郭佳麗，潘晨華，李依，劉曉倩，蔣慧，常偉

1 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 武漢科技大學(xué)附屬華潤武鋼總醫(yī)院血液內(nèi)科，武漢 430080；2 武漢科技大學(xué)附屬普仁醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；3 赤峰市醫(yī)院血液內(nèi)科；4 武漢科技大學(xué)附屬普仁醫(yī)院血液科

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）是成人中最常見的淋巴惡性腫瘤，具有高度的侵襲性及異質(zhì)性［1］。盡管DLBCL 患者的生存情況隨著利妥昔單抗、蒽環(huán)類藥物、干細(xì)胞移植以及嵌合抗原受體T 細(xì)胞免疫療法（CAR-T）等治療手段的應(yīng)用得到了極大改善，但是由于個(gè)體差異及耐藥性，仍存在約40%復(fù)發(fā)難治患者［2］。此外，與DLBCL 發(fā)病及預(yù)后相關(guān)的獨(dú)特基因特征仍尚不明晰。因此，開發(fā)更加方便、有效的新型預(yù)后生物標(biāo)志物對(duì)改善DLBCL 患者的總體生存期至關(guān)重要。

腫瘤微環(huán)境（TME）在癌癥的發(fā)生、發(fā)展以及耐藥中起著重要作用［3］，其是一種動(dòng)態(tài)環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等組成［4］。作為TME 的主要組成部分，免疫細(xì)胞浸潤與腫瘤進(jìn)展和免疫治療反應(yīng)有關(guān)。腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞（TICs）主要包括T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞以及髓源性抑制細(xì)胞［5］，能夠影響免疫抑制和免疫逃避［6］。目前研究發(fā)現(xiàn)，免疫浸潤與許多實(shí)體腫瘤的預(yù)后有關(guān)。比如食管癌中NK 細(xì)胞密度與患者總生存期（OS）和良好的手術(shù)預(yù)后呈正相關(guān)，而巨噬細(xì)胞可以通過多種途徑促進(jìn)食管癌進(jìn)展，與食管癌的生存呈負(fù)相關(guān)［7］。為了更好地干預(yù)TME 以達(dá)到抗腫瘤效果，現(xiàn)有不少研究在探索調(diào)控TME 的關(guān)鍵基因，如LGAS1 基因可以在膠質(zhì)瘤中調(diào)控免疫抑制性微環(huán)境［8］。2022年6—9月，本研究通過生物信息學(xué)篩選出影響DLBCL 預(yù)后的關(guān)鍵基因，探討了預(yù)后基因表達(dá)水平與DLBCL 預(yù)后及TICs 比例的關(guān)系，為DLBCL的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi，nlm.nih.gov）中的GSE56315、GSE12453和GSE87371 3個(gè)數(shù)據(jù)集。其中，GSE5631、GSE12453包含了DLBCL患者與健康受試者的差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)，而GSE87371 除了收集223 例DLBCL 患者活檢組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)外，還包含了患者的性別、年齡、生存時(shí)間、生存狀態(tài)、治療方案、分期等臨床信息。

1.2 DLBCL 預(yù)后不良相關(guān)基因的篩選 首先對(duì)GSE56315、GSE12453 數(shù)據(jù)進(jìn)行合并得到MERGE 數(shù)據(jù)集，然后利用R 語言對(duì)MERGE 數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和Log2 對(duì)數(shù)處理，通過R 語言中的“l(fā)imma”包對(duì)處理后的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析：篩選條件為|log2FC|＞2，校正后P值（P.adj）＜0.05。通過同樣的方法對(duì)GSE87371 數(shù)據(jù)集進(jìn)行處理，使用 Kaplan-Meier 生存分析模型及 COX 比例回歸模型進(jìn)行生存分析過濾，篩選出同時(shí)滿足條件P＜0.001 且HR＞1 的基因作為預(yù)后不良基因，將其與MERGE 數(shù)據(jù)集篩選得到的上調(diào)基因取交集，得到的基因?yàn)槟康幕颍―LBCL預(yù)后不良相關(guān)基因）。

1.3 DLBCL 預(yù)后不良相關(guān)基因水平與患者預(yù)后及臨床參數(shù)的關(guān)系 將GSE87371 數(shù)據(jù)集中的目的基因根據(jù)表達(dá)量中位值分為高、低表達(dá)組后進(jìn)行生存分析，生存分析采用R 語言的“survival”包，Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并提取目的基因高、低表達(dá)組5年OS 率及95%CI。然后利用COX 風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析目的基因是否可作為預(yù)測患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。最后使用R 語言的“for”循環(huán)分析目的基因與DLBCL 患者年齡、性別、臨床分期等臨床參數(shù)的關(guān)系。

1.4 預(yù)后不良相關(guān)基因信號(hào)通路富集分析 根據(jù)目的基因表達(dá)量的中位數(shù)差異將DLBCL 樣本分為預(yù)后不良相關(guān)基因高表達(dá)組和低表達(dá)組，以KEGG基因集作為GSEA 參考基因集，使用GSEA 軟件進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。

1.5 預(yù)后不良相關(guān)基因表達(dá)水平與DLBCL 組織TICs 比例的相關(guān)性分析 采用CIBERSORT 反卷積算法計(jì)算出GSE87371 數(shù)據(jù)集中DLBCL 組織不同免疫細(xì)胞的比例，并且在不同TICs 間進(jìn)行Pearson 相關(guān)系數(shù)計(jì)算，分析不同免疫細(xì)胞間的相關(guān)性。通過Wì1coxon 秩和檢驗(yàn)比較目的基因高表達(dá)組及低表達(dá)組TICs 比例的差異，最后對(duì)預(yù)后不良相關(guān)基因和TICs進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL 預(yù)后不良相關(guān)基因 對(duì)GSE12353 及GSE56315進(jìn)行合并后的MERGE基因集進(jìn)行篩選后得到445 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因301 個(gè)（log2FC＞2），下調(diào)基因143 個(gè)（log2FC＜-2）。GSE87371 數(shù)據(jù)集進(jìn)行生存分析過濾后獲得預(yù)后相關(guān)基因57 個(gè)（負(fù)相關(guān)17 個(gè)，正相關(guān)40 個(gè)）。將上調(diào)的301 個(gè)基因與負(fù)相關(guān)的17 個(gè)基因取交集，獲得膜連蛋白1（ANXA1）。

2.2 ANXA1 表達(dá)水平與患者預(yù)后及臨床參數(shù)的關(guān)系 ANXA1 高表達(dá)組5年OS 率 3.56%，95%CI1.17%～10.7%，低表達(dá)組5年OS 率 17.49%，95%CI11.8%～29.9%，高表達(dá)組5年OS 率低于低表達(dá)組（P＜0.001）。單因素分析結(jié)果顯示，ANXA1、年齡及治療方法與DLBCL 的不良預(yù)后相關(guān)（HR分別為1.243（1.093～1.414）、0.976（0.965～0.986）、1.530（1.300～1.801），P均＜0.05），而DLBCL 的臨床分期及性別與生存預(yù)后沒有相關(guān)性［HR分別為1.028（0.898～1.177）、0.889（0.655～1.208），P＞0.05］，多因素COX 回歸分析結(jié)果顯示，除性別外，ANXA1、年齡、臨床分期、治療方法皆為DLBCL 預(yù)后的獨(dú)立影響因素（HR分別為1.145（1.001～1.310）、0.982（0.969～0.994）、1.201（1.045～1.381）、1.426（1.197～1.699），P均＜0.05）。最后，循環(huán)分析提示ANXA1 表達(dá)水平與DLBCL 患者的年齡、性別以及腫瘤分期均無相關(guān)性（P均＞0.05）。

2.3 ANXA1 基因相關(guān)的信號(hào)通路 GSEA 結(jié)果顯示 ANXA1 在趨化因子信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、ECM 受體相互作用、JAK-STAT 信號(hào)通路等通路上富集。

2.4 ANXA1 基因表達(dá)水平與DLBCL 組織中TICs比例的關(guān)系 DLBCL組織中T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞比例分別為49%、31%?；罨腃D4+記憶性T 細(xì)胞（15%）和CD8+T 細(xì)胞（5%）呈正相關(guān)（r=0.35，P＜0.05），與濾泡輔助性T 細(xì)胞（6%）負(fù)相關(guān)（r=–0.45，P＜0.05）。ANXA1與9種TICs具有相關(guān)性。其中ANXA1的表達(dá)與幼稚B細(xì)胞（5%）、記憶B細(xì)胞（8%）、靜息的NK 細(xì)胞（0.1%）、濾泡輔助性T 細(xì)胞（6%）的比例呈負(fù)相關(guān)（r分別為–0.32、–0.26、–0.24、–0.25，P均＜0.05），與巨噬細(xì)胞M2（5%）、漿細(xì)胞（0.2%）、活化的CD4+記憶性T 細(xì)胞（15%）、CD8+T 細(xì)胞（5%）、γδT 細(xì)胞（18%）的比例呈正相關(guān)（r分別為0.20、0.20、0.23、0.22、0.22，P均＜0.05）。

3 討論

DLBCL 的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多個(gè)因素?；蛲蛔?、表觀遺傳重塑、分化阻斷、免疫監(jiān)視逃逸、免疫浸潤以及幾種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組成性激活在DLBCL 的腫瘤細(xì)胞激活和維持中發(fā)揮重要作用［9］。所以DLBCL發(fā)病不僅需要癌基因表達(dá)失調(diào)，也需要逃避免疫細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤監(jiān)測［10］。因此，尋找一個(gè)與免疫浸潤具有相關(guān)性的預(yù)后標(biāo)志物對(duì)開發(fā)DLBCL的潛在治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

本研究基于GEO 數(shù)據(jù)庫通過生物信息學(xué)技術(shù)篩選出DLBCL 預(yù)后不良相關(guān)基因ANXA1。ANXA1是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，分子量為37 kDa，由346 個(gè)氨基酸組成，其核心結(jié)構(gòu)域具有4個(gè)重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)序列包含60～70個(gè)氨基酸，負(fù)責(zé)ANXA1 的調(diào)節(jié)機(jī)制［11］。核心結(jié)構(gòu)域和磷脂之間的相互作用，使ANXA1 蛋白具有多種生物學(xué)功能，如參與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)以及細(xì)胞增殖、凋亡和分化等［12］。研究［13］表明，ANXA1 在各種癌癥中失調(diào)，其表達(dá)增加常與疾病嚴(yán)重程度、晚期腫瘤分期以及轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)。比如，ANXA1 高表達(dá)在黑色素瘤、肝細(xì)胞癌等癌癥中，與預(yù)后差、無病生存率低和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高相關(guān)；而在食管癌和前列腺癌中，ANXA1 低表達(dá)與分化不良、預(yù)后較差、生存率下降以及高復(fù)發(fā)率相關(guān)。ANXA1 在實(shí)體腫瘤中研究較多，目前在DLBCL 中的作用機(jī)制未知。在此研究中我們發(fā)現(xiàn)，ANXA1 高表達(dá)與DLBCL 的不良預(yù)后相關(guān)。通過GSEA 富集分析，發(fā)現(xiàn)它在癌癥相關(guān)途徑上富集，如細(xì)胞因子—細(xì)胞因子受體相互作用、JAK-STAT 信號(hào)通路和 MAPK 信號(hào)通路。這些提示ANXA1 在DLBCL 的發(fā)生和發(fā)展中具有潛在作用。

很多惡性腫瘤TME 中浸潤的某些特定類型腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞可影響患者預(yù)后，并可作為潛在治療靶點(diǎn)。在基于形態(tài)和免疫表型評(píng)估DLBCL 的TME 研究中，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞是DLBCLTME 中主要的免疫細(xì)胞成分［14］。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。有研究［15］發(fā)現(xiàn)，在淋巴結(jié)內(nèi)發(fā)病的DLBCL 中，CD4+T 細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞比例較高提示預(yù)后良好；而CD8+T 細(xì)胞與腫瘤免疫逃逸相關(guān)，有利于腫瘤細(xì)胞的克隆增殖，與所有類型DLBCLs預(yù)后不良有關(guān)。此外，NAM 等［16］發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞M2 可促進(jìn)DLBCL 的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及免疫逃逸，高浸潤的巨噬細(xì)胞M2 常與不良預(yù)后相關(guān)。所以TICs能夠影響DLBCL 的預(yù)后。ANXA1 能夠參與免疫細(xì)胞的分化和免疫微環(huán)境的抑制，進(jìn)而影響腫瘤的TME。比如，ANXA1 能夠作為巨噬細(xì)胞等促腫瘤細(xì)胞的化學(xué)引物，通過信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向促腫瘤的M2 表型轉(zhuǎn)換；并且在調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的活化與增殖中發(fā)揮作用，能夠促進(jìn)T 細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，抑制Th2 細(xì)胞分化，從而形成免疫抑制的微環(huán)境，以此促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。另外，ANXA1還可以通過影響表皮生長因子以控制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路（如 PI3/AKT 和ERK 信號(hào)通路），以此誘導(dǎo)腫瘤的免疫抑制。通過DLBCL 免疫浸潤分析，我們發(fā)現(xiàn)ANXA1 表達(dá)與巨噬細(xì)胞M2、漿細(xì)胞、活化的CD4+記憶性T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、γδT 細(xì)胞比例正相關(guān)，表明ANXA1 可能參與DLBCL 的TME 中細(xì)胞介導(dǎo)的免疫維持，提示ANXA1 可能通過影響免疫浸潤導(dǎo)致DLBCL 預(yù)后不良。

總之，DLBCL 預(yù)后不良相關(guān)基因?yàn)锳NXA1，ANXA1 表達(dá)水平高與DLBCL 患者預(yù)后不良及腫瘤免疫浸潤細(xì)胞相關(guān)，富集的信號(hào)通路主要有趨化因子信號(hào)通路等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路。我們的研究首次分析了ANXA1 表達(dá)對(duì)DLBCL 的預(yù)后以及免疫浸潤的影響，有望成為DLBCL 患者免疫相關(guān)的新預(yù)后指標(biāo)，為DLBCL 的治療提供了新的視角。不過我們的研究仍具有一定局限性，首先本研究的數(shù)據(jù)均來自于公開可用的數(shù)據(jù)庫，需要進(jìn)一步通過體內(nèi)或體外研究來對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，再者ANXA1 在DLBCL 中的確切作用機(jī)制及對(duì)TME 中免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制仍有待充分闡明。