王澤民, 晉 昕, 張飛燕, 司懷軍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 蘭州 730070)

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors,TF)是一種蛋白質(zhì),它結(jié)合在目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA基序上,調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄。植物體內(nèi)近7%的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生TFs,已知TFs參與應(yīng)對(duì)干旱、滲透、高溫和低溫等非生物脅迫[1-3]。植物TFs根據(jù)其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域被分為約58個(gè)家族[1]。許多TFs(如Dof、WRKY、ERF、NAC、GRAS和MYB等)在與非生物/生物脅迫反應(yīng)和許多發(fā)育/生理過(guò)程相關(guān)的信號(hào)和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起至關(guān)重要的作用[1-4]。雖然大量研究證實(shí)Dof廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)等過(guò)程,同時(shí)影響作物重要農(nóng)藝性狀,如品質(zhì)、產(chǎn)量、植株結(jié)構(gòu)、開(kāi)花時(shí)間和器官發(fā)育等,但仍然存在很多未知,對(duì)Dof家族具體成員相關(guān)功能和調(diào)控方式的研究并不完善,每個(gè)成員在多種復(fù)雜的環(huán)境條件下的響應(yīng)機(jī)制尚不清晰。因此,仍需進(jìn)一步了解和研究,為利用Dof轉(zhuǎn)錄因子提供更多理論依據(jù)。本文結(jié)合非生物脅迫(干旱、極端溫度、鹽脅迫等)和生物脅迫對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育的影響,從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控和重要次生代謝產(chǎn)物變化等方面,重點(diǎn)綜述Dofs家族成員在作物脅迫響應(yīng)和作物重要農(nóng)藝性狀方面的多重功能,以期為Dofs在作物改良和抗逆性生物育種中的潛在功能及應(yīng)用提供參考。

1 Dof轉(zhuǎn)錄因子

DNA-binding with one finger (Dof)蛋白是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子大家族。在模式植物擬南芥等物種的研究中發(fā)現(xiàn),Dof蛋白長(zhǎng)度在200到400個(gè)氨基酸之間,通常由保守的DNA結(jié)合域(N端)和一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)(C端)組成[4]。Dofs轉(zhuǎn)錄因子的另一個(gè)重要特征是高度保守的核定位信號(hào)(NLS),它可以引導(dǎo)這些蛋白質(zhì)到達(dá)細(xì)胞核。這個(gè)長(zhǎng)達(dá)17個(gè)氨基酸的NLS在本質(zhì)上有兩部分,與Dof DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域下游末端相連,這一特性允許在一些植物中識(shí)別Dof[5-6]。隨著越來(lái)越多植物基因組測(cè)序項(xiàng)目完成,Dof轉(zhuǎn)錄因子家族也在更多植物中得到全面鑒定。在模式植物擬南芥和水稻中分別發(fā)現(xiàn)了36和30個(gè)Dofs成員[7-8],西紅柿34個(gè),西瓜和黃瓜均為36個(gè)[9],無(wú)芒隱子草50個(gè)[10],蘋(píng)果60個(gè)[11],大豆和白菜中較多,分別為76和78個(gè),小麥中最多有96個(gè)[12]。根據(jù)蛋白序列相似性,Dof轉(zhuǎn)錄因子可分為A、B、C、D 4個(gè)組或亞組,B、C、D組可進(jìn)一步細(xì)分[13-14]。不同組或亞組Dof轉(zhuǎn)錄因子可能存在功能特異性。例如,B組的CDFs亞組是將植物對(duì)不利環(huán)境條件反應(yīng)與植物生長(zhǎng)控制和發(fā)育不同方面(如光周期開(kāi)花時(shí)間或根和芽生長(zhǎng))結(jié)合起來(lái)的關(guān)鍵元素[15-18]。CDF蛋白,通常在其C端區(qū)域包含特定的結(jié)構(gòu)域[8,19],如時(shí)鐘基因GIGANTEA(GI)和FLAVIN BINDING KELCH REPEAT F-BOX PROTEIN 1(FKF1)結(jié)合結(jié)構(gòu)域[15],已知這些結(jié)構(gòu)域通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用參與翻譯后調(diào)控[20-22]。此外,一些CDF蛋白在N端也含有一個(gè)非EAR基序樣結(jié)構(gòu)域,這是與輔抑制因子TOPLESS蛋白相互作用所必需的[16]。

1.1 Dof轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的順式作用元件

研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)Dofs只有一種類型的DNA結(jié)合區(qū)和寡聚區(qū),盡管有些缺乏轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域或特定的DNA結(jié)合區(qū)[23]。研究人員通過(guò)不同的體外和體內(nèi)方法分析了Dof結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合活性,發(fā)現(xiàn)所有檢測(cè)的Dof都與DOFCORE[5′-(A/T)AAAG-3′]結(jié)合[5]。在擬南芥中,通過(guò)DNA親和純化測(cè)序(DAP-seq)技術(shù)對(duì)529個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行系統(tǒng)研究,所有39個(gè)Dofs轉(zhuǎn)錄因子都具有上述啟動(dòng)子結(jié)合偏好[24]。在擬南芥體外分析中報(bào)道了類似的觀察結(jié)果[20,25],也包括馬鈴薯[21]和番茄[22,26]等其他植物。以上實(shí)驗(yàn)闡明了AAAG基序在Dof轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別DNA中的重要性,以及優(yōu)先結(jié)合(A/T)AAAG而不是(G/C)AAAG。與其他植物轉(zhuǎn)錄因子相比,Dof轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的DNA序列相對(duì)較短[27]。由于Dof轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的是一個(gè)相對(duì)較短的序列,推定Dof結(jié)合位點(diǎn)在許多基因的啟動(dòng)子序列和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域中非常常見(jiàn)。然而,大多數(shù)可能是體內(nèi)無(wú)功能的部位。此外,Dof轉(zhuǎn)錄因子可能需要與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用,結(jié)合DNA或在基因組的精確位點(diǎn)上調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。

1.2 Dof轉(zhuǎn)錄因子與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用協(xié)同或拮抗調(diào)控下游基因表達(dá)

Dof結(jié)構(gòu)域不僅可以介導(dǎo)DNA與蛋白質(zhì),也介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用。Dof轉(zhuǎn)錄因子與其他蛋白結(jié)合:一些通過(guò)Dof結(jié)構(gòu)域介導(dǎo),而另一些則涉及Dof結(jié)構(gòu)域外的氨基酸序列。研究顯示,Dof蛋白的C端基序在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中起關(guān)鍵作用。Dof蛋白C端激活域的結(jié)構(gòu)不同,導(dǎo)致Dof蛋白在碳氮同化[28]、光介導(dǎo)生物鐘[22,29]、氣孔功能[30]、種子萌發(fā)[31]、激素反應(yīng)[32]、植物防御[33]、細(xì)胞周期[34]和果實(shí)成熟[35]等方面的功能不同。在擬南芥中,通過(guò)篩選cDNA文庫(kù)發(fā)現(xiàn)第一個(gè)互作蛋白,即植物蛋白OBP1(OBF-binding protein)[36]。植物中prolamin box(P-box)是一個(gè)高度保守的7 bp序列元件(5′-TGTAAAG-3′),存在于許多谷物種子貯藏蛋白基因的啟動(dòng)子中。研究顯示,Dof轉(zhuǎn)錄因子PBF具有P-box(PB)結(jié)合特性。PBF能夠與一種已知的調(diào)控玉米醇溶蛋白基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子basic leucine zipper protein (bZIP) Opaque2(O2)相互作用,其靶點(diǎn)位于22 ku玉米醇溶蛋白(zein)基因啟動(dòng)子中P-box下游20 bp處。Dof蛋白與AAAG DNA序列基序結(jié)合及其與相鄰啟動(dòng)子位點(diǎn)bZIP因子的相互作用表明,Dof蛋白、PB和O2之間的類似相互作用可能發(fā)生在22 ku zein基因啟動(dòng)子上[37]。

Dof-MYB相互作用也是通過(guò)BPBF的C端介導(dǎo),而不是通過(guò)Dof結(jié)構(gòu)域[38-39]。研究顯示,Dof轉(zhuǎn)錄因子能夠與參與赤霉素(GA)調(diào)控基因表達(dá)(GAMYB)的R2R3型MYB蛋白相互作用,這種相互作用對(duì)谷粒萌發(fā)過(guò)程中GA誘導(dǎo)糊粉層水解酶基因的表達(dá)起關(guān)鍵作用[40]。大麥MYB轉(zhuǎn)錄因子HvGAMYB通過(guò)與5′-TAACAAC-3′或5′-CAACTAAC-3′基序結(jié)合反式激活Hor2和Itr1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄,激活Hor2啟動(dòng)子也需要一個(gè)完整的PB。HvGAMYB通過(guò)與BPBFC端結(jié)構(gòu)域相互作用增強(qiáng)BPBF的反式激活能力[38]。反式激活實(shí)驗(yàn)以HvGAMYB作為效應(yīng)器,通過(guò)與種子特異性轉(zhuǎn)錄激活因子BPBF可激活與PB結(jié)合的Hor2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。即使在Hor2啟動(dòng)子中MYB binding位點(diǎn)發(fā)生突變的情況下也可以被BPBF激活。相反,具有突變PB的Hor2啟動(dòng)子缺乏與BPBF結(jié)合的能力,不能被HvGAMYB激活,無(wú)論其DNA結(jié)合基序是否完整[41]。類似于O2[37]蛋白,MYB蛋白激活靶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄需要MYB結(jié)合位點(diǎn)和Dof結(jié)合位點(diǎn)。擬南芥中參與花器官脫落調(diào)控的AtDOF4.7與另一種與脫落相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ZINC FINGER PROTEIN 2相互作用[42]。在香蕉中,MaDof23是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子,而MaERF9是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子。通過(guò)相互結(jié)合拮抗調(diào)控10個(gè)與細(xì)胞壁降解和香氣形成相關(guān)的成熟相關(guān)基因[43]。在植物中作為種子萌發(fā)負(fù)調(diào)控因子的AtDof3.2與種子萌發(fā)正調(diào)控因子TCP14相互作用,并阻礙TCP14調(diào)節(jié)ABA相關(guān)基因的表達(dá)[44]。

除了與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用外,Dof轉(zhuǎn)錄因子還可以與HMG-box(HMGB)家族染色質(zhì)相關(guān)HMG蛋白等發(fā)生相互作用[16,23]。HMGB蛋白包含一個(gè)HMGB DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,與DNA非特異性結(jié)合。同時(shí)HMGB結(jié)構(gòu)域可以與Dof轉(zhuǎn)錄因子的Dof結(jié)構(gòu)域相互作用[23,45]。研究人員發(fā)現(xiàn)了5種不同玉米HMGB蛋白以不同的效率增強(qiáng)玉米Dof2與DNA的結(jié)合[23]。此外,蛋白激酶CK2對(duì)HMGB1的磷酸化消除了HMGB1與Dof2之間的相互作用[23],表明HMGB蛋白的磷酸化參與了對(duì)Dof2活性的調(diào)節(jié)。雖然一些HMGB蛋白參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)控,但它們并不是真正的轉(zhuǎn)錄激活因子[23]。它們與Dof轉(zhuǎn)錄因子的相互作用可能在特定結(jié)合位點(diǎn)的選擇或在體內(nèi)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合方面發(fā)揮作用。TOPLESS(TPL)蛋白是植物多種分子途徑(激素信號(hào)和脅迫信號(hào)等途徑)中常見(jiàn)的重要輔助轉(zhuǎn)錄抑制介質(zhì),可協(xié)助轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)對(duì)靶位點(diǎn)的抑制[46]。擬南芥CDF是CO等開(kāi)花途徑基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子[16-17]。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)CDF1豐富時(shí),CDF1和TPL形成一個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合體,抑制CDF1與下游基因啟動(dòng)子的結(jié)合進(jìn)而減少CO和FT的轉(zhuǎn)錄。同時(shí),對(duì)CDF1和TPL相互作用結(jié)構(gòu)域的分析表明,CDF1與TPL相互作用的區(qū)域是完全抑制活性所必需的[16]。此外,小泛素樣修飾物(SUMO)靶向泛素連接酶(AT-STUbL4),通過(guò)與CDF2結(jié)合引導(dǎo)CDF2的泛素化降解,提高COmRNA水平,通過(guò)光周期促進(jìn)開(kāi)花[47]。由此表明,Dof轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子等蛋白互作在多個(gè)維度發(fā)揮調(diào)控作用。

2 Dof轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境響應(yīng)中的作用

2.1 干旱與鹽脅迫

非生物脅迫如干旱和鹽堿是限制植物生長(zhǎng)、發(fā)育和產(chǎn)量的重要環(huán)境因素。干旱和鹽堿能誘導(dǎo)植物細(xì)胞的高滲透脅迫[48]。在擬南芥中,鹽脅迫誘導(dǎo)Dof1.7、Dof2.5、Dof3.6、Dof5.1和Dof5.5的轉(zhuǎn)錄。AtDof5.8調(diào)控ANAC069的表達(dá),并響應(yīng)鹽、干旱和ABA脅迫。在油菜中,9個(gè)經(jīng)篩選的Dof基因可在鹽、干旱、熱、冷脅迫下表達(dá)上調(diào)。在干旱條件下,野生種葡萄VyDof8通過(guò)提高關(guān)鍵酶的抗氧化活性降低丙二醛(MDA)和過(guò)氧化氫(H2O2)含量,進(jìn)而增加植株抗旱性[49]。蘋(píng)果中共有54個(gè)Dof成員,大多數(shù)基因能夠響應(yīng)非生物脅迫(干旱和鹽脅迫)誘導(dǎo)表達(dá)[11,50]。MdDof54在蘋(píng)果抗旱響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期干旱脅迫后,MdDof54RNAi植株高度顯著降低,根系明顯變?nèi)?過(guò)表達(dá)MdDof54的植株則具有更高的成活率。轉(zhuǎn)錄組及DAPseq和ChIP-seq分析證明MdDof54能夠識(shí)別包含AAAG基序的順式元件,可能通過(guò)調(diào)控下游干旱脅迫響應(yīng)基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控蘋(píng)果抗旱性[51]。

研究人員發(fā)現(xiàn)一個(gè)中心調(diào)控因子,為馬鈴薯植物成熟和塊莖發(fā)育起始的主效應(yīng)數(shù)量性狀位點(diǎn)。研究表明,該基因?qū)儆贒of轉(zhuǎn)錄因子家族,通過(guò)在生物鐘和StSP6A結(jié)節(jié)化信號(hào)之間充當(dāng)中介,調(diào)控結(jié)節(jié)化和植物生命周期長(zhǎng)度。該基因自然的等位基因變異導(dǎo)致其逃避翻譯后的光調(diào)控,提出了時(shí)鐘輸出蛋白StGI和StFKF1調(diào)控轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子StCDF1豐度誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖形成的模型。StCDF1通過(guò)下調(diào)StCO1/2,抑制StSP5G的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而促進(jìn)StSP6A的表達(dá),誘導(dǎo)匍匐莖末端的塊莖發(fā)育,這使得馬鈴薯可以在起源的地理中心以外正常種植[21]。Ramirez等[30]研究表明StCDF1參與干旱脅迫響應(yīng),該位點(diǎn)與長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)對(duì)應(yīng)物StFLORE通過(guò)影響氣孔發(fā)育和每日開(kāi)放來(lái)調(diào)節(jié)水分流失。研究顯示,StFLORE轉(zhuǎn)錄本中的自然突變和CRISPR-Cas9突變使植物對(duì)限水條件的敏感性增加。相反,StFLORE的表達(dá)升高,無(wú)論是StFLORE的過(guò)表達(dá)還是StCDF1的下調(diào),都會(huì)通過(guò)減少水分流失增加對(duì)干旱的耐受性。盡管StFLORE似乎是一種天然的反義轉(zhuǎn)錄,但它反過(guò)來(lái)受StCDF1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。因此,StCDF1-StFLORE基因位點(diǎn)對(duì)馬鈴薯植株的營(yíng)養(yǎng)繁殖和水分平衡具有重要作用[30]。擬南芥AtCDF1-5基因的表達(dá)水平都在不同的非生物脅迫下發(fā)生變化,包括干旱、鹽滲透脅迫、寒冷或高溫[17,25]。番茄的SlCDF1-5同源物已被證明是參與響應(yīng)鹽度和干旱條件以及控制開(kāi)花時(shí)間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[22,28]。表達(dá)分析顯示,所有SlCDFs對(duì)不同的非生物脅迫(如鹽、干旱、高溫和低溫)具有不同的根和芽的表達(dá)模式,表明番茄SlCDFs在非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[22,28]。番茄SlCDF1和SlCDF3的異源過(guò)表達(dá)擬南芥增加了對(duì)鹽和干旱脅迫的耐受性,通過(guò)誘導(dǎo)COR15、RD29A和ERD10等廣泛的非生物脅迫應(yīng)激響應(yīng)基因的表達(dá)[22]。此外,也有報(bào)道稱,過(guò)表達(dá)SlCDF3基因的番茄植株對(duì)鹽脅迫具有更高的耐受性[28]。綜上所述,Dofs可能在鹽脅迫和干旱響應(yīng)途徑的上游發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。

與此同時(shí),通過(guò)對(duì)陸地棉花在鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和cDNA文庫(kù)分析,在棉花(Gossypiumspp.)中,200 mmol/L NaCl處理誘導(dǎo)26個(gè)Dof家族基因上調(diào)表達(dá)[52],同時(shí)17% PEG6000處理誘導(dǎo)10個(gè)Dofs成員上調(diào)表達(dá)[53]。OsDof15能夠直接結(jié)合乙烯生物合成基因OsACS1的啟動(dòng)子,在初生根發(fā)育早期抑制其轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致乙烯生成顯著減少,從而調(diào)節(jié)初生根活力的分生組織活性。同時(shí),OsDof15的轉(zhuǎn)錄也受到鹽脅迫的抑制,過(guò)表達(dá)OsDof15降低了轉(zhuǎn)基因植株主根對(duì)鹽的敏感性。這些結(jié)果闡明了乙烯抑制主根伸長(zhǎng)的分子機(jī)制,為根系發(fā)育過(guò)程中環(huán)境信號(hào)和發(fā)育信號(hào)的協(xié)調(diào)提供了理論依據(jù)[54]。此外,耐鹽甜菜BvM14-Dof3.4基因的異源表達(dá)能夠促進(jìn)鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株根的生長(zhǎng),提高異源表達(dá)植株的鮮重和干重,通過(guò)增加K+/Na+比、甜菜堿含量以及SOD和POD的酶活性,從而減少鹽脅迫對(duì)異源表達(dá)擬南芥植株的損傷[55]。ThDof1則通過(guò)增強(qiáng)活性氧(ROS)清除能力,提高剛毛檉柳耐鹽性和滲透性[56-57]。

2.2 溫度脅迫

植物進(jìn)化出了感知環(huán)境溫度輕微變化的信號(hào)通路,并調(diào)整其新陳代謝和細(xì)胞功能,以防止與溫度相關(guān)的損傷[48]。由于全球變暖和伴隨而來(lái)的極端天氣事件,植物越來(lái)越多地受到冷和熱等溫度脅迫[48]。溫度脅迫降低植物生產(chǎn)力,威脅糧食安全。GI是多種信號(hào)通路的中心,包括生物鐘調(diào)節(jié)、糖和光信號(hào)通路、光周期和應(yīng)激反應(yīng)(包括低溫和干旱等)[17,58-59]。研究結(jié)果表明,在GI-CDF模塊中,CDFs通過(guò)調(diào)控C-REPEAT BINDING FACTOR(CBF)進(jìn)而調(diào)控參與非生物脅迫響應(yīng)基因[25,60]。在某些情況下,CDFs已被確定為參與控制非生物脅迫反應(yīng)的CBF/DREB轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分[25,28]。例如,擬南芥AtCDF3在非生物脅迫中調(diào)節(jié)多種脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(如CBFs、DREB2A和ZAT10),這些轉(zhuǎn)錄因子既涉及GI依賴通路,也涉及GI獨(dú)立通路[25,28]。類似的,與擬南芥CDF1同源的甘藍(lán)型油菜BnCDF1通過(guò)調(diào)控不同非生物脅迫響應(yīng)基因,如CBF1、CBF2、COR15A和RD29A,正調(diào)控油菜抗寒性[61]。這些數(shù)據(jù)表明,Dof/CDFs對(duì)CBF基因的調(diào)控可能是低溫等非生物脅迫響應(yīng)信號(hào)級(jí)聯(lián)的初始步驟。

同樣,在作物中Dof蛋白通過(guò)調(diào)控合成脯氨酸和可溶性糖等一系列滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),提升植物抗逆性。在甘蔗中,12個(gè)Dof家族成員受低溫誘導(dǎo)表達(dá)[62]。研究人員在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上研究了葡萄中25個(gè)VaDof基因,結(jié)果顯示其中11個(gè)VaDof基因在冷脅迫下顯著差異表達(dá)。通過(guò)對(duì)35S::VaDof17d葡萄愈傷組織mRNA的比較測(cè)序,發(fā)現(xiàn)VaDof17d與冷響應(yīng)途徑和棉子糖家族寡糖(RFOs)密切相關(guān),VaDof17d可以通過(guò)上調(diào)半乳糖苷合酶(GolS)和棉子糖合酶(RFS)基因。而Dof17d-ED(CRISPR/Cas9介導(dǎo)的Dof17d突變體)的冷耐受性顯著降低,同樣在冷脅迫下RFOs水平出現(xiàn)顯著降低,表明VaDof17d通過(guò)調(diào)控冷脅迫途徑基因和RFOs水平調(diào)控葡萄的抗寒性[63]。此外,過(guò)表達(dá)GhDof1同時(shí)提高了陸地棉的耐鹽和耐冷性[64]。在胡楊(Populuseuphratica)和南京菊(Chrysanthemumnankingense)中,Dof蛋白也參與了控制低溫感知過(guò)程[65]。

高溫脅迫幾乎會(huì)對(duì)作物發(fā)育、生長(zhǎng)、繁殖和產(chǎn)量的所有方面產(chǎn)生不利影響。在甘蔗中有5個(gè)Dof成員受高溫誘導(dǎo)表達(dá)[62]。而在長(zhǎng)時(shí)間熱脅迫下,小麥葉片中3個(gè)Dof編碼基因(TaDof5、TaDof17和TaDof19)表達(dá)下調(diào)[12]。對(duì)辣椒中Dof轉(zhuǎn)錄因子的全基因組鑒定和表達(dá)譜研究表明,一些Dofs編碼基因可作為鹽和熱脅迫的生物標(biāo)志物[66],但熱響應(yīng)的功能表征和激活機(jī)制尚不明確。在核桃中,研究顯示JrDof3和JrGRAS2在熱脅迫下具有相似的表達(dá)模式。酵母單雜交、瞬時(shí)表達(dá)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP-PCR)分析表明,在熱脅迫下,JrDof3能夠特異性結(jié)合位于JrGRAS2啟動(dòng)子區(qū)的AAAG基序。在熱脅迫下,JrGRAS2的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。在擬南芥中過(guò)表達(dá)JrGRAS2與野生型擬南芥相比,過(guò)表達(dá)株系在高溫脅迫下種子萌發(fā)率、鮮重積累量以及過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性均顯著提高。同時(shí),與野生型相比,轉(zhuǎn)基因幼苗電解質(zhì)滲漏(EL)率、過(guò)氧化氫(H2O2)和丙二醛(MDA)含量均降低。因此,JrDof3作為JrGRAS2的上游調(diào)控因子,通過(guò)調(diào)控?zé)峒さ鞍椎谋磉_(dá)提高植物的耐高溫性[67]。這將為利用生物育種培育適應(yīng)氣候變化挑戰(zhàn)的新品中提供關(guān)鍵分子元件。

2.3 其他

Dof蛋白在作物衰老、C/N調(diào)節(jié)、光合作用調(diào)節(jié)、葉綠體發(fā)育等過(guò)程中也發(fā)揮重要作用[28,35,64,68]。MYC2是JA信號(hào)中央調(diào)節(jié)器。研究表明,AtDof2.1直接激活MYC2啟動(dòng)子,通過(guò)促進(jìn)MYC2的表達(dá)增加葉片衰老,MYC2也被鑒定為一種負(fù)責(zé)JA誘導(dǎo)的Dof2.1表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活因子。因此,Dof2.1通過(guò)MYC2-Dof2.1-MYC2反饋轉(zhuǎn)錄環(huán)作為JA誘導(dǎo)葉片衰老增強(qiáng)子[69]。在水稻中,OsDof24(Oryzasativa)能夠抑制葉片衰老。在野生型水稻葉片中,OsDof24的表達(dá)在自然衰老(NS)和暗誘導(dǎo)衰老(DIS)過(guò)程中迅速下降。研究顯示在OsDof24啟動(dòng)子中含有一個(gè)增強(qiáng)誘捕T-DNA的功能獲得突變體OsDof24-d,在NS和DIS期間表現(xiàn)出延遲的葉片黃變。在DIS期間,過(guò)表達(dá)OsDof24的轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)出相同的表型。在暗培養(yǎng)過(guò)程中,OsDof24-d突變體的葉綠素降解基因(NYC1、NYC3和SGR)下調(diào)表達(dá)。而激素處理顯示,只有茉莉酸甲酯能誘導(dǎo)OsDof24的表達(dá)。此外,OsDof24-d中茉莉酸生物合成相關(guān)基因(OsLOX2、OsLOX8、OsHI-LOX、OsAOS1和OsAOS2)的表達(dá)也顯著降低,導(dǎo)致內(nèi)源茉莉酸水平降低,從而使葉片衰老延遲。研究顯示,OsDof24通過(guò)與茉莉酸合成途徑關(guān)鍵基因OsAOS1的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合調(diào)控茉莉酸的合成。綜上所述,OsDof24通過(guò)降低茉莉酸鹽生物合成抑制營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中葉片衰老的誘導(dǎo)。在番茄CDFs中,CDF3可能在擬南芥和番茄的初級(jí)代謝和生長(zhǎng)控制中發(fā)揮重要作用[17,22,25,28]。在滲透脅迫條件下,AtCDF3和SlCDF3基因在番茄中過(guò)表達(dá)可提高產(chǎn)量[28]。這些改善與轉(zhuǎn)基因番茄植株的光合速率增加有關(guān),進(jìn)而增加蔗糖的有效利用和促進(jìn)生長(zhǎng)[25,28]。與此同時(shí),CDF3過(guò)表達(dá)植株表現(xiàn)出較高的氣孔密度和葉肉細(xì)胞電導(dǎo)系數(shù),以及滲透脅迫下較高的Rubisco羧化作用和三糖利用率。通過(guò)分析過(guò)表達(dá)AtCDF3的擬南芥和番茄植株,結(jié)果顯示初級(jí)代謝關(guān)鍵基因被誘導(dǎo)表達(dá),包括丙酮酸激酶(PK)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脫羧酶(GAD),這與谷氨酰胺和天冬酰胺等氨基酸含量較高相關(guān),并改變了TCA周期的代謝物[25,28]。這些代謝物是在非生物脅迫條件下合成的,作為滲透保護(hù)液,保護(hù)膜系統(tǒng)和活性氧清除或次生代謝物的前體[70-71]。此外,由于高鹽會(huì)降低營(yíng)養(yǎng)吸收并影響植物內(nèi)部的營(yíng)養(yǎng)分配,研究人員分析了在鹽脅迫下CDF3過(guò)表達(dá)植物產(chǎn)量的提高是否是由于減少了鈉積累和降低了毒性,并測(cè)定了轉(zhuǎn)基因植物中的礦物質(zhì)組成。生長(zhǎng)抑制通常與營(yíng)養(yǎng)組織內(nèi)部Na+和K+的高度缺乏有關(guān)。通過(guò)測(cè)定過(guò)表達(dá)AtCDF3和野生型植株在對(duì)照和鹽度條件下生長(zhǎng)15 d的葉片、莖和根中鈉、鈣、鎂、鉀和磷酸鹽的總含量顯示,在鹽度條件下野生型植株表現(xiàn)出顯著的礦物質(zhì)流失,而在AtCDF3過(guò)表達(dá)植株中,這些元素的含量保持不變,從而避免鹽脅迫引起的礦物質(zhì)缺乏[28]。

土壤貧瘠也是作物生長(zhǎng)的逆境條件之一。氮(N)是植物生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的營(yíng)養(yǎng)素,是大量細(xì)胞分子的成分,包括氨基酸、核酸、葉綠素、植物激素等[72]。同樣,作物氮素利用效率(NUE)是一個(gè)備受關(guān)注的問(wèn)題。在尋找操縱氮素利用效率的目標(biāo)方面的研究表明,Dof轉(zhuǎn)錄因子在光合作用基因的表達(dá)中起主調(diào)控作用,從而促進(jìn)作物氮的同化[72-74]。葉綠素(chlorophyll)是氮素利用的標(biāo)志,過(guò)表達(dá)擬南芥Dof1能夠顯著增加轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素含量,同時(shí)增強(qiáng)低氮條件下轉(zhuǎn)基因煙草的氮同化效率[73]。與對(duì)照相比,轉(zhuǎn)基因植株中幾乎所有氨基酸都有不同程度增加,差異最大的氨基酸是Glu和Ser家族,而Glu是氮利用效率的良好分子標(biāo)記[75],結(jié)果表明,Dof1過(guò)表達(dá)影響了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)N的同化[74]。對(duì)不同氮處理下生長(zhǎng)的小麥品種的研究表明,在低氮處理下TaDof1的表達(dá)顯著上調(diào)[76]。在擬南芥和水稻中過(guò)表達(dá)玉米ZmDof1,已被報(bào)道能促進(jìn)低氮條件下的氮同化和生長(zhǎng)。然而,與擬南芥和水稻的結(jié)果相反,在不同低氮條件下,導(dǎo)入ZmDof1基因并不能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)在大田和溫室中的正常生長(zhǎng)。研究顯示與氮同化和碳固定相關(guān)的基因沒(méi)有表達(dá),氮/碳濃度和光合速率沒(méi)有增加[77],這可能在不同物種中存在差異。此外,ZmDof1和ZmDof2轉(zhuǎn)錄因子與玉米多個(gè)碳代謝相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān),通過(guò)增強(qiáng)胞質(zhì)型磷酸二激酶(cyPPDK)基因和非光合作用PEPC基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而調(diào)控植物特異的碳代謝途徑[78]。氮素再利用也是保證植物氮素供應(yīng)的關(guān)鍵過(guò)程[72,79]。研究人員對(duì)Dof轉(zhuǎn)錄因子家族在茶樹(shù)氮重組中的潛在功能進(jìn)行了分析[79]。在茶樹(shù)新梢發(fā)育過(guò)程中,大多數(shù)CsDofs在新梢發(fā)育為一芽?jī)扇~時(shí)達(dá)到峰值。此外,CsDof13/16/29/33/34/35/36/39與GDH、GS等N代謝相關(guān)基因的表達(dá)模式顯著相關(guān),表明CsDofs可能在調(diào)控茶葉N代謝相關(guān)基因的表達(dá)中發(fā)揮作用[79]。

3 Dof轉(zhuǎn)錄因子在作物農(nóng)藝性狀改良中的作用

3.1 分枝與株型

分枝是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中最重要的過(guò)程之一,直接關(guān)系到植物生物量和作物產(chǎn)量。過(guò)表達(dá)OsDof12會(huì)導(dǎo)致水稻葉片直立減少,葉片縮短,穗小,導(dǎo)致一次枝和二次枝數(shù)量減少[80]。OsDof12過(guò)表達(dá)系的直立葉片性狀使高密度種植成為可能,從而提高產(chǎn)量。對(duì)世界范圍內(nèi)水稻種質(zhì)資源進(jìn)行單倍型關(guān)聯(lián)分析為抽穗期缺失遺傳力提供了關(guān)鍵線索,其中30個(gè)Dof基因中有22個(gè)與抽穗期相關(guān)。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)靶向的30個(gè)Dof基因中,有11個(gè)基因發(fā)生突變(OsDof1、2、8、9、11、16、21、22、24、26和29),顯示抽穗期、株高或兩者均有顯著表型變化[81]。水稻OsDof11在光合器官的維管細(xì)胞和各種庫(kù)組織中表達(dá)。與野生型植株相比,osdof11突變株為半矮稈植株,分蘗少。糖轉(zhuǎn)運(yùn)率分析顯示,與野生型相比,osdof11植株的糖轉(zhuǎn)運(yùn)量明顯減少。4個(gè)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(SUT)基因OsSUT1、OsSUT3、OsSUT4和OsSUT5以及兩個(gè)糖輸出的轉(zhuǎn)運(yùn)體(Sugar Will be Export Transporters, SWEET)基因OsSWEET11和OsSWEET14的表達(dá)在突變體的各個(gè)器官中均發(fā)生了改變。染色質(zhì)免疫沉淀試驗(yàn)顯示,OsDof11直接結(jié)合SUT1、OsSWEET11和OsSWEET14的啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明,OsDof11通過(guò)調(diào)控水稻SUT和SWEET基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)糖轉(zhuǎn)運(yùn)[82]。同樣,在擬南芥中,苜蓿MtDof32通過(guò)調(diào)控分支調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)分枝數(shù)。此外,過(guò)表達(dá)MtDof32的擬南芥葉和花大小均顯著增加,這與關(guān)鍵器官增大基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)(ERBB-3BINDINGPROTEIN1;AtEBP1;ARGOS-LIKE,AtARLandAtKLU)[83]。綜上所述,Dofs轉(zhuǎn)錄因子在芽分枝和器官相關(guān)性狀中發(fā)揮重要作用。

3.2 開(kāi)花時(shí)間

開(kāi)花時(shí)間在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也非常重要,而GI在光周期開(kāi)花中的作用最為突出[84]。在擬南芥中,轉(zhuǎn)錄組分析顯示,GI和CDFs雖然具有拮抗作用,但在下游基因表達(dá)方面比CO和FT有更廣泛的影響,盡管如此,參與生物鐘節(jié)律的基因是由GI獨(dú)立于CDFs調(diào)控的[17-18,20]。馬鈴薯StCDF1是一個(gè)中心調(diào)控因子,StCDF1等位變異也可能是形成馬鈴薯在夏季/冬季日長(zhǎng)變化大的緯度地區(qū)(如安第斯山脈)馴化的基礎(chǔ),因此可能是在新的地理區(qū)域進(jìn)行量身定制育種的一個(gè)極好目標(biāo)[21]。此外,利用CRISPR/Cas9在TP309(粳稻品種)中對(duì)所有30個(gè)水稻OsDof基因進(jìn)行敲除突變體的研究取得成功[85]。其中12個(gè)OsDof基因的敲除株系(OsDof04-09、14、19、22、25、26、28和30)都有一個(gè)共同的作用,即生長(zhǎng)發(fā)育不良和無(wú)法過(guò)渡到開(kāi)花。低溫、干旱、鹽脅迫和赤霉素(GA3)脅迫高度誘導(dǎo)PheDof12-1的轉(zhuǎn)錄水平。過(guò)表達(dá)PheDof12-1的轉(zhuǎn)基因擬南芥在長(zhǎng)日(LD)條件下開(kāi)花早,而在短日(SD)條件下開(kāi)花時(shí)間不受影響。酵母單雜交實(shí)驗(yàn)表明,PheDof12-1可以與PheCOL4啟動(dòng)子序列結(jié)合。同時(shí)PheDof12-1表現(xiàn)出強(qiáng)烈的晝夜節(jié)律,光處理抑制,暗處理誘導(dǎo)[86]。番茄Dof蛋白TDDF1,同時(shí)參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律和抗逆性。在轉(zhuǎn)移到連續(xù)黑暗(DD)或光照(LL)條件后,TDDF1的表達(dá)仍保持較大的每日波動(dòng)。過(guò)表達(dá)TDDF1通過(guò)上調(diào)番茄花期調(diào)控基因表達(dá),以及與花誘導(dǎo)劑SFT蛋白互作,誘導(dǎo)番茄早花[26]。

3.3 其他

大豆是油料作物中最重要的豆科種子作物之一。研究顯示,大豆GmDof4和GmDof11過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中總脂肪酸和脂類含量增加。進(jìn)一步分析顯示其通過(guò)直接結(jié)合下游基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件激活乙酰輔酶羧化酶基因和長(zhǎng)鏈輔酶CoA合成酶基因轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而調(diào)控脂質(zhì)代謝[87]。以上結(jié)果表明,GmDof通過(guò)上調(diào)與脂肪酸生物合成相關(guān)的基因表達(dá)來(lái)提高大豆種子的脂質(zhì)含量。近年來(lái)因棉清油含有大量人體必需的脂肪酸和較高的亞油酸含量,棉籽也被用作重要的油料原料。研究發(fā)現(xiàn)棉花中過(guò)表達(dá)GhDof1能夠顯著提高棉花的耐鹽性和耐寒性[64]。過(guò)表達(dá)GhDof1基因可使棉籽含油量增加16%以上[64],這與GmDof4具有相似的調(diào)節(jié)種子含油量(種子含油量提高了20%以上)的功能[87]。表明部分Dofs是提高油料作物非生物耐性和籽油含量的功能性轉(zhuǎn)錄因子。此外,番茄CDF3基因的過(guò)表達(dá)能夠改變番茄果實(shí)中有機(jī)酸和糖含量,改善果實(shí)風(fēng)味和品質(zhì)[28]。這對(duì)增加作物產(chǎn)量和改良風(fēng)味品質(zhì)具有重要意義。

4 結(jié)語(yǔ)

干旱、鹽和溫度脅迫等是影響自然界植物地理分布、限制農(nóng)業(yè)植物生產(chǎn)力和威脅糧食安全的主要環(huán)境因素。氣候變化加劇了這些非生物脅迫的不利影響,也給作物可持續(xù)和高質(zhì)量生產(chǎn)以及糧食安全帶來(lái)新的挑戰(zhàn)[88]。通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-DNA和/或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的多種轉(zhuǎn)錄因子,Dof家族成員可能參與對(duì)不同非生物脅迫反應(yīng)的調(diào)控,也可能參與作物發(fā)育與逆境脅迫的調(diào)節(jié),如開(kāi)花時(shí)間和逆境脅迫等。同時(shí),Dof轉(zhuǎn)錄因子可以直接或間接參與作物與C和N代謝相關(guān)的各種信號(hào)通路的交叉作用。因此,分析研究Dofs調(diào)控作物代謝穩(wěn)態(tài)、脅迫反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制非常重要。Dof蛋白可能作為上游調(diào)控因子,在調(diào)控作物逆境脅迫及農(nóng)藝性狀改良中扮演重要角色。然而,只有少數(shù)作物Dof蛋白功能被鑒定。Dof轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)各種脅迫時(shí)表現(xiàn)出多重、相互關(guān)聯(lián)的表達(dá)模式,可以利用這些模式通過(guò)生物育種使作物品種實(shí)現(xiàn)多特性聚合改良等種源創(chuàng)新,獲得高抗性和理想農(nóng)藝性狀兼具的作物品種。