梁 悅，許瑞雪，蔡淑嫣 綜述，蔣學(xué)風(fēng) 審校

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510632)

人類子宮內(nèi)膜位于子宮內(nèi)層，是一種復(fù)雜的、動態(tài)的、可再生組織，對人類生殖是必不可少的，具有周期性脫落、修復(fù)、再生、重塑等特征，此過程中產(chǎn)生任何變化均可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的發(fā)生，影響婦女的健康。雖然對子宮內(nèi)膜不同類型疾病的病理機制有了一定的了解，但相關(guān)分子機制仍需深入挖掘。要研究與子宮內(nèi)膜生物學(xué)相關(guān)的細胞和分子機制需建立合適的體內(nèi)、外模型。

目前，常用的模型有2-D細胞系培養(yǎng)、動物模型、患者來源的腫瘤異種移植模型等。單層細胞培養(yǎng)常被用于疾病的體外研究，然而，傳統(tǒng)二維細胞培養(yǎng)的細胞系因連續(xù)傳代后的染色體積累突變、原發(fā)癌特性消失、三維(3D)空間結(jié)構(gòu)的缺乏使其無法表現(xiàn)出原始組織的特性[1]。因此，需更合適的體外細胞模型系統(tǒng)進行子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的研究。

類器官指的是各種3D細胞結(jié)構(gòu)，其微結(jié)構(gòu)、細胞組成及功能與天然組織相似。類器官作為一種新興的技術(shù)可使干細胞無限擴張?；颊邅碓吹哪[瘤類器官可培養(yǎng)6個月以上，并形成與其來源腫瘤形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的細胞團。比較全面的組織學(xué)與基因表達分析證明，即使經(jīng)過長期培養(yǎng)，患者來源的腫瘤類器官特性仍與其來源的腫瘤相似[2]。有研究表明，類器官已作為研究腸、肝、胰腺、前列腺、輸卵管、腎臟等生理病理的寶貴工具[3]。類器官的出現(xiàn)為模擬和探索正常發(fā)育，疾病發(fā)生、發(fā)展過程，藥物篩選提供了新的方式。目前，關(guān)于子宮內(nèi)膜類器官的相關(guān)文獻報道仍較少見，本文綜述了子宮內(nèi)膜類器官優(yōu)勢、特征及目前研究進展，旨在為揭示疾病發(fā)生、發(fā)展機制，研發(fā)相關(guān)藥物提供模型參考。

1 子宮內(nèi)膜類器官

子宮內(nèi)膜類器官可由一種細胞類型組成，通常為上皮細胞，也可包括其他類型細胞。早在1986年有學(xué)者首次嘗試建立子宮內(nèi)膜類器官模型[4]。后來TURCO等[3]和BORETTO等[5]從小鼠和人類子宮內(nèi)膜中提取內(nèi)膜組織后成功培養(yǎng)了子宮內(nèi)膜類器官，并且可長期傳代，超過4～6個月。2019年BORETTO等[6]和FITZGERALD等[7]進一步研究了來源于正常子宮內(nèi)膜與異常子宮內(nèi)膜的人類子宮內(nèi)膜類器官的特性，包括子宮內(nèi)膜類器官培養(yǎng)所需的特定成分、表型和遺傳特征，以及其對激素的反應(yīng)。同年MURPHY等[8]建立了一個包含子宮內(nèi)膜上皮細胞和間質(zhì)細胞的多細胞子宮內(nèi)膜類器官模型，這種類器官模型由極化的上皮細胞和周圍的間質(zhì)細胞組成，具有分泌膠原、黏蛋白等功能特征。此模型由于包含上皮細胞和間質(zhì)細胞，因此，可供研究這兩種不同細胞類型之間的旁分泌作用。

1.1子宮內(nèi)膜類器官的組織學(xué)特點 來源于子宮內(nèi)膜上皮的子宮內(nèi)膜類器官表達上皮細胞標志物，如E-鈣黏蛋白、上皮細胞黏附分子、叉頭框蛋白A2、附膜蛋白和類固醇激素受體[3，5]。在結(jié)合了上皮細胞及間質(zhì)細胞的多細胞子宮內(nèi)膜類器官模型中，E-鈣黏蛋白、廣譜角蛋白、叉頭框蛋白A2的表達位于類器官外周，中心細胞對基質(zhì)細胞的標志物——波形蛋白呈陽性反應(yīng)[9]。

1.2子宮內(nèi)膜類器官的遺傳學(xué)特點 原代子宮內(nèi)膜培養(yǎng)的類器官通過RNA測序進行基因組分析發(fā)現(xiàn)，這些子宮內(nèi)膜類器官更接近腺體而不是間質(zhì)，體現(xiàn)了來源組織子宮內(nèi)膜腺體的分子學(xué)特征[10]。FITZGERALD等[7]對子宮內(nèi)膜類器官的基因組特征進行了研究，采用RNA測序方法對雌激素、孕激素影響下的子宮內(nèi)膜類器官進行了全面分析，結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜類器官中存在幾種不同上皮細胞類型，其比例和基因表達隨激素處理的改變而改變。表明子宮內(nèi)膜類器官模型是研究人類子宮內(nèi)膜生理學(xué)和病理學(xué)的重要工具。

1.3子宮內(nèi)膜類器官的生物學(xué)特點 子宮內(nèi)膜來源的類器官能形成腺樣組織，其頂端有微絨毛和纖毛[3，5]，在類器官的管腔中可見子宮內(nèi)膜腺體分泌的糖原。在Matrigel培養(yǎng)系統(tǒng)的多孔膠原支架模型中上皮細胞極化，頂端表面有面對孔腔的微絨毛和纖毛，其基底表面附著在支架上，形成細胞外基質(zhì)蛋白[11]。將上皮細胞與基質(zhì)細胞一起置于微模瓊脂糖凝膠系統(tǒng)中培養(yǎng)，類器官則表現(xiàn)出不同的組織結(jié)構(gòu)：上皮細胞在外層，基質(zhì)細胞位于類器官中央。上皮細胞極化，細胞核位于離基質(zhì)最近的細胞基底外側(cè)，可向外分泌黏蛋白，而位于類器官中央的基質(zhì)細胞則分泌膠原[9]。

2 子宮內(nèi)膜類器官的應(yīng)用

類器官已成為一種強大的體外研究介質(zhì)，可由多能干細胞或成體干細胞建立，能保留遺傳、表型和行為特征。子宮內(nèi)膜類器官作為一種理想研究模型可用于病理生理學(xué)研究、藥物篩選、基因編輯修飾、微環(huán)境研究、腫瘤標志物研究、個體化精準治療、形成子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的類器官生物庫等。

2.1生物庫 類器官可快速增殖、超低溫保存并用于高通量篩選。類器官的培養(yǎng)使來自個體患者的病變細胞直接擴增，能建立起腫瘤類器官生物庫，并且促進患者的個體化治療[12]。BORETTO等[6]研究了良、惡性子宮內(nèi)膜患者來源的類器官，這些類器官成功地向人們展現(xiàn)了原發(fā)性疾病的組織學(xué)和異質(zhì)性，保留了遺傳和分子特征，包括p53狀態(tài)、激素受體狀態(tài)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性表型。

2.2藥敏試驗 TURCO等[3]從絕經(jīng)后婦女子宮內(nèi)膜癌組織中提取并培養(yǎng)了子宮內(nèi)膜癌類器官，類器官形態(tài)與原發(fā)腫瘤(國際婦產(chǎn)科醫(yī)師聯(lián)合會Ⅰ級子宮內(nèi)膜癌)相似，表現(xiàn)為多形細胞、細胞核深染、上皮結(jié)構(gòu)紊亂等。這些細胞器對腺體標志物，如附膜蛋白和SOX17蛋白呈陽性反應(yīng)，進而證實其腺體起源。BORETTO等[6]進一步研究了從低級別至高級別子宮內(nèi)膜癌患者來源的類器官，這些類器官均準確展現(xiàn)了腫瘤的異質(zhì)性和突變情況，并可進行患者特異性藥敏反應(yīng)。惡性來源的類器官也越來越多地用于藥物篩選及放射敏感性分析的臨床前模型，幾種化療藥物(如紫杉醇、5-氟尿嘧啶、卡鉑、阿霉素等)和維羅莫司(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑)已在患者來源的子宮內(nèi)膜癌類器官上進行了藥敏試驗[6]。在大多數(shù)樣本研究中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3 轉(zhuǎn)錄因子抑制劑BBI608和紫杉醇幾乎能顯著抑制類器官生長，酪氨酸激酶抑制劑和氟維司瓊(雌激素受體拮抗劑)則能抑制部分類器官生長，而順鉑、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮、左炔諾孕酮、米非司酮對子宮內(nèi)膜類器官生長無明顯影響。此藥敏試驗結(jié)果與臨床反應(yīng)有差異，可能是由于原代類器官是在基底膜提取物及無血清情況下培養(yǎng)的，不需另外給予生長因子，而是由腫瘤內(nèi)所有細胞成分的重新組合[13]。另外，DASARI等[14]利用子宮內(nèi)膜類器官作為模型，研究了維替普芬(VP)對子宮內(nèi)膜癌類器官的影響，用VP處理后子宮內(nèi)膜癌類器官存活率、侵襲性下降，而這些效果最早在處理后的15 min出現(xiàn)，表明VP是治療子宮內(nèi)膜癌的一種有效的化療藥物。另外，BI等[15]使用類器官預(yù)測了患者對藥物的臨床反應(yīng)，并且成功預(yù)測了術(shù)前接受新輔助曲妥珠單抗治療患者術(shù)后化療及對曲妥珠單抗的耐藥性?？傊?，類器官可作為婦科癌癥患者個性化治療的臨床前平臺。

2.3基因編輯修飾 子宮內(nèi)膜類器官使得能夠通過病毒或非病毒方法對細胞進行遺傳修飾，有利于基因編輯和修飾。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)/規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白系統(tǒng) 9(Cas9)是最具有吸引力的基因編輯技術(shù)，能操控來自源組織或誘導(dǎo)性多能干細胞類器官中的基因組序列[16]。ARTEGIANI等[17]使用CRISPR/Cas9技術(shù)將標有熒光標記的基因?qū)雴蝹€細胞內(nèi)，這些轉(zhuǎn)基因的類器官可得以研究細胞增殖及再生途徑機制。子宮內(nèi)膜類器官可與基因編輯技術(shù)結(jié)合，通過改變基因突變位點建立相應(yīng)類器官模型，從而觀察腫瘤細胞變化。

2.4微環(huán)境 人體疾病的發(fā)生、發(fā)展是由細胞與周圍環(huán)境雙向相互作用的復(fù)雜系統(tǒng)作用所致，這種相互作用的系統(tǒng)稱為微環(huán)境。部分非高級別漿液性卵巢上皮癌，包括子宮內(nèi)膜樣腺癌及透明細胞卵巢腺癌，被認為受到子宮內(nèi)膜異位微環(huán)境的影響[18-19]。MCMILLI等[20]發(fā)現(xiàn)，癌細胞和周圍基質(zhì)的互相作用可影響腫瘤細胞的增殖和生長。在子宮內(nèi)膜癌中，細胞外基質(zhì)衍生的轉(zhuǎn)化生長因子-β信號可促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移潛能[21]。GRUND等[22]研究表明，腫瘤壞死因子-α可刺激12Z細胞從而產(chǎn)生炎癥信號，而WENDEL等[23]發(fā)現(xiàn)，單層細胞中的12Z細胞并未表達炎性細胞因子，但經(jīng)腫瘤細胞因子-α刺激后白細胞介素-6、白細胞介素-8、單核細胞趨化蛋白-1分泌增加，表明單層12Z細胞需外界刺激才能表達炎性微環(huán)境；隨后其將12Z細胞以Kenzan方式培養(yǎng)成類器官，結(jié)果顯示，可以不需要額外刺激的情況即可產(chǎn)生炎性信號因子。另外，對子宮良性疾病而言，微環(huán)境的研究也十分重要。帶有致病細菌或病毒定植于子宮導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜炎常被認為是不孕的常見原因[24]。DOLAT等[25]直接在極化上皮頂端表面注射衣原體菌株，其感染導(dǎo)致細胞骨架及高爾基體重組，細胞之間連接紊亂。感染的類器官與骨髓來源的中性粒細胞共同培養(yǎng)，中性粒細胞可滲透至細胞外基質(zhì)并向感染的類器官遷移。通過研究微環(huán)境的變化，可進一步了解疾病的發(fā)生、發(fā)展。因此，類器官作為一種十分有前途的體外模型，可用于研究細胞的微環(huán)境，為進一步了解疾病提供幫助。

2.5腫瘤標志物的研究 COCHRANE等[26]用單細胞測序研究了來源于正常子宮內(nèi)膜的類器官模型，利用單細胞測序區(qū)別子宮內(nèi)膜類器官中的不同成分上皮細胞(纖毛細胞與分泌細胞)，從而發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜纖毛細胞或分泌細胞新的特異性標志物；其用免疫組織化學(xué)的方法驗證了分泌細胞標志物——巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶及纖毛細胞標志物——FAM92B、WDR16和DYDC2，對子宮內(nèi)膜腫瘤進行單細胞測序發(fā)現(xiàn)，其均有分泌樣瘤細胞和纖毛樣瘤細胞，并且發(fā)現(xiàn)了纖毛細胞標志物——DYDC2、CTH、FOXJ1、P73和分泌細胞標志物——巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶在子宮內(nèi)膜腫瘤中均有表達，其表達與子宮內(nèi)膜惡性腫瘤患者的疾病特異性和總生存期呈正相關(guān)。使用類器官進行單細胞測序發(fā)現(xiàn)了子宮內(nèi)膜惡性腫瘤新的腫瘤標志物，為研究腫瘤標志物提供了新的途徑。

2.6治療 Asherman綜合征是子宮性不孕的主要原因，其特征為子宮內(nèi)膜受損，缺乏上皮細胞，從而組織子宮內(nèi)膜再生。JIANG等[27]將培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜類器官移植至子宮內(nèi)膜受損模型大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜類器官可促進子宮內(nèi)膜再生與血管生成，為治療Asherman綜合征提供了新的思路。另外，對需激素治療的女性而言，還可利用子宮內(nèi)膜類器官提前給予激素治療，給予不同劑量雌激素與孕激素組合以評估內(nèi)膜增殖與分化程度。MIYAZAKI等[28]研究表明，由多能干細胞分化為孕激素敏感的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞可用于治療子宮內(nèi)膜異位癥。

3 展 望

新技術(shù)的進步改變了研究方式，類器官的出現(xiàn)為研究子宮內(nèi)膜及其相關(guān)疾病提供了無限可能。其從體細胞中產(chǎn)生干細胞并且能保留原始基因的能力已為精準個性化研究特定疾病的病理生理提供了線索。未來還可增加類器官模型中的復(fù)雜性，向其中增加其他細胞類型，更真實地模擬體內(nèi)多細胞環(huán)境，從而對疾病的生理病理有更深層次的理解。如癌癥來源的類器官可與免疫細胞共同培養(yǎng)已成為癌癥個體化免疫治療的一種很有前景的研究方式。還可將3D生物打印和芯片模型與類器官的結(jié)合。3D生物打印背后的原理是將原始細胞類型或干細胞輸送到生物材料和大分子上，以生成可移植的逼真的3D結(jié)構(gòu)。類器官芯片則是通過多細胞共同培養(yǎng)，嚴格控制機械、電器、生化刺激下的持續(xù)液體循環(huán)，從而模擬體內(nèi)生理變化。另外，還可進行各種基因操作，如DNA堿基編輯、RNA靶向、表觀基因組編輯和基因表達操控。