李一帆，王 丹，王瑞琳，費(fèi) 冰，劉 瑩，任彥穎，郭夢(mèng)雨，劉心偉，李永偉

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州 450002）

據(jù)2019 年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）統(tǒng)計(jì)，癌癥目前是全球主要死亡原因之一，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也是阻礙人類期望壽命延長(zhǎng)的重要因素[1]。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法如手術(shù)切除易受到腫瘤部位或腫瘤轉(zhuǎn)移的限制，而化療的主要缺點(diǎn)是藥物吸收到正常或腫瘤組織中的不良反應(yīng)以及抗腫瘤藥物耐藥性的出現(xiàn)。因此，以分子靶向治療和免疫治療為代表的精準(zhǔn)治療逐漸成為腫瘤治療的重點(diǎn)。

外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）是由革蘭氏陰性菌釋放的直徑約為20～250nm 的脂質(zhì)雙層囊泡狀結(jié)構(gòu)，含有多種親本菌的成分，包括酶、毒力因子、細(xì)菌特異性抗原和各種病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs），如LPS，脂蛋白、肽聚糖、DNA 和RNA 等[2]。OMVs 含有的細(xì)菌抗原和各種PAMPs 可被宿主模式識(shí)別受體識(shí)別，從而增強(qiáng)細(xì)胞因子和共刺激分子的表達(dá)，促進(jìn)抗原呈遞，有效激活宿主免疫系統(tǒng)，達(dá)到腫瘤免疫治療效果。此外，OMVs 的納米中空結(jié)構(gòu)有利于進(jìn)行工程設(shè)計(jì)，使其作為抗腫瘤藥物的遞送載體，實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療和化療-光療的結(jié)合。鑒于OMVs 在細(xì)菌疫苗、佐劑、腫瘤免疫治療劑、藥物遞送載體中的開發(fā)和應(yīng)用，其被認(rèn)為是抗腫瘤治療的新型手段，具有良好的應(yīng)用前景[3-5]。因此本文綜述OMVs 的結(jié)構(gòu)組分、提取方式、產(chǎn)生機(jī)制以及在抗腫瘤治療中的研究進(jìn)展，為將來(lái)OMVs 的深入研究和臨床抗腫瘤應(yīng)用提供參考。

1 外膜囊泡概述

1.1 外膜囊泡的結(jié)構(gòu)組成 OMVs 是由革蘭氏陰性（G-）菌分泌的直徑約為20～250nm 的球形囊泡狀結(jié)構(gòu)，其由內(nèi)膜（inner membrane，IM）和外膜（outer membrane，OM) 雙層膜組成，中間是肽聚糖層（peptidoglycan，PG）和周質(zhì)空間（periplasmic space），外膜和肽聚糖層通過(guò)膜錨定蛋白（如Lpp,OmpA 和Tol-Pal 復(fù)合物）連接。OMVs 起源于細(xì)菌外膜，含有大量細(xì)菌外膜成分，如磷脂（phospholipid，PL），LPS，OMPs 以及一些來(lái)自IM 和OM 之間的周質(zhì)成分，它們?cè)卺尫胚^(guò)程中被包裹在囊泡腔中[6]。OMVs 包含多種PAMPs，能夠與宿主模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）結(jié)合，從而激活宿主免疫系統(tǒng)，促進(jìn)細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞焦亡[7]。此外，OMVs 還可攜帶大量來(lái)自細(xì)菌的毒素、黏附素等，通過(guò)與宿主細(xì)胞相互作用，對(duì)癌細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，具有內(nèi)在的抗腫瘤活性[8]。由于OMVs 獨(dú)特的中空結(jié)構(gòu)和組成成分，其在革蘭氏陰性菌的感染、微生物-宿主間相互作用及其作為抗菌和抗腫瘤藥物遞送的載體等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的功能。

1.2 外膜囊泡的形成機(jī)制 致病性和非致病性G-菌都會(huì)產(chǎn)生OMVs。目前關(guān)于OMVs 生物發(fā)生的研究成果提出了幾種主要的OMVs 模型。其中外膜曲率增加是被研究報(bào)道最多的一種G-菌OMVs 形成的機(jī)制。在細(xì)菌周質(zhì)空間中，錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)或包膜成分（脂多糖和肽聚糖片段）的局部積累會(huì)對(duì)細(xì)菌外膜產(chǎn)生壓力，導(dǎo)致外膜膨脹，曲率增加并最終以O(shè)MVs 這種小泡的形式釋放出來(lái)[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌喹諾酮信號(hào)分子（Pseudomonas quinolonesignal,PQS），可插入外膜的外小葉來(lái)誘導(dǎo)其曲率增加，促進(jìn)OMVs 形成[10]。

第二種機(jī)制是脂蛋白和肽聚糖交聯(lián)率降低。在大腸埃希菌中，與PG 共價(jià)交聯(lián)的脂蛋白（lipoprotein，Lpp）是一種維持細(xì)菌包膜結(jié)構(gòu)完整性的脂蛋白。有研究對(duì)Lpp-PG 交聯(lián)作用相關(guān)的基因進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)PG 結(jié)構(gòu)和代謝的調(diào)節(jié)可以通過(guò)交聯(lián)Lpp 的水平上下調(diào)節(jié)OMVs 的產(chǎn)生[11]。OmpA 是另一種外膜脂蛋白，與肽聚糖層非共價(jià)結(jié)合。MARCHANT等[12]的研究也表明缺乏OmpA 的傷寒沙門菌突變體表現(xiàn)出OMVs 的產(chǎn)生增加。

磷脂的積累也會(huì)增加OMVs 的產(chǎn)生。最新的研究發(fā)現(xiàn)，VacJ/Yrb 基因沉默或刪除時(shí)會(huì)增加OM 外層小葉中的磷脂數(shù)量，導(dǎo)致富含磷脂的OMVs 從外膜表面分離[13]。此外，噬菌體介導(dǎo)的爆炸性細(xì)胞裂解和抗生素等也會(huì)促使OMVs 產(chǎn)生增加[14-15]。

1.3 外膜囊泡的分離鑒定 OMVs 從細(xì)菌細(xì)胞表面自然分泌，因此位于細(xì)菌培養(yǎng)物的無(wú)細(xì)胞上清液中。目前OMVs 的提取有多種方法，其中超速離心和密度梯度離心是分離和純化OMVs 最常用的方法，被稱為OMVs 分離的“金標(biāo)準(zhǔn)”[16]。超速離心和密度梯度離心的主要原理是根據(jù)培養(yǎng)上清液中不同顆粒的大小和密度設(shè)置不同的離心力，并利用平衡沉降原理完成OMVs 的純化。

當(dāng)前，對(duì)于OMVs 鑒定的三大主流方法分別是從OMVs 的形態(tài)、大小以及組分進(jìn)行表征。透射電子顯微鏡（TEM）觀察OMVs 形態(tài)的方法被認(rèn)為是鑒定OMVs 的“金標(biāo)準(zhǔn)”。納米顆粒跟蹤分析（NTA）被用來(lái)測(cè)量OMVs 的粒徑大小。關(guān)于OMVs 的組分，脂質(zhì)可使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）進(jìn)行鑒定，蛋白質(zhì)組分通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析OMVs 的蛋白質(zhì)譜[17]。

2 OMVs 在抗腫瘤治療中的應(yīng)用

OMVs 是源自革蘭氏陰性菌的天然生物納米材料，由于其納米級(jí)球形囊泡結(jié)構(gòu)，具有輕易穿過(guò)血管、淋巴管和組織的優(yōu)勢(shì)。OMVs 還含有細(xì)菌抗原和病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），可以很容易地與免疫細(xì)胞相互作用或被免疫細(xì)胞攝取，被作為潛在的腫瘤治療的免疫佐劑或腫瘤靶向治療的藥物載體。重要的是，OMVs 可以通過(guò)細(xì)菌的基因工程進(jìn)行功能修飾，從而為作為腫瘤納米疫苗遞送平臺(tái)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.1 腫瘤靶向治療

2.1.1 OMVs 是納米級(jí)脂質(zhì)雙層囊泡結(jié)構(gòu)：OMVs是細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中連續(xù)釋放的20～250nm 的脂質(zhì)雙層囊泡狀結(jié)構(gòu)，其納米級(jí)的大小有助于它們通過(guò)淋巴引流或被吞噬的途徑被抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cells,APCs）攜帶進(jìn)入淋巴結(jié)，通過(guò)激活免疫系統(tǒng)達(dá)到治療腫瘤的作用[18]。此外，OMVs 作為納米顆粒還具有高滲透長(zhǎng)滯留效應(yīng)（EPR），與正常組織相比，其更容易滲透進(jìn)入腫瘤組織并保持在腫瘤中積聚的能力，以誘導(dǎo)局部免疫。如源自大腸埃希菌的OMVs 在小鼠黑色素瘤的治療中，可以廣泛滲透進(jìn)入角質(zhì)層和真皮層，通過(guò)透皮治療的方式直接將外部治療分子遞送到黑色素瘤部位[19]。OMVs 作為透皮和腫瘤靶向藥物遞送的納米平臺(tái)，具有高效率和生物安全性，在淺表腫瘤的治療中具有巨大潛力。

2.1.2 OMVs 作為抗腫瘤藥物靶向遞送的載體：為了避免腫瘤免疫治療過(guò)程中的免疫抑制狀態(tài)，需要聯(lián)合藥物治療來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)OMVs 的腫瘤免疫治療潛力，從而徹底根除腫瘤并防止腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。OMVs 在復(fù)雜的革蘭氏陰性細(xì)胞包膜上遞送生物大分子的獨(dú)特能力，為其作為藥物遞送載體提供了較大的優(yōu)勢(shì)。KUERBAN 等[20]的研究證明了來(lái)自減毒肺炎克雷伯菌的OMVs 作為一種生物藥物遞送載體，已成功用于將抗腫瘤藥物阿霉素（DOX）轉(zhuǎn)運(yùn)到非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，并抑制小鼠模型中的腫瘤生長(zhǎng)。該研究還提出OMVs 可以募集TME 巨噬細(xì)胞，觸發(fā)適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)，從而增強(qiáng)DOX 的抗腫瘤作用，且未觀察到明顯的毒性。另外還有研究將紫杉醇（PTX）、小干擾RNA 等通過(guò)巨噬細(xì)胞攝取或電穿孔的方法加載到OMVs 中，以到達(dá)腫瘤部位發(fā)揮抗腫瘤作用[21]。最新的一項(xiàng)關(guān)于OMVs抗腫瘤治療的研究還聯(lián)合光動(dòng)力療法/化療/免疫療法來(lái)治療三陰性乳腺腫瘤，發(fā)現(xiàn)這種治療策略在根除腫瘤上具有很強(qiáng)的功效，還能有效地防止腫瘤向肺部的轉(zhuǎn)移[22]。

2.2 腫瘤免疫治療 OMVs 可激活宿主免疫系統(tǒng)，攻擊和清除腫瘤細(xì)胞。細(xì)菌抗原和多種PAMPs 的共存使OMVs 作為免疫刺激劑具有巨大的潛力。其在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)可被宿主模式識(shí)別受體（PRR）所識(shí)別，從而激活宿主免疫系統(tǒng)，刺激抗原呈遞細(xì)胞，并導(dǎo)致T 細(xì)胞成熟，進(jìn)而對(duì)OMVs 產(chǎn)生強(qiáng)大的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[23]。OMVs 還攜帶來(lái)自親本菌的LPS，黏附素和毒力因子。這些物質(zhì)可通過(guò)分泌抗腫瘤免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子如干擾素-γ，腫瘤壞死因子-α 等，進(jìn)而引起腫瘤損傷[24-25]。OMVs通過(guò)干擾素-γ 介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)不僅能清除腫瘤，而且其抗腫瘤反應(yīng)具有長(zhǎng)期記憶作用，可減少腫瘤的復(fù)發(fā)[25]。還有研究表明來(lái)自鼠傷寒沙門氏菌的OMVs 可通過(guò)激活宿主免疫系統(tǒng)和逆轉(zhuǎn)免疫抑制腫瘤微環(huán)境來(lái)促進(jìn)腫瘤消退[26]。其中注射OMVs 的小鼠腫瘤細(xì)胞不僅受到NK 細(xì)胞的殺傷而且發(fā)生了細(xì)胞自噬和凋亡。由此可見，細(xì)菌OMVs 作為新型腫瘤免疫治療劑具有巨大潛力，可以觸發(fā)對(duì)各種癌癥的有效抗腫瘤反應(yīng)，而不會(huì)產(chǎn)生顯著的不良反應(yīng)。

2.3 腫瘤疫苗 OMVs 是脂質(zhì)納米囊泡結(jié)構(gòu)，含有多種蛋白和特異性抗原，由于其免疫調(diào)節(jié)和向宿主細(xì)胞呈遞多種異源抗原的能力，OMVs 可以設(shè)計(jì)為一種有效的腫瘤治療性疫苗，通過(guò)基因工程將腫瘤抗原或小分子藥物遞送到APCs 甚至靶向癌細(xì)胞，因此在疫苗開發(fā)中具有巨大潛力。相比被動(dòng)免疫治療，腫瘤疫苗的優(yōu)勢(shì)在于T 細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)和相關(guān)記憶可能在疾病復(fù)發(fā)期間提供幫助。

基因工程領(lǐng)域的進(jìn)步促使OMVs 作為腫瘤疫苗平臺(tái)的進(jìn)一步改進(jìn)，從而提高產(chǎn)量，降低LPS 和磷壁酸對(duì)OMVs 的毒性，并用同源和異源抗原進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)免疫原性并提供更廣泛的保護(hù)。OMVs 經(jīng)基因和化學(xué)修飾將被賦予更多的功能。為了解決自然釋放OMVs 的低產(chǎn)量和脂多糖可能帶來(lái)的毒性作用，有研究人員開發(fā)了一種膜抗原的通用模塊（GMMA），即工程化的OMVs[27]，以增強(qiáng)自然OMVs 的形成、降低反應(yīng)性和毒性及過(guò)表達(dá)免疫原性抗原。ROSSI 等[28]的研究通過(guò)敲除?；D(zhuǎn)移酶基因msbB 或htrB 來(lái)修飾LPS 的內(nèi)毒性部分脂質(zhì)A，從而降低其反應(yīng)原性。據(jù)報(bào)道，通過(guò)基因工程方法將腫瘤抗原人瘤病毒16 型早期蛋白E7（HPV16E7）呈遞在大腸埃希菌衍生的OMVs 上，獲得重組的OMVs 疫苗。將該疫苗接種在移植TC-1 宮頸癌細(xì)胞的小鼠可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)[29]。還有研究人員通過(guò)基因工程技術(shù)改進(jìn)了OMVs 的遞送能力，使用納米膜過(guò)濾器通過(guò)連續(xù)擠出制備表面表達(dá)腫瘤靶向的細(xì)菌原生質(zhì)體納米囊泡，為實(shí)體腫瘤部位提供受體介導(dǎo)的被動(dòng)靶向。加載化療藥物的原生質(zhì)體納米囊泡顯示出劑量依賴性細(xì)胞毒性和腫瘤組織靶向特異性，并有效預(yù)防腫瘤異種移植小鼠的腫瘤生長(zhǎng)[30]?；蚬こ蘋MVs 在抗腫瘤作用中的巨大貢獻(xiàn)，為其作為有效和安全的抗腫瘤疫苗提供了巨大的潛力，以優(yōu)化和促進(jìn)腫瘤治療的發(fā)展。

3 未來(lái)與展望

近年來(lái)腫瘤發(fā)病率的激增促使研究人員致力于開發(fā)新型抗腫瘤藥物和手段。盡管大量的研究發(fā)現(xiàn)了OMVs 作為佐劑、腫瘤治療劑和藥物遞送載體以及工程細(xì)菌OMVs 作為腫瘤疫苗平臺(tái)的巨大潛力。在OMVs 的抗腫瘤治療中，提高OMVs 的安全性并保持佐劑效力以及使用OMVs 進(jìn)行個(gè)性化治療仍需要進(jìn)一步改進(jìn)。此外，腫瘤的異質(zhì)性可能需要開發(fā)出具有普遍抗腫瘤效應(yīng)類型的OMVs。當(dāng)前，OMVs 作為腫瘤治療劑或進(jìn)行腫瘤疫苗開發(fā)還在實(shí)驗(yàn)室研究階段，在廣泛臨床應(yīng)用之前，仍有許多問(wèn)題需要解決。