孫 偉 劉杉杉 陸安法 羅 杰 高俊波 何思雨 （銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，銅仁 554300）

程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death， PCD）在宿主生長(zhǎng)發(fā)育以及抵抗外界因素干擾的過(guò)程中起重要的作用［1］。常見的PCD包括細(xì)胞凋亡、壞死、焦亡、鐵死亡、自噬和效應(yīng)性細(xì)胞死亡等多種類型。其中，對(duì)于細(xì)胞凋亡的研究最為明確。然而，目前對(duì)細(xì)胞焦亡的研究尚處于起步階段，有待于更加廣泛和深入的研究［2］。細(xì)胞焦亡又被稱為炎癥細(xì)胞壞死，是一種新發(fā)現(xiàn)的PCD，主要以細(xì)胞腫脹、胞膜破裂、炎癥因子和細(xì)胞內(nèi)容物釋放為主要特征。細(xì)胞發(fā)生焦亡后，在致炎因子的刺激下，細(xì)胞會(huì)釋放大量的促炎因子IL-1β和IL-18［3］。肝臟作為機(jī)體內(nèi)最大的實(shí)質(zhì)器官，具有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、能量供應(yīng)、維持新陳代謝、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育以及免疫調(diào)節(jié)等多種功能［4］。肝臟獨(dú)特的功能和解剖位置，使其對(duì)外源性物質(zhì)高度敏感，因此成為各種有毒有害物質(zhì)作用的靶點(diǎn)。病毒性肝炎、酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）、非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）以及中毒性肝病等多種肝臟疾病與細(xì)胞焦亡密切相關(guān)。本文主要對(duì)細(xì)胞焦亡激活的機(jī)制和細(xì)胞焦亡在肝臟相關(guān)疾病的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為研究細(xì)胞焦亡在肝損傷致病機(jī)理的作用提供一定的參考。

1 細(xì)胞焦亡激活的機(jī)制

1.1 經(jīng)典途徑 在經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑中，主要依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）激活，炎癥小體起重要作用。炎癥體是一組蛋白質(zhì)復(fù)合物，可被多種損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns， DAMPs）和病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）所識(shí)別，控制IL-1β和IL-18等促炎細(xì)胞因子的生成［5］。不同的炎癥小體所感知的內(nèi)外界刺激信號(hào)有所差異，但在各種因素的作用下具有招募并激活Caspase-1的作用［6］。黑色素瘤缺乏因子-2（absent in melanoma 2，AIM-2）和NLRC4識(shí)別具有特異性，分別與雙鏈DNA和菌體特異性蛋白相結(jié)合［7-8］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）是由NLRP3、ASC和pro-Caspase-1三部分所組成，是目前研究最透徹的炎癥小體［9］。NLRP3可被細(xì)菌、病毒、DAMPs、穿孔素等多種因素激活［10-11］。NLRP1可以感知細(xì)菌細(xì)胞壁的組成部分胞壁酰二肽，在抵抗細(xì)菌感染中發(fā)揮作用［12］。

研究表明，Gasdermin家族蛋白D（GSDMD）是調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵底物［13］。經(jīng)炎癥小體活化后的Caspase-1可將GSDMD裂解成22 kD和31 kD大小并具有活性的N端與C端片段，GSDMD-N可裂解細(xì)胞膜上含有磷脂酰肌醇/心磷脂的脂質(zhì)體，在細(xì)胞膜上進(jìn)行“打孔”［14］。同時(shí)，Caspase-1可完成對(duì)pro-IL-1β和pro-IL-18前體物質(zhì)切割、成熟，形成具有活性的促炎因子IL-1β和IL-18。IL-1β和IL-18可穿過(guò)GSDMD-N在胞膜上形成的“孔道”分泌到細(xì)胞外，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。NLRP1炎癥小體同樣具有激活經(jīng)典細(xì)胞焦亡路徑的作用，但GSDMD蛋白是否參與了NLRP1炎癥小體依賴的經(jīng)典細(xì)胞焦亡路徑尚不明確。

1.2 非經(jīng)典路徑 在非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑中， 細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可直接與Capase-4/5/11結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡（圖1）?；罨蟮腃aspase-4/5/11在將GSDMD裂解成N、C兩個(gè)片段的同時(shí)，可通過(guò)與NLRP3炎癥小體結(jié)合，進(jìn)一步活化下游因子Caspase-1，最終將成熟的IL-1β分泌到細(xì)胞外。此外，Pannexin-1通道蛋白可在Caspase-4/5/11作用下，打開P2X7細(xì)胞膜通道并釋放ATP，在細(xì)胞膜上形成“孔洞”，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡。Pannexin-1通道蛋白激活后，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)K+離子釋放，進(jìn)而激活NLRP3炎癥小體，同樣具有促進(jìn)IL-1β分泌的效應(yīng)［16］。無(wú)論是經(jīng)典途徑還是非經(jīng)典途徑，GSDMD蛋白的裂解都起到了十分關(guān)鍵的作用［17］。

圖1 細(xì)胞焦亡激活的模式圖［15］Fig.1 Patterns map of pyroptosis activation［15］

1.3 其他引起細(xì)胞焦亡激活的因子 最新研究表明，Gasdermin家族蛋白E（GSDME）同樣具有介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的作用［18］。與GSDMD不同的是，GSDME可被細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因子Caspase-3在特異位點(diǎn)進(jìn)行切割，切割后的GSDME-N片段同樣具有穿透細(xì)胞膜的功能。Caspase-3在腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor，TNF-α）的作用下激活，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。然而，如果該細(xì)胞可表達(dá)GSDME蛋白，那么細(xì)胞死亡方式會(huì)迅速轉(zhuǎn)向焦亡，甚至直接發(fā)生焦亡。在細(xì)胞中添加Caspase抑制劑或者將GSDME基因敲除和（或）降低，均會(huì)阻止細(xì)胞焦亡的發(fā)生。體內(nèi)試驗(yàn)表現(xiàn)出相同的效果，化療藥物對(duì)GSDME基因敲除小鼠所產(chǎn)生的副作用會(huì)明顯降低［19］。通常認(rèn)為，Caspase-3是細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要標(biāo)志物之一，這一發(fā)現(xiàn)將細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡兩種不同的PCD聯(lián)系在一起，對(duì)進(jìn)一步探討細(xì)胞焦亡的發(fā)生機(jī)制具有重要作用。

2 細(xì)胞焦亡在肝臟損傷中的作用研究

細(xì)胞焦亡的發(fā)生有助于機(jī)體及時(shí)清除受損傷的細(xì)胞，然而過(guò)度的細(xì)胞焦亡可引起大量細(xì)胞死亡，造成嚴(yán)重的組織損傷，甚至?xí)?dǎo)致器官衰竭，與多種疾病的發(fā)生緊密關(guān)聯(lián)［20］。由于機(jī)體內(nèi)“肝-腸軸”的存在，菌群失調(diào)后腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)物會(huì)進(jìn)入肝臟，因此LPS是導(dǎo)致肝細(xì)胞焦亡發(fā)生的重要因素［21］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡與病毒性肝炎、ALD、 NAFLD以及肝臟中毒等多種肝臟疾病有關(guān)，在肝臟損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用［22］。因此，研究肝損傷過(guò)程中細(xì)胞焦亡發(fā)生的分子機(jī)制，對(duì)于闡明肝臟疾病發(fā)生的機(jī)制，尋找相關(guān)疾病的治療方案具有積極作用。

2.1 細(xì)胞焦亡與病毒性肝炎的關(guān)系 機(jī)體內(nèi)細(xì)胞焦亡與免疫調(diào)節(jié)之間的關(guān)系受到嚴(yán)格調(diào)控。然而，細(xì)胞過(guò)度發(fā)生焦亡會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，引起大量細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致嚴(yán)重疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）可通過(guò)Caspase-1和Caspase-3兩種信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡。HCV感染細(xì)胞及周圍細(xì)胞出現(xiàn)Caspase-1上調(diào)表達(dá)，這與HCV的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。HCV RNA可直接誘導(dǎo)感染肝細(xì)胞內(nèi)NLRP3組裝和活化［23］。NLRP3激活后分泌的IL-18可刺激NK細(xì)胞合成IFN-γ，從而抑制HCV復(fù)制［24］。從發(fā)生焦亡的細(xì)胞中釋放出的DAMPs具有募集免疫細(xì)胞的功能，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［25］?，F(xiàn)已證實(shí)，NLRP3激活后，肝臟枯否細(xì)胞分泌的IL-1β是HCV患者炎癥出現(xiàn)放大反應(yīng)的來(lái)源。慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染可導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化、肝功能衰竭以及肝癌［26］。HBV核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）參與細(xì)胞焦亡的發(fā)生。經(jīng)HBcAg治療的HBV患者外周血單核細(xì)胞IL-18的分泌顯著增加，而Caspase-1抑制劑可完全阻斷IL-18分泌。這與HBeAg陽(yáng)性患者外周血單核細(xì)胞IL-18分泌量降低的報(bào)道基本一致［27］。YU等［28］發(fā)現(xiàn)，HBV通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）依賴的信號(hào)途徑，從而抑制NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)，同時(shí)能夠抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成。ROS作為細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)通路，應(yīng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化起到重要作用［29］。ROS過(guò)度生成會(huì)破壞與抗氧化物質(zhì)之間的平衡，最終導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，進(jìn)而造成細(xì)胞和組織損傷［30］。ROS水平的增加可促進(jìn)炎癥小體和NF-κB等炎癥相關(guān)信號(hào)因子的釋放［31］。除了病毒性肝炎外，Caspase-1依賴的細(xì)胞焦亡途徑也參與自身免疫性肝炎中。研究發(fā)現(xiàn)，人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑（rhIL-1Ra）可通過(guò)抑制NLRP3誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡信號(hào)通路，起到抑制肝臟炎癥發(fā)生的作用［32］。從細(xì)胞焦亡參與病毒性肝炎致病機(jī)理的角度出發(fā)，有望尋找出新的治療病毒性肝炎的有效措施。

2.2 細(xì)胞焦亡與ALD的關(guān)系 ALD是指由于酒精的大量攝入而造成的與肝損傷密切相關(guān)的一系列疾病。酒精過(guò)量攝入造成的ALD，與細(xì)胞焦亡等在內(nèi)的各種PCD密切相關(guān)。臨床上，ALD一般包括脂肪變性、纖維化、酒精性肝炎（alcoholic hepatitis，AH）、肝硬化和肝細(xì)胞癌［33］。先天性免疫細(xì)胞的激活、全身性炎癥的發(fā)生是ALD發(fā)病的主要因素。

RNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，Caspase-11/4激活后，活化的GSDMD可通過(guò)Caspase-11/4-GSDMD信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生，這可能是AH發(fā)病的機(jī)制之一［34］。有意思的是，在AH模型小鼠中，Caspase-1并未被激活，這有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，采用抑制CCR2/5信號(hào)通路的藥物，可有效降低GSDMD裂解，有效緩解酒精對(duì)肝臟的損傷［34］。FU等［35］發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制細(xì)胞焦亡的發(fā)生可緩解AH患者的臨床癥狀，并降低患病率。

ATP和可溶性尿酸等物質(zhì)作為DAMP，可在酒精的作用下，從受損傷的原代肝細(xì)胞中釋放出來(lái)，并觸發(fā)炎癥小體依賴的炎癥因子的釋放［36-37］。細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，具有刺激和維持ALD的炎癥反應(yīng)循環(huán)狀態(tài)的作用。此外，殘留在肝細(xì)胞中的酒精代謝物也會(huì)促進(jìn)ROS生成，導(dǎo)致線粒體功能發(fā)生障礙，從而增加肝細(xì)胞對(duì)炎癥細(xì)胞因子的敏感性［38］。從以上研究可知，降低或是抑制細(xì)胞焦亡的發(fā)生，對(duì)于緩解或治療ALD具有一定的積極作用。

2.3 細(xì)胞焦亡與NAFLD的關(guān)系 NAFLD是指在沒有大量攝入酒精、藥物或存在其他導(dǎo)致肝脂肪變性因素的情況下，脂質(zhì)在肝臟組織內(nèi)積聚而誘發(fā)的炎癥脂肪性肝病，是一種與胰島素功能紊亂、遺傳關(guān)系緊密的代謝性肝損傷。NAFLD覆蓋了從單純性脂肪變性到脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）等廣泛的范圍，NASH可能導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)纖維化，進(jìn)一步發(fā)展成為肝硬化，并增加罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)［39］。

NAFLD小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，骨髓源細(xì)胞和肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中Caspase被激活，并逐漸出現(xiàn)炎癥反應(yīng)和纖維化等病理變化［40］。其發(fā)病機(jī)理可能是肝細(xì)胞和免疫細(xì)胞釋放的脂肪酸和DAMP以及尿酸激活了NLRP3炎癥小體。研究表明，ROS對(duì)發(fā)生脂肪變性的肝細(xì)胞具有致命性損傷［41］。肝細(xì)胞受損后，線粒體結(jié)構(gòu)完整性被破壞，會(huì)釋放出DNA、ROS和ATP等DAMPs，并可直接或間接與硫氧還蛋白結(jié)合蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）和P2X嘌呤受體7結(jié)合，從而激活NLRP3炎癥小體［42-43］。單純發(fā)生脂肪變性的動(dòng)物很難觀察到活化的NLRP3，然而卻在NAFLD/NASH動(dòng)物和人類模型多次得到證實(shí)［44］。越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞焦亡已經(jīng)成為聯(lián)系脂肪變性和NASH的紐帶［45］。細(xì)胞焦亡釋放的IL-1β對(duì)其他炎癥細(xì)胞因子的分泌具有級(jí)聯(lián)放大的效應(yīng)，IL-1β信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致肝臟發(fā)生炎癥、脂肪變性和纖維化等病變的關(guān)鍵分子，在NAFLD發(fā)病機(jī)制中起到重要作用［46］。然而，與細(xì)胞焦亡相關(guān)的另一種炎癥細(xì)胞因子IL-18在NAFLD/NASH疾病發(fā)展中起到了相反的作用。IL-18基因敲除后的小鼠肝臟中的糖異生基因表達(dá)水平明顯較高，更易患肥胖癥、貪食癥并對(duì)胰島素具有一定的抵抗作用［47］。細(xì)胞焦亡與NAFLD/NASH損傷的關(guān)系，還有待于進(jìn)一步研究。

2.4 細(xì)胞焦亡與中毒性肝損傷的關(guān)系 短期攝入低濃度的有毒有害物質(zhì)一般不會(huì)對(duì)機(jī)體造成明顯的損傷。然而，有毒有害物質(zhì)長(zhǎng)期攝入或者藥物的過(guò)量使用都會(huì)引發(fā)肝臟損傷，甚至?xí)斐杉毙愿嗡ソ撸╝cute liver failure，ALF）。

臨床上，對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）的過(guò)量服用是ALF最常見的誘因之一。ALF主要以大量肝細(xì)胞功能紊亂為主要特征，從而引起嚴(yán)重的肝損傷［48］。APAP可通過(guò)線粒體氧化應(yīng)激、核DNA斷裂和線粒體通透性轉(zhuǎn)變直接損傷肝細(xì)胞［49］。研究還發(fā)現(xiàn)，APAP誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡后，釋放的ATP和NAD在激活P2X7分子后，會(huì)觸發(fā)NLRP3炎癥小體，最終造成肝損傷［50］。因此，DAMPs介導(dǎo)的先天性免疫信號(hào)炎癥反應(yīng)，激發(fā)了APAP誘導(dǎo)的肝毒性［51］。Cu是體內(nèi)必需的微量元素，然而過(guò)量攝入后會(huì)造成多個(gè)器官損傷。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期暴露在Cu作用下的雞源性肝細(xì)胞，細(xì)胞存活率會(huì)顯著下降，且Caspase-1、IL-1β、IL-18和NLRP3等細(xì)胞焦亡相關(guān)因子表達(dá)水平顯著上調(diào)［52］。因此推斷Cu可能誘導(dǎo)了肝臟細(xì)胞焦亡的發(fā)生。苯并芘（α）是世界公認(rèn)的致癌物，且分布廣泛。肝臟是苯并芘（α）代謝的主要場(chǎng)所。研究發(fā)現(xiàn)，苯并芘（α）可導(dǎo)致多種炎癥因子的分泌，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。劉俊義［53］以HL-7702肝細(xì)胞為研究對(duì)象，結(jié)果顯示苯并芘（α）可誘導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡，這可能是造成肝中毒損傷的重要機(jī)制之一。肝中毒性損傷時(shí)有發(fā)生，細(xì)胞焦亡為緩解肝毒性損傷提供了新的研究角度。

3 小結(jié)與展望

細(xì)胞焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的PCD，與肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)。然而，細(xì)胞焦亡是如何引起肝臟損害以及細(xì)胞焦亡在肝臟疾病發(fā)生過(guò)程中起到怎樣的作用？這些問(wèn)題還有待于進(jìn)一步研究和闡述。細(xì)胞發(fā)生焦亡后，釋放的炎癥因子不僅可以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)致病因子的抵抗力，還可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生從而抑制肝細(xì)胞的增殖和遷移。然而，過(guò)度的細(xì)胞焦亡發(fā)生會(huì)加重炎癥反應(yīng)的生成，造成肝臟損傷，甚至?xí)鸶卫w維化和癌變。因此，探討細(xì)胞焦亡與肝臟損傷的關(guān)系，可為肝病的防治提供新的思路和方法。