趙澤廣，李杰峰，張 寧，楊 威， 趙志強，孫艷玲，徐志媛，李 琴

（1.河北工程大學 生命科學與食品工程學院 056038；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所 071000；3.河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 071000）

金黃色葡萄球菌是自然界中常見的一種致病菌，無芽孢﹑鞭毛，大多數(shù)無莢膜，革蘭氏染色陽性，可以引起嚴重感染[1-2]。近年來，金黃色葡萄球菌污染問題已經(jīng)成為了世界范圍內(nèi)影響公共衛(wèi)生與人類和動物健康的重大問題。歐盟一些國家中由金黃色葡萄球菌引起的細菌性食物中毒事件占食源性疾病事件的5%[3-4]。我國金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居第4位。隨著抗生素種類越來越多，使用越來越頻繁，金黃色葡萄球菌的耐藥性越來越嚴重。蔡霞[5]等人對2018年7月～2021年3月淮南市某教學醫(yī)院金黃色葡萄球菌臨床分布及耐藥性分析，結果顯示在160株金黃色葡萄球菌中有69株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）。洪小蘭[6]等在中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第910醫(yī)院2015年～2019年臨床標本分離的1750株金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)728株MRSA。

生鮮肉在動物屠宰﹑運輸﹑儲存和售賣過程中，由于操作﹑溫度﹑環(huán)境等問題，金黃色葡萄球菌污染也很常見。闞浩鵬[7]等人在濟南各類型市場的180份市售生雞肉中檢測到55株金黃色葡萄球菌。田璐[8]等人以中國知網(wǎng)2000年～2019年文獻為基礎統(tǒng)計了生鮮肉微生物污染情況，結果顯示我國金黃色葡萄球菌在生鮮肉中檢出率為10.81%。

耐藥基因cfr是能夠介導噁唑烷酮類藥物﹑林可酰胺類藥物﹑截短側耳素類藥物﹑氯霉素類藥物以及鏈陽菌素A這五大類抗菌藥同時耐藥的多重耐藥基因[9]。由于cfr可介導惡唑烷酮類藥物—治療耐藥陽性菌最后一道防線，其已經(jīng)成為抗生素治療的嚴重威脅[10]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 肉樣

2022年采集的保定市售生鮮肉23份，其中豬肉8份，羊肉﹑牛肉4份，雞肉7份。

1.1.2 主要試劑

營養(yǎng)肉湯﹑7.5%氯化鈉肉湯﹑血平板﹑Baird-Parker瓊脂基礎﹑亞締酸鹽卵黃增菌液﹑凍干兔血漿均購自青島海博生物技術有限公司；比濁管購自比克曼生物科技有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；快速基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；M5 DL2000 DNA Maker﹑M5 DNA電泳用瓊脂糖﹑2× M5 HiPer HiFi PCR mix均購自北京聚合美生物科技有限公司；TSA（TSB與瓊脂糖比例為4:3）瓊脂為試驗室配制。

1.2 方法

1.2.1 肉樣處理 無菌采集適量肉樣于1.5mL離心管中并加入200μL生理鹽水，使用組織研磨器將其研磨至勻漿，再加入500μL生理鹽水，振蕩混勻，8000r/min離心5min。

1.2.2 細菌培養(yǎng) 取上清液接種于7.5%氯化鈉肉湯中。37℃培養(yǎng)24h。

1.2.3 細菌分離 將培養(yǎng)的菌液接種于Baird-Parker平板上，37℃培養(yǎng)24h。挑取圓形﹑表面光滑﹑凸起﹑濕潤﹑大小為2mm～3mm的具有光澤的灰黑色或黑色并伴有淺色邊緣和不透明圈（沉淀）的菌落進行革蘭氏染色，鏡檢記錄菌體特征，挑選革蘭氏陽性﹑成葡萄串狀排列的球菌接種于血平板，培養(yǎng)24h。挑取圓形﹑光滑﹑凸起﹑金黃色（白色）﹑具有β溶血特征的菌落凍存，以備后續(xù)試驗。

1.2.4 生化試驗 將凍存的菌株復蘇后接種于營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)物和無菌生理鹽水分別接種于細菌微量生化鑒定管中，37℃培養(yǎng)24～72 h，觀察記錄結果。

1.2.5 血漿凝固酶試驗 取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物0.5mL于凍干兔血漿，輕輕震蕩混勻，37℃培養(yǎng)，每半個小時觀察一次，觀察6 h，凝固則為金黃色葡萄球菌陽性。

1.2.6 藥敏試驗 將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物濃度調(diào)至1.5×108CFU/mL，根據(jù)2021年美國臨床和試驗室標準化委員會標準（CLSI）進行種抗生素藥敏試驗，判讀結果。

1.2.7 耐藥基因檢測 參照文獻合成引物[11-13]（cfr﹑tetM﹑tetO﹑mecA﹑ermA﹑vanA﹑vanB），用分離菌培養(yǎng)菌液提取DNA進行耐藥基因PCR擴增，擴增程序：95℃ 5 min，（94℃1 min，Tm 1 min，72℃ 1 min）×35循環(huán)，72℃終延伸10 min。擴增產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

表1 金黃色葡萄球菌耐藥基因引物序列

2 結果

2.1 細菌的分離培養(yǎng)

采集保定市售生鮮肉23份，進行金黃色葡萄球菌分離鑒定，結果顯示有1株從雞肉中分離的細菌表現(xiàn)出金黃色葡萄球菌典型特征。分離菌在Baird-Parker平板上長勢良好（圖1），表面凸起，光滑濕潤，具有光澤，顏色黑色，同時伴有淺色邊緣和不透明光圈。血平板培養(yǎng)基上菌落較大，表面光滑，白色，凸起并伴有β溶血環(huán)。挑取單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢（圖2），結果顯示該分離菌呈葡萄串狀或鏈狀排列的圓形球菌。

圖1 分離菌菌落特征

圖2 分離菌革蘭氏染色

2.2 生化試驗結果

分離菌可分解葡萄糖﹑麥芽糖﹑乳糖﹑蔗糖﹑精氨酸﹑尿素﹑淀粉，甲基紅反應陽性，V-P試驗陽性，液化明膠，可在高鹽肉湯中生長。

表2 生化試驗結果

2.3 藥敏試驗結果

藥敏結果顯示（表3），該菌只對萬古霉素﹑利奈唑胺敏感，對頭孢曲松鈉﹑左氧氟沙星﹑卡那霉素中介，對頭孢噻肟﹑氨芐西林﹑四環(huán)素﹑林可霉素﹑阿奇霉素﹑環(huán)丙沙星耐藥，表現(xiàn)出多重耐藥。

表3 藥敏試驗結果

2.4 耐藥基因檢測結果

2.4.1 耐藥基因cfr檢測結果 耐藥基因cfr檢測結果顯示為陽性（圖3），目的條帶為746 bp。

圖3 cfr耐藥基因檢測結果

2.4.2 其他耐藥基因檢測結果 （圖4）顯示，該菌株攜帶耐藥基因tetM，其目的條帶為406 bp。

圖4 耐藥基因檢測結果

3 討論

隨著我國社會的發(fā)展，食品安全已經(jīng)成為了社會關注度較高的問題，金黃色葡萄球菌作為食品中第二大致病菌[14]，對其監(jiān)測尤為重要。周勇[15]等對2009年～2018年廣州市即食食品中金黃色葡萄球菌進行檢測，從1399份食品中分離出157份陽性菌株，分離率為11.22%。2015年秦磊[16]等人對唐山市10個縣區(qū)不同場所的217份食品進行金黃色葡萄球菌檢測，陽性率為15.2%。

近年來，國內(nèi)外對金黃色葡萄球菌耐藥性的研究越來越多，但是對攜帶cfr耐藥基因的金黃色葡萄球菌研究較少，這可能因為cfr耐藥基因檢出率較低。

多數(shù)抗生素通過與細菌核糖體結合，抑制細菌蛋白質(zhì)合成來達到抑菌效果[17]。但是，多重耐藥基因cfr通過編碼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，對23S核糖體RNA的2503位嘌呤殘基進行修飾，從而降低抗生素與細菌核糖體的肽基轉(zhuǎn)移酶中心的親和力，導致細菌對某些抗生素產(chǎn)生耐藥性[18]。另外，cfr基因是迄今為止唯一由包括質(zhì)粒在內(nèi)的可移動元件介導的惡唑烷酮類耐藥基因[19]，然而惡唑烷酮類抗生素利奈唑胺作為臨床上治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌﹑耐萬古霉素腸球菌和耐青霉素肺炎球菌最后一道防線[20]，cfr基因可以使細菌對其產(chǎn)生耐藥性。因此，攜帶cfr耐藥基因的細菌傳播對公共衛(wèi)生安全形成了巨大隱患。cfr 多重耐藥基因陸續(xù)在包括動物源和人源的葡萄球菌﹑腸球菌﹑巨型球菌﹑大腸埃希氏菌和變形桿菌等革蘭氏陽性和陰性菌株中均有報道[21-24]。尤其是在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌中更為常見[18]，且攜帶cfr的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌臨床治療的難度更大[25]。

本研究從保定市售生鮮肉中分離到一株攜帶cfr耐藥基因的金黃色葡萄球菌，但是mecA基因檢測結果為陰性，證明該菌不是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。分離菌對6種抗生素表現(xiàn)為耐藥，3種抗生素表現(xiàn)為中介，出現(xiàn)了多重耐藥的情況，但是萬幸的是該菌對萬古霉素和利奈唑胺敏感。其他耐藥基因檢測結果顯示，分離菌攜帶有tetM耐藥基因，藥敏試驗中分離菌對四環(huán)素表現(xiàn)出耐藥，耐藥表型與耐藥基因檢測結果一致。

4 結論

本試驗從保定市售生鮮肉中分離得到了一株攜帶cfr耐藥基因的金黃色葡萄球菌，具有嚴重的多重耐藥性，且同時攜帶tetM耐藥基因，本株多重耐藥金黃色葡萄球菌對生鮮肉市場公共衛(wèi)生安全具有一定風險。