方思尹，劉 辰，吳晉暉

1.海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院 眼科, 上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院 眼科，上海 200438

血管新生(angiogenesis)受多種細胞和因子調控，表現為血管基膜及血管外基質降解, 內皮細胞增殖遷移，最后生成新血管的過程。正常的血管系統(tǒng)是一個嚴密的網絡，而病理性血管表現分布不均勻、形態(tài)不規(guī)則，周邊缺乏周細胞和適當的基膜。相比較于正常血管，新生血管不成熟且更加脆弱。在生理情況下, 血管新生對恢復血供和促進傷口愈合起到積極作用，而病理性血管生成則是各種缺血性和炎性疾病的標志。血管生成異常與70多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，如腫瘤、類風濕性關節(jié)炎、心血管疾病、眼部疾病和其他疾病等[1]。通過抑制新生血管生成或阻斷新生血管，治療血管生成異常相關疾病已成為研究熱點。本文綜述了微管抑制劑在新生血管性疾病中抑制血管生成的機制。

1 微管的結構及生物學作用

微管是真核細胞骨架的重要組成部分，由α和β微管蛋白的異源二聚體組裝成長空心聚合物，寬25 nm，長1～100 nm，異源二聚體被稱為微管蛋白二聚體，簡稱為微管蛋白，可通過α、β-異源二聚體聚合與解聚合的動態(tài)平衡發(fā)揮作用。微管在生長和收縮階段之間自動切換的狀態(tài)，稱為動態(tài)不穩(wěn)定性[2]。除了在細胞有絲分裂中起作用外，微管還密切參與各種細胞生理活動，例如，維持細胞形態(tài)和細胞運動及細胞器和囊泡的運輸等。

2 微管抑制劑及種類

目前已知的微管抑制劑可分為兩類：一類是促進微管蛋白聚合的微管蛋白聚合劑，代表藥物為紫杉醇類化合物；另一類是抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚劑，代表藥物有長春堿類化合物和秋水仙堿類化合物。1932年，首次報道了可口服的微管蛋白結合劑——秋水仙堿，這種藥物可以提高一組癌癥患者的短期生存率[3]。由于秋水仙堿的副作用較大，限制了其在臨床上的廣泛應用。近年報道，微管抑制劑可抑制新生血管形成和破壞現有血管，對病理性新生血管內皮有一定的選擇性[4]。相對來說, 新生的血管內皮細胞的細胞骨架系統(tǒng)不完整，對此類藥物較敏感[5]。將微管抑制劑作為新生血管性疾病的新治療靶點已引起人們重視，越來越多的高效低毒的微管抑制劑被合成, 其中一些已經進入臨床試驗，但其對新生血管的作用機制尚不清楚。

3 微管抑制劑抑制新生血管生成

3.1 通過抑制血管內皮細胞功能抑制新生血管生成

血管內皮細胞發(fā)揮其功能依賴于多種細胞因子及基因表達，其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種血管生成的誘導劑，能促進血管內皮細胞的存活、增殖和遷移，增加血管內皮細胞的滲透性，最終促進血管生成。已證實在各種類型的新生血管性疾病中VEGF過度表達，成為一種重要的抗血管生成的治療靶點。另c-Myc基因可以與VEGF協(xié)同促進血管內皮細胞增殖，其過度表達常見于各種腫瘤，如肺癌、胃癌、乳腺癌及視網膜母細胞瘤等。

天然產物combretastatin A-4(CA-4)及其衍生物是一種極具研究意義的天然微管抑制劑，可通過抑制VEGF和c-Myc基因，抑制人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的增殖、遷移、及其有絲分裂過程。CA-4及其衍生物通常對VEGF基因有較高的抑制活性，其中化合物 L-Met可下調VEGF基因的表達超過55%。大多數衍生物對于c-Myc基因也有顯著作用，例Fmoc-L-Ala的衍生物，可將該基因表達降低22%。還有不少衍生物，如Fmoc-L-Ala、Fmoc-L-Phe及L-Thr對VEGF和c-Myc基因下調表達可超過60%[6]。另一種人工合成的CA-4衍生物CPU-XT-006也能有效抑制VEGF誘導的HUVEC的增殖，并減少細胞內VEGF的分泌，降低微血管的通透性來實現抑制新生血管生成[7]。

成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種堿性蛋白質，該因子具有促進血管內皮細胞有絲分裂和促進血管生成的作用，與其特異性受體結合，激活血管內皮細胞內酪氨酸蛋白激酶，從而促進細胞代謝和增殖。甲苯達唑(Mebendazole,MBZ)是一種微管解聚藥物能有效抑制bFGF誘導的內皮細胞增殖，減少細胞內bFGF蛋白的分泌，從而抑制血管新生[8]。

Rho蛋白是一組低分子量GTPase的Ras超家族蛋白，具有GTP酶活性，在多種細胞中高表達，主要參與張力纖維形成和黏著斑復合體組裝，在細胞骨架重組調控方面起重要作用。RhoA是協(xié)調f -肌動蛋白和細胞骨架中的微管相互作用的關鍵蛋白。CA-4在秋水仙堿位點與微管蛋白的結合可抑制微管蛋白聚合，激活RhoA。天然微管抑制劑Pretubulysin (PT)引起的微管分解亦可激活RhoA，激活肌動蛋白應力纖維的形成和收縮、促進血管內皮細胞間的連接分解和增加其通透性，破壞血管內皮細胞結構和抑制血管內皮細胞功能，從而發(fā)揮抑制新生血管的作用。磷酸化Combretastatin A4(CA4P)是CA-4的水溶性藥物形態(tài)，可激活RhoA/ROCK/MLC通路，促進微管的分解，這與有其助于肌動蛋白重構和增加滲透性的報道相一致[9]。

微管抑制劑可抑制血管內皮細胞的增殖、遷移和侵襲等功能，如名為9i[10]、7m[11]及28g[12]等微管抑制劑，對抑制HUVEC管狀結構的形成、遷移和侵襲具有顯著作用，并在斑馬魚模型上其對新生血管生成的也有抑制作用。

3.2 誘導內皮細胞凋亡及阻滯細胞周期。

YMR-65是一種具有良好抗癌活性的微管蛋白抑制劑，能與微管蛋白的秋水仙堿結合位點緊密結合，誘導血管內皮細胞凋亡[13]。合成類微管抑制2f誘導細胞凋亡作用呈現出劑量依賴性[14]，經過化學外殼裝載后的紫杉醇(paclitaxel，PTX)可有效抑制腫瘤血管，細胞凋亡率超過65%，能顯著減少血管的數量，導致腫瘤血管生長受限[15]。

一種新的合成型微管抑制劑SAR of novel 3-arylisoquinolinones，與秋水仙堿作用類似，能與微管秋水仙堿位點結合，抑制了微管蛋白聚合，有效地改變了微管組裝和拆卸的動力學過程，導致細胞分裂暫停，細胞周期阻滯于 G2/M 期，并誘導細胞調亡，而抑制內皮細胞管樣成形并進一步破壞已成形的管樣結構，抑制新生血管的生長[16]。

HDAC抑制劑為一種新的雜交分子，可破壞微管網絡，將血管內皮細胞阻滯于G2/M期，誘導線粒體膜電位塌陷，有效抑制HUVEC管樣形成，增殖和遷移。在斑馬魚模型中顯示出抗血管生成和抗轉移活性[17]。

3.3 多種機制聯(lián)合作用

TR-764是一種新型的微管蛋白聚合抑制劑，在 HUVEC和雞胚絨毛尿囊膜模型及兩種小鼠腫瘤模型上具有較強的抗血管生成活性。TR-764可與微管蛋白結合觸發(fā)細胞骨架重排，導致毛細血管破裂、細胞通透性增加和細胞運動性降低。還可誘導Src和FAK去磷酸化，觸發(fā)Rho激酶和特定分子的信號級聯(lián)，導致Src和FAK失活，并使VE-cadherin/β-catenin解偶聯(lián)的機制破壞黏附連接和局灶性黏連，并在低氧條件下顯著降低HIF-1α、抑制bFGF對促血管生成活性[18]。TR-764通過多種機制聯(lián)合，阻止血管發(fā)育和抑制新生血管生成。

MT189也是一種新型微管蛋白結合劑，在低氧或常氧條件下，可降低腫瘤細胞和內皮細胞中VEGF的表達和分泌。MT189可以抑制內皮細胞VEGFR2和下游Src的激活。MT189還通過抑制含有FAK、樁蛋白、紐蛋白和肌動蛋白的局灶性黏連的翻轉來破壞內皮細胞-基質連接。抑制JNK后，可使得MT189介導的對內皮細胞遷移和分化的抑制、JNK激活、VEGF表達和分泌的減少以及Src和FAK磷酸化的減少。這些結果表明，MT189可能通過JNK-VEGF /VEGFR2信號軸減少內皮細胞增殖、遷移和分化來抑制血管生成[19]。

CYT997是一種合成化合物，可以抑制微管聚合，在體外具有高度有效的細胞毒性活性。CYT997將細胞周期阻滯在 G2/M期，并且激活Bcl-2磷酸化，同時促進細胞周期蛋白B1表達，促進細胞凋亡及自噬，還可通過增加HUVEC通透性破壞血管[20]。

許多微管抑制劑都可通過抑制血管內皮細胞增殖，并誘導其凋亡，但其具體機制尚未明確。

4 微管抑制劑阻斷形成新生血管

病理性新生血管的特點是內皮細胞增殖率高，缺乏周細胞，基底膜異常，血管通透性增加，從結構上看，血管結構混亂不完整。在未成熟的病理性血管中，肌動蛋白微絲不發(fā)達，內皮細胞形狀和血管的結構完整性更依賴于微管。微管的破壞可能會影響肌動蛋白的細胞骨架功能，導致病理性血管內皮失去完整性，從而減少腫瘤組織的血流量。大多數微管抑制劑通過破壞細胞骨架和細胞間連接來誘導內皮細胞形狀的改變，可誘導腫瘤脈管系統(tǒng)發(fā)生快速血管阻塞和大量壞死[21]。

單劑量CA4P給藥后，腫瘤血流在1h內減少，血管出現迅速、廣泛和不可逆的閉塞和出血性壞死，大部分微小血管損傷，滲透壓和組織間流體壓力增加，血管直徑顯著減小。血漿滲漏還可增加血液黏度，導致血流減少。另一個導致血管關閉的因素是通過接觸暴露的基底膜成分而激活血小板[22]。VE-cadherin是一種內皮細胞特異性鈣黏蛋白，其功能是穩(wěn)定細胞結構，參與鈣依賴性細胞間黏附。CA4P可以破壞VE-cadherin的結合，并抑制VE-cadherin/Akt途徑的信號轉導。黏附體連接的破壞有助于內皮細胞聚集，增加毛細血管中血流的幾何阻力和提高脈管系統(tǒng)滲透壓[22]。 C118P是新合成的另一種CA4類似物，可影響HUVEC的微管動力學和其骨架，破壞已建立的血管網絡，阻斷已成形的血管[23]。

5 微管抑制劑的雙重抗血管作用

微管抑制劑EHT 6706不僅抑制新生血管的形成，還破壞已形成的內皮毛細血管。EHT 6706抑制VE-cadherin/β-catenin復合物的功能，影響新血管組裝和重塑過程。EHT 6706還可下調某些有利于血管生成的基因表達，如肝細胞源性生長因子 (hepatoma-derived growth factor，HGF)， 轉化生長因子(TGFalpha)等基因；也可上調具有強效抗血管作用的基因表達，如ADAMTS9、COL4A1、FN1、TIMP2、NRP1、SPP1、Sema3F、PTPRM、PROX1和PGK1等[24]。

CA-4則可以影響內皮細胞的出芽和成管，從而抑制新生血管形成及破壞發(fā)育中的血管系統(tǒng)。CA4作用24 h后，導致發(fā)育的受精雞蛋絨毛尿囊膜的血管系統(tǒng)不可逆地閉塞，雞胚死亡率90%；其衍生物2e作用6 h后，可觀察到小血管和毛細血管的破壞并出血。另CA-4還可抑制血管生長的關鍵步驟，即內皮細胞在基質膠上成管樣生長[8]。C118P可抑制血管生成并破壞已建立的血管網絡。此外，還可以誘導HUVEC細胞G2/M期細胞周期停滯和凋亡[23]。

6 問題與展望

對血管新生過程的進一步探索可以更加深入地了解其復雜的分子生物學機制，為臨床藥物的開發(fā)提供了依據和思路，揭示微管抑制劑抑制血管機制，有望為日后的治療提供靶點。目前已有大量微管抑制劑顯示出其強大的新生血管治療作用，其中一部分已進入臨床前試驗，但其具體的作用機制尚不明確。在眼科領域，微管抑制劑治療眼部新生血管性疾病仍存在空白?；A研究應用于臨床治療必須克服其作用效果受機體多個因素影響的障礙。