王洋洋，徐曉龍，宋成君，咸婉婷，劉繼江

(中國(guó)電子科技集團(tuán)公司第四十九研究所，黑龍江 哈爾濱 150028)

0 引 言

乳酸是血液中的葡萄糖或糖原在無氧或缺氧條件下生成的一種代謝物[1]。當(dāng)人體進(jìn)行劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，體內(nèi)就會(huì)生成大量的乳酸，來不及分解的乳酸堆積在體內(nèi)會(huì)對(duì)人體造成傷害[2,3]。同時(shí)，對(duì)乳酸進(jìn)行監(jiān)測(cè)可以反映人體的疲勞程度，通過監(jiān)測(cè)乳酸含量能夠監(jiān)控運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)量及新陳代謝狀況，從而對(duì)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整，使得訓(xùn)練方式變得更為有效[4，5]。因此，乳酸的檢測(cè)在醫(yī)療、體育運(yùn)動(dòng)等領(lǐng)域具有重要意義。

乳酸的檢測(cè)方法主要通過血液進(jìn)行有創(chuàng)的取樣，使用設(shè)備分析表明，這種方法的缺點(diǎn)一是有創(chuàng)，二是無法進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。因汗液中含有乳酸等生理代謝產(chǎn)物[6]，且汗液可實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)采集，易于對(duì)人體生理信息進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，是新一代可穿戴健康監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的重要發(fā)展方向[7，8]。美國(guó)德克薩斯大學(xué)的Lin K C等人已經(jīng)基于氧化石墨烯設(shè)計(jì)并制作了一種微型化的汗液乳酸傳感器，檢測(cè)限為2.7 μmol/L，具有良好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性[9]。同時(shí)，國(guó)外也有大量汗液乳酸檢測(cè)傳感器推向健康檢測(cè)產(chǎn)品市場(chǎng)，而目前，國(guó)內(nèi)汗液乳酸傳感器尚在實(shí)驗(yàn)室階段，無成熟產(chǎn)品問世[10]。

本文制備了針對(duì)汗液中乳酸的柔性可穿戴生理信息傳感器，采用生物電化學(xué)原理，通過柔性敏感單元與柔性電路的設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了傳感器的可穿戴，為未來與智能腕帶集成提供了技術(shù)儲(chǔ)備。

1 原理與實(shí)驗(yàn)

1.1 檢測(cè)原理

汗液中的乳酸的檢測(cè)采用生物催化原理。生物電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?，是由生物酶膜和電化學(xué)電極組合而成的生物電流型傳感器。因酶具有分子識(shí)別，并具有特殊三維空間構(gòu)象的功能化蛋白質(zhì)，對(duì)基底物具有特異性催化能力，因此，酶?jìng)鞲衅骺梢詫?shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品的選擇性分析。本文制備了介體型酶生物電極。采用這種方法制備的生物分子傳感器，輸出穩(wěn)定較好，酶不易失活。

介體型酶電極含有電子媒介體的化學(xué)修飾層和酶膜層，電子媒介體具有良好的電催化活性，在催化還原過程中，首先與還原性的酶反應(yīng)，然后擴(kuò)散到金(Au)電極表面并進(jìn)行電子交換。這種電極的優(yōu)勢(shì)是不依賴于溶解氧、靈敏度高、消除其他電活性物質(zhì)在檢測(cè)過程中對(duì)LOX干擾。電子媒介體能夠促進(jìn)電子傳遞過程，減小噪聲、背景電流和干擾信號(hào)。本文采用的電子媒介體為鐵氰化物。

具體反應(yīng)過程如下：

酶層：LOX(ox)+乳酸 →丙酮酸 + LOX(red)

修飾層：LOX(red)+ M(ox)→LOX+M(red)

電極：M(red)→M(ox)+ ne-

式中 LOX(ox)：乳酸氧化酶(氧化態(tài)),M(ox)：鐵氰化物(氧化態(tài)),LOX(red)：乳酸氧化酶(還原態(tài))，M(red)：鐵氰化物(還原態(tài))。

檢測(cè)單元結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)如圖1。

圖1 乳酸傳感器結(jié)構(gòu)示意

1.2 傳感器的制備

1)柔性電極的設(shè)計(jì)和制作

實(shí)驗(yàn)在聚酰亞胺(PI)襯底上制備了柔性Au電極用于電信號(hào)的檢出。制備過程如圖2。a.刻蝕凹槽：采用PI作為柔性傳感器的基底材料，刻蝕凹槽用于制作反應(yīng)單元，后續(xù)在凹槽內(nèi)沉積Au電極及制備敏感層。具體：在PI上蒸鍍鋁膜作為掩模，光刻后出所需圖形，再通過干法刻蝕完成凹槽制作，深度控制在20～30 μm。b.柔性Au電極制作：采用蒸發(fā)的方法制備了柔性Au電極，在掩模的保護(hù)下將Au通過熱蒸發(fā)沉積在PI上，厚度約(3 000～5 000)×0.1 nm，形成均勻的金屬薄膜。c.在金電極上制備功能性敏感膜層，完成柔性可穿戴汗液乳酸傳感器敏感單元制作。

圖2 柔性電極制備過程

2)介體層和敏感膜的制作

采用電化學(xué)沉積的方法在柔性Au電極上沉積介體層，然后在介體層上滴加敏感酶溶液，經(jīng)低溫干燥固化得到敏感酶生物電極。使用電化學(xué)工作站，在含有3 mmol/L FeCl3,50 mmol/L KCl,3 mmol/L K3Fe(CN)6,50 mmol/L HCl的溶液中，采用循環(huán)伏安法掃描周期10周，掃描速率為50 mV·s-1，掃描電壓為-0.5～0.6 V，將鐵氰化物介體層沉積到Au電極上。介體層的作用是參與酶促反應(yīng)，提高傳感器的穩(wěn)定性。

乳酸敏感膜的制備具體過程為：將添加了乳酸氧化酶/碳納米管/殼聚糖溶液滴加到鐵氰化物/Au電極上(乳酸氧化酶40 g·L-1)，在4 ℃環(huán)境中無光照干燥，實(shí)驗(yàn)討論了酶的用量。本文為了提高傳感器測(cè)試準(zhǔn)確性，制作了多路乳酸敏感生物酶膜電極，檢測(cè)數(shù)據(jù)取平均值，傳感器以Ag/AgCl為參比電極，Au電極為對(duì)電極,如圖3所示。

圖3 汗液乳酸傳感器

1.3 傳感器性能測(cè)試

采用美國(guó)FEI公司INSPECT—S50型掃描電子顯微鏡對(duì)鐵氰化物介體層的微觀表面形貌(SEM)進(jìn)行分析測(cè)試。

使用瑞士萬通公司生產(chǎn)的AutoLab302N電化學(xué)工作站，采用計(jì)時(shí)電流法考察乳酸傳感器的濃度—輸出電流曲線，對(duì)傳感器線性、靈敏度進(jìn)行考察。

2 結(jié)果與討論

2.1 微觀形貌分析

圖4為鐵氰化物介體層表面的微觀形貌。電沉積的介體層表面疏松，分布較多的孔隙，具有大的比表面積，提高敏感材料與乳酸的接觸面積，降低傳感器的檢測(cè)下限，提高傳感器靈敏度。實(shí)驗(yàn)表明：在柔性Au電極上沉積鐵氰化物介體層與基底Au電極具有良好的結(jié)合力和優(yōu)異的電化學(xué)性能。

圖4 鐵氰化物介體層表面形貌分析

2.2 乳酸氧化酶用量對(duì)傳感器性能影響分析

實(shí)驗(yàn)對(duì)乳酸氧化酶的用量進(jìn)行了優(yōu)化，在化學(xué)修飾電極表面分別滴涂0，0.3，0.6，0.9，1.2 μL乳酸氧化酶(40 g·L-1)溶液，并采用計(jì)時(shí)電流法考察了傳感器在2 mmol/L乳酸溶液中的電流響應(yīng)。如圖5所示，隨著滴加量增加，傳感器對(duì)于乳酸的電流響應(yīng)急劇上升。而當(dāng)酶量從0.6 μL進(jìn)一步增加到1.2 μL，傳感器的電流信號(hào)變化并不大，0.9 μL左右達(dá)到峰值，由于酶用量增大到一定程度時(shí),底物成為限制因素酶促反應(yīng)速率不再增加，因此,選擇酶的用量為0.9 μL。

圖5 乳酸氧化酶用量對(duì)傳感器性能影響

2.3 傳感器輸出特性分析

圖6為傳感器濃度與輸出電流關(guān)系曲線。采用計(jì)時(shí)電流法考察了乳酸生物電極在不同濃度乳酸溶液中的電位響應(yīng)，將選擇性電極分別置于(5～25)mmol/L的乳酸溶液中，如圖分析可知，隨著溶液中乳酸濃度的增加傳感器輸出的電流增大。傳感器在檢測(cè)范圍內(nèi)線性較好，工作曲線方程為y=1.097x-35.87，傳感器線性精度為1.85 %FS，線性相關(guān)系數(shù)為0.960 1。

圖6 傳感器的濃度—輸出電流關(guān)系曲線

2.4 傳感器選擇性分析

乳酸傳感器的抗干擾能力測(cè)試如圖7。從圖中可以看到，5 mmol/L尿素，0.4 mmol/L葡萄糖，0.2 mmol/L尿酸和0.01 mmol/L抗壞血酸產(chǎn)生的干擾信號(hào)與5 mmol/L乳酸產(chǎn)生的電流信號(hào)相比，前者明顯要小得多。說明這些汗液中常見的代謝產(chǎn)物對(duì)乳酸傳感器的影響非常有限，制備的乳酸傳感器具有良好的抗干擾能力。

圖7 傳感器選擇性分析實(shí)驗(yàn)

3 結(jié) 論

本文采用電化學(xué)沉積的方法在柔性Au電極上制備了一種應(yīng)用于汗液中乳酸檢測(cè)的生物電化學(xué)傳感器。實(shí)驗(yàn)在PI柔性襯底上制備了Au電極，采用高分子材料復(fù)合乳酸特異性氧化酶，實(shí)現(xiàn)了乳酸的選擇性檢測(cè)。本文設(shè)計(jì)的傳感器具有柔性可穿戴、選擇性好、檢測(cè)限低、線性好的特點(diǎn)。