沈文鳳王明清趙傳志于麗娜畢潔宋昱江晨孫杰遲曉元

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所，山東 濟(jì)南 250100；3.青島大學(xué)，山東 青島 266071)

花生是重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物，我國產(chǎn)量居世界首位[1]，山東、河南等地為主要種植區(qū)[2]。花生種皮也被稱為花生紅衣，含有豐富的多酚類化合物(如原花青素)，是花生營養(yǎng)價值的重要體現(xiàn)。由于提取成本高、效率低，花生紅衣除少量被用于中藥外，常被當(dāng)做廢棄料制成動物飼料，直接利用價值低廉[3，4]。原花青素具有抗菌抑菌、抗氧化的作用，可改善關(guān)節(jié)靈活性、抑制腫瘤、預(yù)防腦病變和心血管疾病等[5～9]，也可以降血脂血糖，預(yù)防帕金森氏病和阿爾茨海默氏病[10，11]等氮氧相關(guān)性疾病。原花青素作為一種綠色安全的天然抗氧化劑，具有廣闊的應(yīng)用前景[12]。

花生紅衣中的原花青素由黃烷-3-醇單體聚合為不同分子質(zhì)量的混合物，根據(jù)單體連接鍵的不同分為A、B型兩種原花青素，A型原花青素只存在于少數(shù)食物中，如蔓越莓、花生、李子[13，14]，B型原花青素則廣泛存在于大部分食物。原花青素在大多數(shù)食物中為多聚體，如在藍(lán)莓、葡萄、蔓越莓、草莓中多聚體含量大于75%[15，16]，而研究表明只有低聚體(DP≤3)能被胃腸道完全吸收。由此可見，原花青素在食物中存量雖大，但能被吸收的很少[17]。Karchesy等研究發(fā)現(xiàn)，成熟花生紅衣中原花青素含量為17%[18]，其中50%為低聚體，所以成熟花生中原花青素具有更高的利用價值，花生紅衣的原花青素產(chǎn)品有待于開發(fā)。

花生紅衣中的原花青素分離純化方法主要有層析法、溶劑萃取分離法、液相色譜制備法等[19]，提取過程復(fù)雜，成本高。大孔樹脂具有吸附性強(qiáng)、可再生、解析快、使用壽命長、可回收等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物的分離純化中得到了廣泛應(yīng)用[20]。不同大孔樹脂吸附原花青素存在顯著差異[21-25]，因此本研究選用8種不同結(jié)構(gòu)的大孔樹脂進(jìn)行試驗比較，優(yōu)化其吸附條件，得到效率最高的大孔樹脂吸附方法，并對不同方法提取的原花青素進(jìn)行抗氧化活性檢測，以期為花生紅衣產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生種皮，山東省花生研究所提供；大孔樹脂XDA-6、LSA-10、LSA-12、LX-T28、D101、LX-32、LX-180S、LX-17，均為藍(lán)曉科技有限公司惠贈；無水乙醇、甲醇、香草醛、鹽酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，SIGMA-ALDRICH)、水楊酸、鄰苯三酚、七水合硫酸亞鐵等均為分析純；試驗用水為純水(去離子水)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

?KTA pure層析系統(tǒng)(GE醫(yī)療集團(tuán))；數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；紫外可見分光光度計(日本SHIMADZU公司)；立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱(德國CRYSTAL公司)；循環(huán)水式多用真空泵(上海知信實(shí)驗儀器技術(shù)有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)(美國SIM公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生紅衣原花青素提取液的制備 稱取一定質(zhì)量花生紅衣，加入10倍體積純水，于水浴鍋中50℃提取2 h，兩層濾紙抽濾即得花生紅衣提取液。

1.3.2 大孔樹脂的預(yù)處理 用無水乙醇浸泡大孔樹脂4 h以上，去除微孔中的空氣。用純水沖洗至洗出液無乙醇味，濾干備用[26]。

1.3.3 花生原花青素的定量測定 香草醛-鹽酸法[27]:取原花青素樣液0.5 mL于試管中，加4%香草醛甲醇溶液3.0 mL混勻，再加入1.5 mL濃鹽酸混勻。室溫反應(yīng)15 min，于500 nm處測吸光度。注意避光操作。

1.3.4 大孔樹脂靜態(tài)吸附和洗脫試驗 分別稱取預(yù)處理的不同型號樹脂各1.0 g于三角瓶中，加入7.53 mg/mL的花生紅衣提取液20.0 mL。于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中25℃振蕩24 h后過濾，于500nm處測吸光度，計算吸附率。每個樣品做3個平行試驗。

過濾后的樹脂加入95%乙醇20.0 mL，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中解析12 h，測定解析液吸光度，計算解析率。

式中:C0、C1、C分別為提取液、解析液、過濾液的濃度，單位均為mg/mL。

1.3.5 大孔樹脂動態(tài)吸附解析試驗 選出的大孔樹脂經(jīng)預(yù)處理后準(zhǔn)確稱量4.0 g，采用濕法裝柱。制備一定濃度的樣液，控制上樣流速，每10mL收集一次流出液，測定其吸光度，當(dāng)流出液質(zhì)量濃度為原液濃度的10%時為泄漏點(diǎn)[28]，停止進(jìn)樣。每個樣品重復(fù)測3次。根據(jù)流出液體積與大孔樹脂吸附前后溶液濃度差的乘積可計算出動態(tài)吸附量，累計動態(tài)吸附量可得總吸附量。

(1)上樣流速對大孔樹脂吸附原花青素的影響:配制1.0 mg/mL的原花青素溶液，以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min的流速上樣。收集流出液，測定吸光度，以原花青素吸附量為指標(biāo)，測定上樣流速對大孔樹脂吸附原花青素的影響。

(2)上樣濃度對大孔樹脂吸附原花青素的影響:分別配制1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mg/mL的原花青素溶液，以1.5 mg/mL的流速上樣。收集流出液，測定吸光度，以原花青素吸附量為指標(biāo)，考察上樣濃度對大孔樹脂吸附原花青素的影響。

(3)純水洗脫用量的確定:取4.0 g經(jīng)預(yù)處理的大孔樹脂裝柱并按最佳吸附條件上樣吸附，然后用純水洗柱，流速為1.0 mL/min，將未被吸附的色素及雜質(zhì)洗掉。分步收集流出液，并測定其吸光度，確定純水用量。

1.3.6 不同濃度乙醇提取物的抗氧化性檢測純水洗脫后，選擇20%、40%、60%乙醇溶液進(jìn)行逐步洗脫，上樣量為2個體積柱[29]，流速設(shè)定為1.0 mL/min，得到提取液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉多余乙醇，凍干。凍干粉末用于抗氧化活性測定。

(1)羥自由基清除率的測定:取上述提取物稀釋液0.25 mL加6 mmol/L FeSO4·7H2O 0.25 mL混合均勻，再加入6 mmol/L H2O20.25 mL和6mmol/L水楊酸0.25 mL混勻后37℃水浴1 h，于510 nm處測吸光度，重復(fù)3次。計算羥自由基清除率[30]:

式中:Am為H2O2、FeSO4、樣品的吸光度；An為純水、FeSO4、樣品的吸光度；Ap為純水、FeSO4、H2O2的吸光度。

(2)DPPH自由基清除率的測定:取上述提取物稀釋液2.5 mL，加0.2 mmol/L DPPH溶液2.5 mL充分混勻反應(yīng)30 min，于517 nm處測吸光度，以2.5 mL純水代替待測液作為空白對照，重復(fù)3次。計算DPPH自由基清除率[31]:

式中:Ai為DPPH、樣品的吸光度；Aj為無水乙醇、樣品的吸光度；A0為無水乙醇、DPPH的吸光度。

(3)超氧陰離子自由基清除率的測定:取上述提取物稀釋液0.5 mL加50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液1.25 mL混勻，25℃水浴20 min，再加入25 mmol/L鄰苯三酚0.5 mL，5 min后加入10 mmol/L鹽酸0.5 mL混勻，于320 nm處測吸光值，重復(fù)3次。計算超氧陰離子自由基清除率[32]:

超氧陰離子清除率(%)＝[1-(Ah-Ak)/Aq]×100 。式中:Ah為Tris-HCl、鄰苯三酚、鹽酸、樣品的吸光度；Ak為Tris-HCl、純水、鹽酸、樣品的吸光度；Aq為Tris-HCl、鄰苯三酚、鹽酸、純水的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel處理數(shù)據(jù)與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL質(zhì)量濃度原花青素標(biāo)準(zhǔn)液，香草醛-鹽酸法測定其吸光度，繪制出原花青素質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系曲線，得回歸方程y＝0.6669x＋0.0041(x為吸光度，y為原花青素質(zhì)量濃度，mg/mL)，R2＝0.9997。

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同大孔樹脂對花生原花青素的靜態(tài)吸附解析比較

不同型號的大孔樹脂空間結(jié)構(gòu)、極性不同，對其吸附能力有著重要影響。大孔樹脂的主要吸附作用力是范德華力[29]，即吸附質(zhì)與吸附劑之間的作用力，吸附質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和吸附劑合成原料的結(jié)構(gòu)是影響彼此吸附作用的重要因素。本試驗選用極性樹脂(LX-17)、中極性樹脂(LX-32、XDA-6)、弱極性樹脂(LSA-10、LSA-12)和非極性樹脂(LX-T28、D101、LX-180S)4類8種樹脂進(jìn)行考察，由表1可以看出，吸附率最高的是非極性樹脂LX-180S，高達(dá)94.98%，其次是中極性樹脂LX-32，為94.15%，弱極性樹脂LSA-10吸附率最低，僅為52.75%。

表1 不同大孔樹脂對花生原花青素的靜態(tài)吸附、解析比較

解析的實(shí)質(zhì)是吸附的逆過程，根據(jù)相似相容原理，95%乙醇強(qiáng)極性溶劑易對原花青素分子產(chǎn)生較強(qiáng)作用力，從而使原花青素從大孔樹脂上解析下來[33]。解析率最高的是中極性樹脂XDA-6，為98.91%，其次是弱極性樹脂LSA-10，為98.47%，非極性樹脂LX-180S解析率最低，為81.57%。

樹脂LX-180S雖然吸附率最高94.98%，但解析率低，吸附率與解析率乘積為77.48%，而樹脂LX-32的吸附率同為94%以上且吸附率與解析率乘積為84.30%，比樹脂LX-180S高出6.82個百分點(diǎn)，綜上選擇中極性樹脂LX-32為分離原花青素較適和的大孔樹脂。

2.3 大孔樹脂動態(tài)吸附試驗結(jié)果

2.3.1 上樣流速對大孔樹脂吸附量的影響 如圖2所示，當(dāng)柱子流速為0.5 mL/min時，原花青素的吸附量為66.00 mg，隨著流速的增大，LX-32樹脂對原花青素的吸附量減少，這與馬萌[34]、田富林[35]等的研究結(jié)果一致。當(dāng)流速為2.0～2.5 mL/min時吸附量下降速度較快，這是由于流速影響原花青素向大孔樹脂內(nèi)表面擴(kuò)散，流速過快，導(dǎo)致原花青素分子來不及擴(kuò)散到樹脂內(nèi)表面，過早發(fā)生泄漏，浪費(fèi)樣品。0.5 mL/min時吸附率最高，達(dá)到93.40%，但流速過慢，耗時過長，生產(chǎn)效率低；當(dāng)流速為1.0、1.5 mL/min時，吸附量也比較高，分別為63.92、62.97 mg，吸附效率分別達(dá)到88.8%、87.5%，綜合考慮選擇1.5 mL/min流速為上樣流速。

圖2 上樣流速對大孔樹脂吸附量的影響

2.3.2 上樣濃度對大孔樹脂吸附量的影響 由圖3可以看出，當(dāng)上樣濃度為1.0 mg/mL時，大孔樹脂對樣液中原花青素的吸附量為64.90 mg；隨著上樣濃度的升高，吸附量呈上升趨勢，當(dāng)上樣濃度達(dá)到6.0 mg/mL時，吸附量達(dá)到最高值311.86 mg，隨后急劇下降至7.0 mg/mL時的135.22 mg。上樣濃度較低時，隨著濃度的增加，原花青素分子與大孔樹脂接觸面增加，快速進(jìn)入大孔樹脂內(nèi)部并迅速擴(kuò)散，吸附量增大。當(dāng)濃度增加至一定程度時，一方面原花青素分子過多因而降低了每個分子與樹脂的吸附面積，阻礙其進(jìn)入樹脂內(nèi)部，影響了原花青素在大孔樹脂內(nèi)部的擴(kuò)散；另一方面，濃度的增加導(dǎo)致樣液中雜質(zhì)與原花青素的競爭吸附增加，使大孔樹脂的吸附量下降。綜上，選擇6.0 mg/mL為上樣濃度。這與前人[29，36-42]在一定范圍內(nèi)上樣濃度與吸附量正相關(guān)的研究結(jié)果一致。

圖3 上樣濃度對大孔樹脂吸附量的影響

2.3.3 純水用量對大孔樹脂解析率的影響 由圖4可以看出，隨著純水用量的增加，流出液的濃度降低，說明隨著純水用量的增加，大孔樹脂上沒有被吸附的雜質(zhì)和原花青素逐漸被洗下來，當(dāng)純水用量達(dá)到110 mL時被充分洗掉，流出液濃度為零。所以，選擇純水用量為110 mL。

圖4 純水用量對大孔樹脂解析率的影響

2.4 不同濃度乙醇提取物的抗氧化性

由表2可以看出，3種不同濃度乙醇溶液洗脫提取物的抗氧化活性相差不大，對羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子的清除能力分別為50%～53%、40%～44%、13%～14%。相比之下，40%乙醇洗脫物的羥自由基清除能力稍強(qiáng)一些，60%乙醇洗脫物的DPPH自由基和超氧陰離子清除能力稍強(qiáng)一些。從不同品種花生紅衣中提取的原花青素抗氧化性相差很大[43]。本試驗結(jié)果表明不同濃度乙醇洗脫的同品種同批次花生紅衣的原花青素抗氧化性相似。

表2 不同濃度乙醇溶液洗脫提取物的抗氧化活性測定結(jié)果 (%)

3 結(jié)論

本試驗開展了8種大孔樹脂的靜態(tài)吸附試驗和動態(tài)解析試驗，篩選出了分離原花青素的較適樹脂LX-32，其最佳吸附工藝條件為:上樣流速為1.5 mL/min，樣品濃度為6.0 mg/mL。采用20%、40%、60%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫提取試驗，3種洗脫提取物中原花青素的抗氧化活性相差不大，對羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子的清除能力分別為50%～53%、40%～44%、13%～14%。