相同處理溫度下品種間對比。

1.4.2.1 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化 運用極差法對各指標(biāo)耐寒系數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理：

式中，xij表示i品種第j個指標(biāo)的K值；xmin表示第j個指標(biāo)K值的最小值；xmax表示第j個指標(biāo)K值的最大值。指標(biāo)與抗寒性成正相關(guān)用標(biāo)準(zhǔn)化公式（1）計算，指標(biāo)與抗寒性呈負相關(guān)用公式（2）計算。

1.4.2.2 隸屬函數(shù)綜合評價 采用標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)法計算權(quán)重。標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)計算公式為（3），權(quán)重系數(shù)計算公式為（4）。

式中，n表示i個品種，m表示SOD、POD、CAT、MDA、Pro、葉片相對含水量j個指標(biāo)。

綜合評價值公式如下：

1.4.2.3 主成分分析綜合評價 建立變量之間的相關(guān)系數(shù)矩陣：相關(guān)系數(shù)矩陣R=(rij)m×m

式中，rii=1，rij=rji，rij是第i個指標(biāo)與第j個指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)。

計算相關(guān)系數(shù)矩陣R的特征值和特征向量：計算相關(guān)系數(shù)矩陣R的特征值λ1≥λ2≥…≥λm≥0，及對應(yīng)特征向量u1，u2，……，um，其中uj=(u1j,u2j,…,unj)T，由特征向量m個新的指標(biāo)變量。

式中，y1是第一主成分，y2是第二主成分，……，ym是第m主成分。

寫出主成分并計算綜合得分：計算特征值λj（j=1，2,…,m）的信息貢獻率。

貢獻率，當(dāng)αp接近于 1（αp=0.85，0.90，0.95）時，則選擇前p個指標(biāo)變量y1，y2，……，yp作為p個主成分，代替原來m個指標(biāo)變量，從而可以對p個主成分進行綜合分析。接著計算綜合得分，其中，bj為第j個主成分的信息貢獻率。

2 結(jié)果

2.1 不同抗寒性甘藍型冬油菜半致死溫度（LT50）

相對電導(dǎo)率可表示細胞膜透性，離體葉片在一定溫度范圍內(nèi)的滲透情況具有反映細胞膜受傷程度的作用。當(dāng)處理低溫低于半致死溫度時，植物將受到不可逆的傷害，相對電導(dǎo)率快速升高。低溫半致死溫度高低是反映植物抗寒性強弱的重要指標(biāo)。強抗寒性品種相對電導(dǎo)率升高速率較弱抗寒性品種慢，其中，gau系列相對電導(dǎo)率在-12℃達到較高水平，抗寒性相對較弱的天油系列在-8℃達到較高水平。根據(jù)LT50鑒定14個品種的抗寒性為gau-1（-8.06）＞gau-24（-7.83）＞gau-30（-7.58）＞gau-39（-7.44）＞ts309（-7.28）＞ts312（-7.08）＞nts158（-6.81）＞npz269（-6.62）＞天油 14 號（-5.98）＞16-2444（-5.4）＞17-2251（-5.13）＞天油2266（-4.8）＞天油2238（-4.6）＞天油2288（-4.38）?；貧w分析后的擬合度處于 0.88—0.97（表1），可用于進一步分析。

2.2 不同抗寒性甘藍型冬油菜低溫處理下的生理響應(yīng)特征

2.2.1 葉片中抗氧化酶活性變化 在低溫處理后的葉片中，3種抗氧化酶（SOD、POD和CAT）的活性均呈上升趨勢，但增幅不同。常溫下，3種酶的活性處于最高值的品種分別是天油 2238（SOD酶活性為440.86 U·g-1FW）、npz269（POD 酶活性為 40.11 U·g-1·min-1）和天油 2238（CAT 酶活性為 32.60 U·g-1·min-1），均是半致死溫度較高的材料，低溫處理前后，品種間增幅差異顯著（圖2-A—C），且規(guī)律明顯。增幅較大的品種有 gau1（SOD 40.26%、POD 165.61%、CAT 66.54%）和gau24（SOD 30.95%、POD 146.11%、CAT 60.83%）。常溫條件下，天油 2238的3種酶活性均表現(xiàn)出較高水平，低溫后增幅較小。

圖2 甘藍型冬油菜低溫下的生理響應(yīng)Fig.2 Physiological Responses of winter Brassica napus under low temperature

2.2.2 葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累也是植物調(diào)節(jié)抗逆性的方式。試驗結(jié)果（圖2-D—E）顯示，低溫下丙二醛和游離脯氨酸含量均有所增加，但增幅變化趨勢明顯相反。常溫下游離脯氨酸含量最高的品種為天油2238（369.65 mg·g-1），最低為 gau-24（141.12 mg·g-1），低溫處理后增幅最為明顯的是gau-1（149.66%）。常溫條件下，天油2238、天油 2266、天油 2288的丙二醛含量（2.10、1.69和1.24 μmol·g-1）較低，低溫處理后的變化量較為突出，較對照分別增加160.76%、145.64%和194.15%。常溫條件下，gau-24、gau-39的丙二醛含量（3.59和3.07 μmol·g-1）較高，低溫處理后增幅較小，分別為62.27%和78.72%。

2.2.3 葉片相對含水量的變化 葉片相對含水量在低溫處理后明顯降低，且反應(yīng)靈敏。常溫下葉片相對含水量品種間差異不顯著，處于 82.52%—93.59%。低溫處理后變化明顯，天油2238、天油2266和天油2288下降最為明顯，降至61.41%、66.25%和61.47%。

2.3 參試材料抗寒性評價

2.3.1 隸屬函數(shù)法綜合評價 將依據(jù)耐寒系數(shù)公式計算得到的數(shù)據(jù)列于表2，除LRWC以外，其余指標(biāo)耐寒系數(shù)均大于 1。14個品種各指標(biāo)耐寒系數(shù)均值POD及MDA較大，表明2個指標(biāo)相對于對照增幅更大。運用極差法對各指標(biāo)耐寒系數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化，得到的無量綱數(shù)據(jù)列于表3，最大值1多分布于gau-1，最小值0全部分布于天油2288。對每個指標(biāo)賦予利用標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)法算得的權(quán)重，求得各品種的綜合評價值（D），該數(shù)據(jù)越大表明抗寒性越強。D值最大的品種為gau-1（0.990），最小的為天油2288（0.000）。據(jù)此獲得的抗寒性為gau-1（0.990）＞gau-24（0.876）＞gau-30（0.693）＞gau-39（0.644）＞ts309（0.534）＞ts312（0.463）＞nts158（0.439）＞npz269（0.388）＞天油 14號（0.352）＞16-2444（0.307）＞17-2251（0.282）＞天油2266（0.236）＞天油2238（0.126）＞天油2288（0.000）。

表2 主要生理指標(biāo)的耐寒系數(shù)評價Table 2 Coefficients of cold tolerance evaluated of main physiological traits

表3 隸屬函數(shù)值和綜合評價值結(jié)果Table 3 Subordinator functional components and the integrated evaluation index for winter Brassica napus

2.3.2 半致死溫度與相關(guān)指標(biāo)間相關(guān)性分析 對半致死溫度與綜合評價值（D）、SOD、MDA、POD、CAT、Pro、LRWC分別做相關(guān)性分析（表4）。結(jié)果顯示，半致死溫度與綜合評價值（D）、SOD、POD、CAT、Pro之間呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)性（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)處于-0.959—-0.831。與MDA間呈極顯著正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.959。

表4 半致死溫度與生理指標(biāo)的相關(guān)性Table 4 Correlation analysis of semi-lethal temperature and physiologic index

2.4 不同抗寒性甘藍型冬油菜氣孔運動特性

各指標(biāo)的分析樣本數(shù)量列于表 5。各處理品種間氣孔孔隙長差異顯著（圖 3-A），連續(xù)的低溫處理，使大部分品種氣孔孔隙長在1 h時出現(xiàn)下降，處理12 h后，gau-1、gau-24、gau-30、gau-39與對照持平，天油2238、天油2266天油2288較對照明顯下降。氣孔孔隙寬低溫處理后下降幅度大，天油2266和天油2288下降明顯，天油2266 12 h處理后自7.34 μm降至5.84 μm，天油2288由9.14 μm降至6.68 μm（圖3-B）。處理12 h后氣孔孔隙面積天油2266自144.35 μm2降至 107.56 μm2，天油2288自 211.17 μm2降至142.37 μm2（圖3-C），2個品種低溫處理后降低明顯。氣孔孔隙周長（圖 3-D）與氣孔器長（圖 3-E）各品種 3個處理間差異不顯著。天油2288氣孔器寬度（圖3-F）低溫處理12 h后減小5.85 μm，降幅較大。天油2288氣孔器面積在低溫處理后與對照相比下降了 28.53%（圖 3-G）。氣孔器周長（圖 3-H）變化不明顯。保衛(wèi)細胞寬度的變化（圖3-I），gau-1、天油14、ts312品種低溫處理與對照持平，12 h處理后變化范圍為0.01—0.05 μm。視野內(nèi)氣孔數(shù)除16-2444和npz269以外，其余品種低溫處理后均呈現(xiàn)增加趨勢（圖3-J）。

氣孔開度是綜合氣孔孔隙長和氣孔孔隙寬2個指標(biāo)的綜合指標(biāo)，變化幅度明顯。14個品種總體變化范圍為251.15—101.29 μm2。14個品種的平均氣孔關(guān)閉率（圖3-L）為 31.01%（24℃）、40.07%（0℃ 1 h）和 35.99%（0℃ 12 h），0℃低溫處理后有明顯上升趨勢。

圖3 甘藍型冬油菜低溫下的氣孔運動Fig.3 Stomatal movement of winter Brassica napus at low temperature

表5 各指標(biāo)測量的樣本數(shù)量Table 5 The number of samples measured by each index

將強冬性品種gau-24、冬性品種天油14及弱冬性品種天油2288的氣孔制片按不同處理排列于圖4。24℃條件下全部品種視野內(nèi)大部分（平均為68.99%）表現(xiàn)為張開，保衛(wèi)細胞能快速對 0℃低溫做出反應(yīng)，在對照的基礎(chǔ)上表現(xiàn)出部分氣孔的關(guān)閉，視野中未關(guān)閉的氣孔也有關(guān)閉趨勢（氣孔孔隙面積等指標(biāo)較對照減小）。不同抗寒性品種在 0℃處理后氣孔形態(tài)保持能力不同，強冬性品種gau-24在0℃處理12 h后1個氣孔關(guān)閉；弱冬性品種天油2288在1 h處理后全部氣孔的氣孔孔隙均有明顯的變小，12 h處理后關(guān)閉數(shù)量為4個；冬性品種天油14的氣孔對低溫的耐受性居中。

圖4 甘藍型冬油菜低溫下的氣孔圖Fig.4 Stomatal of winter Brassica napus at low temperature

2.5 不同抗寒性甘藍型冬油菜氣孔特性綜合評價

計算0℃處理1 h的12個氣孔評價指標(biāo)的耐寒系數(shù)（表6）。參試材料間耐寒系數(shù)差異顯著（P<0.05），14個品種相同指標(biāo)K值變化無明顯規(guī)律。分析12個氣孔評價指標(biāo)的耐寒系數(shù)與品種抗寒性間的關(guān)系，進行相關(guān)性分析（表 7），除氣孔關(guān)閉率與半致死溫度間有P<0.05水平上的正相關(guān)外，其余指標(biāo)間并無顯著相關(guān)，不繼續(xù)分析。

表6 0℃ 1 h耐寒系數(shù)評價Table 6 Coefficients of cold tolerance evaluated of treatment at 0℃ for 1 h

表7 0℃ 1 h抗寒性指標(biāo)與氣孔評價指標(biāo)間的相關(guān)性Table 7 Correlation between cold resistance index and stomatal evaluation index

0℃處理12 h后，參試材料間的耐寒系數(shù)差異顯著（P<0.05）。提取各指標(biāo)K值較大的4個品種，高頻率出現(xiàn)的品種有g(shù)au-24、gau-30、16-2444和nts158。求各品種 12個指標(biāo)平均 K值，較大的 4個品種為nts158、gau-24、16-2444和gau-30，前后2種結(jié)果相同，但并不與抗寒性排序相近，所以需要進行主成分分析來綜合評價低溫下的氣孔運動狀態(tài)及分析各個指標(biāo)對于綜合評價值Z的影響（表8）。

根據(jù)耐寒系數(shù)列出各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)矩陣并計算相關(guān)系數(shù)矩陣R的特征值及特征向量，再使用提取成分的特征值和貢獻率聯(lián)系各成分下各指標(biāo)中的因子載荷算得權(quán)重，特征值、因子載荷、貢獻率，算得的權(quán)重列于表9。

表9 0℃ 12 h主成分分析相關(guān)指標(biāo)Table 9 Indicators related to principal component analysis for 12 h at 0℃

12 h處理下的數(shù)據(jù)共提取出3個成分，3個成分的累積貢獻率達92.690%，可以充分表述該項目。主要影響成分1的10個指標(biāo)按因子載荷由大到小排

序為氣孔器面積、氣孔孔隙周長、氣孔器周長、氣孔器長、氣孔器寬、氣孔開度、氣孔孔隙長、氣孔孔隙面積、保衛(wèi)細胞寬、氣孔孔隙寬，其中氣孔器面積、氣孔孔隙周長、氣孔器周長的值更接近于1，對成分1的影響更大。主要影響成分2的指標(biāo)有視野內(nèi)氣孔數(shù)，影響成分3的主要指標(biāo)為氣孔關(guān)閉率。成分1的貢獻率達到71.080%，故成分1中的主要影響指標(biāo)就可以說明氣孔的運動。貢獻率為13.128%和8.482%的成分2和成分3對氣孔運動的評價不能忽略。

對標(biāo)準(zhǔn)化后的耐寒系數(shù)賦予權(quán)重得到綜合評價值Z（表10）。弱冬性品種天油2288的12個指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)中9個為最小值0，綜合評價值也為最小。對求得的綜合評價值Z從大到小排序按從大到小排序為gau-24、nts158、16-2444、gau-30、npz269、ts309、gau-39、ts312、天油2238、gau-1、天油14、天油2266、17-2251、天油2288。其排序與抗寒性評價指標(biāo)排序大致相同。

表10 0℃ 12 h標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)和綜合評價Table 10 0℃ for 12 h standardized data and comprehensive evaluation

分析抗寒性與低溫下氣孔運動的相關(guān)性是利用綜合評價值D、半致死溫度與12個指標(biāo)及綜合評價值Z之間的相關(guān)性（表11）。0℃ 12 h條件下，與綜合評價值D相關(guān)性顯著的指標(biāo)有氣孔孔隙長、氣孔孔隙周長、氣孔器長、氣孔器面積、氣孔器周長。與D值顯著相關(guān)的指標(biāo)均與半致死溫度顯著相關(guān)，氣孔孔隙面積及綜合評價值Z也與半致死溫度顯著相關(guān)，氣孔孔隙周長及氣孔關(guān)閉率與半致死溫度極顯著相關(guān)。

表11 0℃ 12 h抗寒性指標(biāo)與氣孔評價指標(biāo)間的相關(guān)性Table 11 Correlation between cold resistance index and stomatal evaluation index at 0℃ for 12 h

3 討論

3.1 逆境下的氣孔運動評價

多個指標(biāo)的氣孔特性綜合評價更能全面地解釋和闡述氣孔運動過程。何荊洲等[21]對 25個蝴蝶蘭品種分類時綜合了 13個氣孔相關(guān)指標(biāo)進行主成分分析后準(zhǔn)確分類為大花型（花長＞8 cm）、小花型（花長＜4.5 cm）和花瓣無線紋或線紋非紫色三類。王孟珂等[22]在評估文冠果種質(zhì)資源的抗旱性時采用了主成分分析加隸屬函數(shù)的方法，從來自干旱和半干旱地區(qū)的 108份文冠果種質(zhì)資源中選出了31份強抗旱種質(zhì)資源。本研究采用主成分分析提取出3個成分，分析每個指標(biāo)對不同成分的影響，發(fā)現(xiàn)其均對于氣孔運動評價都有貢獻，綜合這些指標(biāo)并賦予合適的權(quán)重能獲得科學(xué)且適宜的評價。相關(guān)性分析結(jié)果，12個氣孔相關(guān)指標(biāo)的綜合評價值與抗寒性間顯著相關(guān)。在葉片生長過程中，保衛(wèi)細胞的發(fā)育調(diào)控機制尚不完全清楚[23]，但在此過程中外界環(huán)境因素及品種特性等均會改變下表皮細胞的發(fā)育方向[24]。低溫處理會使氣孔向不同方向或相同方向發(fā)生不同程度的變化[25]。因此，相較于只利用氣孔性狀的單個指標(biāo)評價低溫下氣孔運動特性及與抗寒性的關(guān)系，綜合評價更加全面客觀。

3.2 利用耐寒系數(shù)評價氣孔運動與抗逆性的關(guān)系

多數(shù)學(xué)者在利用氣孔指標(biāo)評價抗逆性時只考量靜態(tài)氣孔結(jié)構(gòu)，有時會出現(xiàn)抗逆性評價結(jié)果相反的情況。如鐘克友等[26]在研究水稻耐冷性時認為氣孔較大的品種耐冷性較弱，趙躍龍等[27]在水稻上也得出了相同的結(jié)論。而李映暉等[28]對3個菠蘿品種的抗寒性研究發(fā)現(xiàn)氣孔大的品種抗寒性強。吳林等[29]認為氣孔大小等單一氣孔性狀與越橘抗寒性無明顯的關(guān)系。崔國文等[30]和王暉等[31]也認為氣孔大小這一指標(biāo)與植物抗寒性無顯著相關(guān)。再如氣孔密度，宋緒忠[32]在茶樹上的試驗結(jié)果認為氣孔密度與抗寒性呈正相關(guān)。但李國華等[33]在澳洲堅果上的研究表明氣孔密度小的抗寒性強。這些存在一定相互矛盾的結(jié)論從側(cè)面印證了靜態(tài)氣孔結(jié)構(gòu)評價抗寒性具有一定的片面性。本研究通過對比氣孔靜態(tài)結(jié)構(gòu)評價指標(biāo)在低溫處理前后的相對變化，分析了不同抗寒性甘藍型冬油菜氣孔特性存在的差異。常溫下及0℃處理1 h后12個氣孔指標(biāo)與半致死溫度均無顯著相關(guān)，0℃處理12 h后做相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)氣孔孔隙長、氣孔孔隙寬、氣孔孔隙面積、氣孔孔隙周長、氣孔開度5個指標(biāo)與半致死溫度存在顯著相關(guān)。引入對照組使用耐寒系數(shù)后7個指標(biāo)與抗寒性顯著相關(guān)。

3.3 不同抗寒性品種間氣孔特性差異

保衛(wèi)細胞細胞壁不均一性[34]與微絲骨架[35]共同作用調(diào)節(jié)氣孔運動過程中氣孔形狀的改變，根據(jù)氣孔制片的觀察及12個指標(biāo)的統(tǒng)計分析結(jié)果，甘藍型冬油菜氣孔遭受低溫脅迫后整體氣孔（包括氣孔孔隙與氣孔器）變小。氣孔動態(tài)變化及靜態(tài)結(jié)構(gòu)的差異構(gòu)成不同抗寒性甘藍型冬油菜品種的氣孔特性。不同抗逆性的植物在應(yīng)對逆境的調(diào)節(jié)過程中氣孔特性不同[36]，本試驗統(tǒng)計的氣孔關(guān)閉率表明強抗寒性品種低溫處理后保持張開的比率高，強冬性甘藍型冬油菜品種 0℃處理12 h后氣孔孔隙長、氣孔孔隙面積、氣孔孔隙周長、氣孔器長、氣孔器面積、氣孔器周長的耐寒系數(shù)及綜合評價氣孔特性的Z值明顯大于冬性、半冬性及弱冬性甘藍型冬油菜，表明強冬性品種氣孔在低溫處理后變化小，趨于保持張開。

3.4 甘藍型冬油菜氣孔運動與抗寒性的關(guān)系

植物對低溫損傷的響應(yīng)是通過改變相關(guān)組織或細胞結(jié)構(gòu)實現(xiàn)的[36]。其中，氣孔的開張是一個重要變化[5,37]。普遍的理論認為氣孔運動與抗寒性間存在密切關(guān)系[38]。JURCZYK 等[14]研究發(fā)現(xiàn)耐寒性較差的大麥植株氣孔導(dǎo)度會降低，相反抗寒性強的品種低溫處理后氣孔導(dǎo)度變化不大。同樣，WILSON[39]研究發(fā)現(xiàn)抗寒性強的物種在低溫下通常表現(xiàn)為氣孔開放。本研究共觀測14個品種低溫下的12個氣孔指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)甘藍型冬油菜氣孔運動確與抗寒性相關(guān)。研究顯示12個單一鑒定指標(biāo)中有7個與抗寒性指標(biāo)顯著相關(guān)，分別為氣孔孔隙長、氣孔孔隙面積、氣孔孔隙周長、氣孔器長、氣孔器面積、氣孔器周長、氣孔關(guān)閉率，7個指標(biāo)均與抗寒性正相關(guān)。同時，本試驗在對0℃處理1和12 h材料的觀測發(fā)現(xiàn)，1 h氣孔運動并不與抗寒性相關(guān)，到12 h時相關(guān)性才顯著。

氣孔的運動與生理代謝有較強的關(guān)聯(lián)作用，研究中常以生理指標(biāo)為抗寒性評價的重要依據(jù)。有人認為植物體內(nèi)大量的生理代謝引起細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的變化，繼而導(dǎo)致氣孔的異常開閉[4]。影響氣孔運動最直接的因素是保衛(wèi)細胞水分含量的變化，DAVIES等[40]認為低溫切斷了根系供水導(dǎo)致了氣孔關(guān)閉。試驗對抗氧化酶、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及葉片相對含水量的測定結(jié)果顯示低溫處理后相對含水量高且能保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的品種氣孔保持張開狀態(tài)的能力更強。

4 結(jié)論

低溫處理可顯著影響甘藍型冬油菜的氣孔運動，且隨低溫處理時間的延長氣孔趨向關(guān)閉的特征更為明顯。同時，不同感溫性品種其氣孔的相對變化差異大，抗寒性較強的品種在低溫處理后氣孔保持張開的能力更強。