李彥霞 王晉鵬 馮芬 包斌武 董益聞 王興平 羅仍卓么

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2. 寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細(xì)胞育種重點實驗室，銀川 750021）

大腸桿菌（Escherichia coli）是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，感染奶牛乳房時會引起急性臨床乳房炎，造成奶牛乳腺上皮細(xì)胞（bovine mammary epithelial cells，bMECs）的乳合成能力和分泌功能障礙，導(dǎo)致牛奶品質(zhì)顯著下降［1-3］。研究表明，即使患病奶牛的臨床癥狀和致病菌消失，其乳腺也不會迅速恢復(fù)到原狀［4］，這將導(dǎo)致產(chǎn)奶量持續(xù)受到影響。除了上述影響，乳房炎的致病菌還會誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為E.coli表面的活性成分，是E.coli型乳房炎的主要致病因子［5］，它可以引起腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）等基因在奶牛乳腺組織和bMECs 炎癥過程中表達(dá)量升高［6］。此外，乳房炎也可引起外周血液［7］和乳腺組織［8］的基因表達(dá)量發(fā)生變化，進(jìn)而嚴(yán)重影響了奶牛的產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)。因此，從分子和細(xì)胞水平上研究抑制產(chǎn)奶量減少和乳品質(zhì)下降的原因，是當(dāng)下學(xué)者們研究的熱點領(lǐng)域，為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)奶牛的分子育種奠定基礎(chǔ)。

在奶牛產(chǎn)奶性狀方面，學(xué)者們挖掘了許多與奶牛產(chǎn)奶量、乳蛋白率和乳脂率相關(guān)的基因，如脂肪酸結(jié)合蛋白3（fatty acid binding protein 3，F(xiàn)ABP3）、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）、α-酪蛋白家族（casein alpha-S1，CSN1S1）、β-酪蛋白（casein beta，CSN2）、α-乳白蛋白（lactalbumin alpha，LALBA）、乳脂球表皮生長因子8（milk fat globule-EGF factor 8 protein，MFGE8） 基因。FABP3和LPL主要與乳脂相關(guān)，其中FABP3調(diào)控乳脂主要合成通道，LPL參與乳脂合成過程和代謝過程［9-10］；牛奶蛋白主要由4 種酪蛋白和乳清蛋白組成，CSN1S1和CSN2是乳蛋白組成成分中的兩種酪蛋白，而LALBA是乳蛋白組成成分中的乳清蛋白［11］。MFGE8主要與炎癥以及產(chǎn)奶量相關(guān)［12-13］。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上述基因在奶牛乳合成中發(fā)揮著重要作用，但是對于它們在E.coli型奶牛乳房炎和bMECs 炎癥反應(yīng)中的表達(dá)模式目前還尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

因此，本研究采用qPCR 技術(shù)檢測了CSN1S1、CSN2、LALBA、FABP3、LPL和MFGE8基因在E.coli型乳房炎奶牛乳腺組織和bMECs 炎癥反應(yīng)中的表達(dá)模式，以期為解析E.coli型乳房炎奶牛的產(chǎn)奶量、乳蛋白率及乳脂率下降的原因，以及為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)奶牛的分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用的乳腺組織為2-3 歲健康奶牛和E.coli誘導(dǎo)乳房炎的荷斯坦奶牛的乳腺組織，為實驗室前期采集、鑒定和凍存［8］。其中E.coli誘導(dǎo)乳房炎的荷斯坦奶牛的乳腺組織是采用無菌手術(shù)法活體采集奶牛的乳腺組織，主要步驟：將E.coli凍干粉溶解，擴(kuò)大培養(yǎng)，用PBS 稀釋，用通乳針將E.coli懸浮液經(jīng)乳導(dǎo)管一次性注入到試驗組奶牛的右后乳房中，在接種后的第7 天，采集其乳腺組織［14］；bMECs 為課題組前期鑒定并保存于液氮罐中的細(xì)胞［15］。

實驗所用的主要儀器：CO2培養(yǎng)箱（Thermo，美國）、CFX96 實時熒光定量PCR 儀（Bio-Rad，美國）、高壓滅菌鍋（普和希，日本）、電熱恒溫水浴鍋（一恒，上海）、普通PCR 儀（Bio-Rad，美國）。

實驗所用的主要試劑：DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone，美國）、0.25%的胰酶消化液（Hyclone，美國）、PBS 緩沖液（Hyclone，美國）、胎牛血清（BI，以色列）、脂多糖（Sigma，美國）、Real time-熒光定量PCR 試劑盒（聚合美，北京）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，北京）、TriZol 試劑（TaKaRa，北京）、RNase-free H2O（天根，北京）。

1.2 方法

1.2.1 bMECs 的復(fù)蘇與傳代培養(yǎng) 從液氮中取出bMECs，37℃水浴鍋解凍；接種在含有10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2和100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞融合度為90%時傳代，即用PBS 漂洗細(xì)胞1-2 遍，再用胰酶消化液吹打消化2-3 min，加入2 mL 培養(yǎng)基終止消化；轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，1 000 r/min 離心5 min；棄上清，加入1 mL 培養(yǎng)基吹打混勻后，接種到新培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 bMECs 炎癥模型的建立 將bMECs 接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度達(dá)60%-70%時，向每孔細(xì)胞中滴加LPS 溶液（終濃度為50 ng/μL），誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［16］。在LPS 誘導(dǎo)的0、3、6、12 和24 h，分別收集細(xì)胞，用于RNA 提取。通過檢測細(xì)胞炎癥因子mRNA 的表達(dá)量，判斷炎性細(xì)胞模型是否構(gòu)建成功。

1.2.3 RNA 提 取 與cDNA 合 成 采 用TriZol 法 分別提取約1 cm3的健康奶牛右后乳區(qū)的乳腺組織和E.coli誘導(dǎo)乳房炎奶牛右后乳區(qū)的乳腺組織，以及LPS 誘導(dǎo)不同時間（0、3、6、12 和24 h）bMECs的RNA。電泳檢測RNA 的完整性，全波長酶標(biāo)儀檢測RNA 的濃度與純度（1.8 < OD260/280< 2.0）。

采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書，通過兩步反應(yīng)（去除基因組DNA 反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄）合成cDNA，以此cDNA 為模板，進(jìn)行下一步實驗。多功能酶標(biāo)儀檢測cDNA 的濃度，稀釋至100 ng/μL，-20℃凍存。

1.2.4 qPCR 反應(yīng) 參照GenBank 數(shù)據(jù)庫中各mRNA的序列信息，利用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計qPCR引物（表1），委托通用生物（安徽）有限公司合成，RNase free H2O 溶解。

表1 qPCR 引物信息Table1 qPCR primer information

qPCR 的反應(yīng)體系：2×M5 Hiper SYBR Premix Es Taq (with Tli RNaseH） 10.0 μL，100 μmol/L 的 上下游引物各0.8 μL，DNA 模板1.5 μL，加滅菌去離子水至20.0 μL。qPCR 的反應(yīng)程序：（預(yù)變性95℃30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s）40 個 循 環(huán)；95℃ 10 s，65℃ 5 s。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用2-△△ct方法計算基因的相對表達(dá)量（n=3），所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。利用GraphPad 8.3 軟件的單因素方差（one-way AVONA）進(jìn)行組間基因表達(dá)水平的差異顯著性分析，P< 0.05 表示差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 候選基因在E.coli型乳房炎奶牛的乳腺組織中的表達(dá)分析

2.1.1 乳蛋白和泌乳量相關(guān)候選基因在奶牛乳腺組織中的表達(dá)分析 利用qPCR 技術(shù)檢測了乳蛋白和泌乳量相關(guān)的CSN1S1、CSN2和LALBA基因在健康奶牛和E.coli型乳房炎奶牛的乳腺組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明，與健康奶牛相比，乳蛋白相關(guān)的CSN1S1、CSN2和LALBA基因在E.coli型乳房炎奶牛的乳腺組織中的mRNA 表達(dá)量均極顯著下調(diào)（P<0.000 1）（圖1）。該結(jié)果提示，在奶牛E.coli型乳房炎發(fā)生后，上述3 個基因表達(dá)量下降可能導(dǎo)致牛奶的乳蛋白含量及泌乳量減少。

圖1 CSN1S1、CSN2 和LALBA 基因在E.coli 型乳房炎奶牛的乳腺組織中的表達(dá)量Fig. 1 Expressions of CSN1S1, CSN2 and LALBA gene in the cow mammary tissues of dairy cows with E.coli type mastitis

2.1.2 乳脂調(diào)控相關(guān)候選基因在奶牛乳腺組織中的表達(dá)分析 利用qPCR 技術(shù)檢測了乳脂調(diào)控相關(guān)的FABP3和LPL基因在健康奶牛和E.coli型乳房炎奶牛的乳腺組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明，與健康奶牛相比，上述2 個基因在E.coli型乳房炎的乳腺組織中的表達(dá)量都極顯著下調(diào)（P< 0.000 1）（圖2）。上述結(jié)果提示，F(xiàn)ABP3和LPL基因表達(dá)量下調(diào)可能導(dǎo)致了在E.coli型乳房炎奶牛分泌的牛奶乳脂減少和乳脂率降低。

圖2 FABP3 和LPL 基因在E.coli 型乳房炎奶牛的乳腺組織中的表達(dá)量Fig. 2 Expressions of FABP3 and LPL gene in the mammary tissues of dairy cows with E.coli mastitis

2.1.3 炎癥和泌乳量相關(guān)MFGE8基因在奶牛乳腺組織中的表達(dá)分析 利用qPCR 技術(shù)檢測了MFGE8基因在健康奶牛和E.coli型乳房炎奶牛的乳腺組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明，與健康奶牛相比，MFGE8基因在E.coli型乳房炎的乳腺組織中的表達(dá)量都極顯著下調(diào)（P< 0.000 1）（圖3）。結(jié)果提示，MFGE8基因的表達(dá)量降低導(dǎo)致抗炎反應(yīng)減弱，炎癥反應(yīng)加劇，最終乳腺組織的功能減弱，導(dǎo)致產(chǎn)奶量減少。

圖3 MFGE8 基因在E.coli 型乳房炎奶牛的乳腺組織中的表達(dá)量Fig. 3 Expression of MFGE8 gene in mammary tissue of dairy cows with E.coli mastitis

2.2 bMECs炎癥模型構(gòu)建的驗證結(jié)果

本研究通過體外培養(yǎng)bMECs（圖4-A），利用LPS 誘導(dǎo)bMECs 構(gòu)建細(xì)胞炎癥模型。為驗證炎癥細(xì)胞模型的可靠性，利用qPCR 技術(shù)檢測了LPS 誘導(dǎo)不同時間細(xì)胞內(nèi)主要炎癥因子基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與0 h（對照組）相比，炎癥因子TNF-α在6 h 的表達(dá)量極顯著上調(diào)（P< 0.000 1）（圖4-B）；炎癥因子IL-6在3、6 和12 h 時的表達(dá)量極顯著上調(diào)（P< 0.01）（圖4-C）；炎癥因子IL-8在6 h、12 h 和24 h 的表達(dá)量極顯著上調(diào)（P< 0.01）（圖4-D），說明本實驗成功構(gòu)建了bMECs 炎癥模型。

圖4 主要炎癥因子基因在LPS 誘導(dǎo)bMECs 不同時間的表達(dá)量Fig. 4 Expression of main inflammatory factor genes in LPS-induced bMECs at different times

2.3 候選基因在LPS誘導(dǎo)bMECs炎癥反應(yīng)中的表達(dá)分析

2.3.1 乳蛋白和泌乳量相關(guān)候選基因在bMECs 炎癥反應(yīng)中的表達(dá)量 為揭示乳蛋白和泌乳量相關(guān)的CSN1S1、CSN2及LALBA基因在bMECs 炎癥反應(yīng)中的動態(tài)表達(dá)情況，采用qPCR 技術(shù)檢測了它們在LPS誘導(dǎo)bMECs 產(chǎn)生炎癥反應(yīng)不同時間的表達(dá)量。結(jié)果表明，與對照組（0 h）相比，CSN1S1、CSN2及LALBA基因的表達(dá)量都顯著降低，其中CSN1S1在LPS 誘導(dǎo)3、6、12、24 h 后的表達(dá)量都極顯著下調(diào)（P< 0.000 1）（圖5-A）；CSN2在LPS 誘 導(dǎo)3 h 后表達(dá)量降低，但未達(dá)到顯著效果，當(dāng)LPS 誘導(dǎo)6、12、24 h 時，CSN2的表達(dá)量極顯著下調(diào)（P<0.000 1）（圖5-B）；LALBA在LPS 誘 導(dǎo)3、6、12 h表達(dá)量顯著下調(diào)（P< 0.05），而24 h 時表達(dá)量降低，但差異不顯著（P> 0.05）（圖5-C）。結(jié)果提示，在LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥后，下調(diào)了上述基因的表達(dá)，可能降低了bMECs 中乳蛋白的合成與乳汁分泌量。

圖5 乳蛋白相關(guān)基因在LPS 誘導(dǎo)bMECs 不同時間的表達(dá)量Fig. 5 Expressions of milk protein-related genes in LPSinduced bMECs at different times

2.3.2 乳脂調(diào)控相關(guān)候選基因在bMECs 炎癥反應(yīng)中的表達(dá)量 為探討乳脂相關(guān)基因FABP3和LPL在bMECs 炎癥反應(yīng)中的動態(tài)表達(dá)情況，采用qPCR 技術(shù)檢測了它們在LPS 誘導(dǎo)bMECs 不同時間的表達(dá)量，結(jié)果表明，與對照組（0 h）相比，F(xiàn)ABP3和LPL在LPS 誘導(dǎo)bMECs 產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的3、6、12和24 h 的表達(dá)量均顯著下調(diào)，其中FABP3在3、6、12 和24 h 的表達(dá)量極顯著下調(diào)（P< 0.000 1）（圖6-A）；LPL在3 h 的表達(dá)量顯著下調(diào)（P< 0.05），在6、12 和24 h 的表達(dá)量極顯著下調(diào)（P< 0.000 1）（圖6-B）。結(jié)果提示，在LPS 誘導(dǎo)bMECs 產(chǎn)生炎癥過程中上述基因表達(dá)量下調(diào)，可能導(dǎo)致了乳中的乳脂率降低。

圖6 乳脂調(diào)控相關(guān)基因在LPS 誘導(dǎo)bMECs 不同時間的表達(dá)量Fig. 6 Expressions of milk fat regulation related genes in LPS-induced bMECs at different times

2.3.3MFGE8基因在bMECs 炎癥反應(yīng)中的表達(dá)量 為探討基因MFGE8在bMECs 炎癥反應(yīng)中的動態(tài)表達(dá)情況，采用qPCR 技術(shù)檢測了其在LPS 誘導(dǎo)bMECs 不同時間的表達(dá)量，結(jié)果表明，與對照組（0 h）相比，MFGE8在3、12 和24 h 的表達(dá)量極顯著下調(diào)（P< 0.001），在6 h 的表達(dá)量也極顯著下調(diào)（P< 0.000 1）（圖7）。結(jié)果提示，MFGE8表達(dá)量降低，吞噬凋亡細(xì)胞的能力下降，抗炎反應(yīng)減弱，導(dǎo)致bMECs 炎癥反應(yīng)的抵抗力下降，乳合成能力和泌乳量減少。

圖7 MFGE8 基因在LPS 誘導(dǎo)bMECs 不同時間的表達(dá)量Fig. 7 Expressions of MFGE8 gene in LPS-induced bMECs at different times

3 討論

乳房炎作為奶牛最常見的疾病之一，患病后奶牛健康狀況急劇下降，泌乳量減少，但是其分子層面的原因尚不清楚。乳腺組織是奶牛泌乳的主要功能器官，而bMECs 是泌乳的主要功能細(xì)胞，也是乳腺防御病原菌入侵的第一道防線。LPS 作為E.coli的主要毒力因子，可誘導(dǎo)bMECs 產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，并且可導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡［19］。當(dāng)奶牛乳腺組織受到E.coli刺激時，其生理狀態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)出乳房炎臨床癥狀，產(chǎn)奶量明顯降低，牛奶體細(xì)胞數(shù)上升［20］。值得一提的是，乳腺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)時，除了bMECs 之外，其他免疫細(xì)胞也參與炎癥反應(yīng)［14］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，LPS 誘導(dǎo)的乳房炎癥反應(yīng)可影響乳蛋白和乳脂的合成［21-22］。因此，為全面探討E.coli型乳房炎中泌乳量、乳蛋白和乳脂率下降的原因，本研究從組織水平（E.coli型乳房炎奶牛和健康奶牛的乳腺組織）和細(xì)胞水平（LPS誘導(dǎo)的bMECs）2 個層面研究了6 個泌乳性狀相關(guān)候選基因（CSN1S1、CSN2、LALBA、FABP3、LPL和MFGE8）的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述6 個候選基因在炎癥前后的組織水平和細(xì)胞水平的表達(dá)量變化是完全一致的，說明這6 個基因參與了乳腺組織和bMECs 的泌乳或炎癥反應(yīng)過程。

據(jù)報道，牛奶中酪蛋白編碼的基因CSN1S1、CSN2和LALBA的表達(dá)量與產(chǎn)奶量顯著相關(guān)［23］。CSN1S1和CSN2是奶牛泌乳性狀的關(guān)鍵基因［24］，兩者相互作用、相互影響。Wu 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，在肽聚糖（peptidoglycan, PGN）和脂磷壁酸（lipoteichoic acid, LTA）引起的奶牛乳房炎中，CSN1S1和CSN2基因的mRNA 表達(dá)量降低，并通過降低組蛋白H3乙?；瑴p少了泌乳量。LALBA是泌乳期的bMECs產(chǎn)生的一種對牛奶和乳腺具有特異性的牛奶蛋白［26］，與溶菌酶具有高度同源性［27］，可以通過催化乳糖合成進(jìn)而調(diào)控乳產(chǎn)量［28］。在小鼠乳腺中注射LPS 24 h 內(nèi)，LALBA的表達(dá)量顯著降低，其表達(dá)量降低可能是通過LPS 誘導(dǎo)核因子-κB（NF-κB）和細(xì)胞因子的產(chǎn)生來介導(dǎo)［29］。本研究中也發(fā)現(xiàn)CSN1S1、CSN2和LALBA基因在E.coli型乳房炎奶牛乳腺組織和炎性細(xì)胞模型中的表達(dá)量顯著降低。結(jié)合上述前人的研究結(jié)果，推測CSN1S1、CSN2和LALBA基因的表達(dá)量降低，可能是引起E.coli型乳房炎產(chǎn)奶量和乳蛋白率降低的原因。

乳脂是牛奶的主要成分，也是乳品質(zhì)的主要檢測指標(biāo)之一。在乳脂代謝調(diào)節(jié)的研究中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)LPL和FABP3是參與乳脂合成與分解代謝過程中的關(guān)鍵蛋白［30-31］。FABP3作為結(jié)合脂肪酸的FABP家族成員之一，可協(xié)同其他基因形成一個調(diào)控奶牛乳腺脂肪酸向乳脂合成的通道［9］。已有研究表明，F(xiàn)ABP3與乳脂合成信號通路中的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子成正相關(guān)關(guān)系［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3在E.coli型乳房炎奶牛的乳腺組織和炎癥細(xì)胞模型中的表達(dá)量顯著下調(diào)。結(jié)合前人的研究結(jié)果，推測在E.coli型奶牛乳房炎中，F(xiàn)ABP3基因表達(dá)下調(diào)，抑制了乳脂合成，降低了牛奶的乳脂率。

LPL 是脂肪代謝的關(guān)鍵酶，催化產(chǎn)生甘油三酯，并將脂蛋白水解為脂肪酸和單甘油三酯，參與了脂肪酸合成和組織吸收利用的整個過程［10,33-34］。乳腺上皮細(xì)胞可以生成LPL，哺乳期LPL的酶活性較高，增加了乳腺中脂肪酸的釋放［31］。與健康奶牛的乳汁相比，乳房炎奶牛的乳汁中游離脂肪酸含量較高，但LPL活性較低［35］。與上述研究結(jié)果一致，本研究中LPL基因在E.coli型乳房炎奶牛的乳腺組織和炎性細(xì)胞模型中的表達(dá)量也顯著降低，這可能導(dǎo)致E.coli型乳房炎奶牛的乳腺中LPL的活性降低，抑制了脂肪酸的釋放，使得牛奶的乳脂率降低。

MFGE8基因在乳腺組織、乳腺上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中均存在［36］，但在乳腺上皮細(xì)胞中以乳糖蛋白的形式大量存在，且與泌乳量密切相關(guān)。此外，它還具有抗菌和抗病毒作用，在乳腺退化期間可清除凋亡的乳腺上皮細(xì)胞［12-13］。當(dāng)缺乏MFGE8時，導(dǎo)致bMECs 凋亡和MFGs 的清除功能延遲，以及乳腺開始退化和產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［37］。以上研究表明，MFGE8在乳腺組織中發(fā)揮著重要作用。該結(jié)果與本實驗結(jié)果相似，即在E.coli型乳房炎發(fā)生或在bMECs 產(chǎn)生炎癥后，乳腺組織和bMECs 中MFGE8的表達(dá)量顯著降低。結(jié)合前人結(jié)果，推測MFGE8的表達(dá)量降低可能使得吞噬細(xì)胞凋亡能力降低，抗炎反應(yīng)減弱，炎癥反應(yīng)加劇，最終乳腺組織的功能減弱，導(dǎo)致乳脂合成和產(chǎn)奶量減少。

4 結(jié)論

E.coli型奶牛乳房炎發(fā)生和LPS 誘導(dǎo)bMECs 產(chǎn)生炎癥后，產(chǎn)奶相關(guān)基因CSN1S1、CSN2、LALBA、FABP3、LPL和MFGE8的表達(dá)量均顯著下降，可能導(dǎo)致乳蛋白合成減少、脂肪酸釋放降低和產(chǎn)奶量下降，解釋了E.coli型乳房炎發(fā)生過程中產(chǎn)奶量減少和乳脂率降低的原因，研究結(jié)果可為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的奶牛分子育種提供參考。