陳雪珍，朱 蓉，楊滿英，謝 婷，楊 爭，袁 博，胡金輝*

1.張家界市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 張家界 427000；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

國際癌癥研究署（International Agency for Research on Cancer, IARC）發(fā)布的2020 年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新發(fā)病高達226 萬例，被稱為全球女性第一大癌[1-3]。 雖然乳腺癌[4-7]的治療不斷更新和完善，但仍有部分患者會出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、肌肉轉(zhuǎn)移、鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移等遠處轉(zhuǎn)移；由于癌癥復發(fā)、轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，使乳腺癌患者的臨床結(jié)局仍不滿意，特別是三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）。TNBC 具有高侵襲性、高轉(zhuǎn)移率、治療手段有限等復雜問題，嚴重威脅患者生命健康和生活質(zhì)量[4-7]。 其中，骨轉(zhuǎn)移常導致病理性骨折、骨痛、高鈣血癥，甚至累及脊髓等，嚴重影響患者及家屬生活質(zhì)量。 由于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移機制尚未明確[8]，臨床上治療方案較單一，效果欠佳且時間持久。因此，尋找能防治乳腺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的輔助治療方案具有深遠意義。

補腎活血湯是一種中藥復方制劑，具有補腎填精、活血化瘀的功效，臨床研究證實其在治療乳腺癌及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者中有明確療效[9-11]。實驗研究證實，其對于抗血管生成、抑制腫瘤細胞遷移侵襲、促進骨質(zhì)修復等方面均有一定療效[12-13]，但復方成分復雜，作用機制尚未明確。 磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-ki-ases, P I3 K）/蛋 白 質(zhì) 激 酶B（protein kinase B, Akt）信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用，該通路中的突變在癌癥中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中尤為常見，特別是與TNBC 密切相關(guān)[14-17]。 目前研究結(jié)果顯示，PI3K/Akt通路涉及乳腺癌與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的多個過程，包括增殖、遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、免疫逃逸、誘導破骨細胞形成等。研究表明，補腎中藥淫羊藿可通過PI3K/Akt 促進成骨分化治療骨質(zhì)疏松[18]；沒藥的成分之一槲皮素[19]能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號通路來減少細胞增殖、誘導細胞凋亡等發(fā)揮抗癌作用。 骨微環(huán)境中成骨與破骨原是動態(tài)平衡的狀態(tài)，一旦打破則可能出現(xiàn)骨質(zhì)增生、骨質(zhì)破壞等情況。 因此，本研究擬通過構(gòu)建乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型，探究補腎活血湯是否通過調(diào)控PI3K/Akt 信號軸抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力和破骨細胞活性改善骨轉(zhuǎn)移，對其治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移機制進行研究，為補腎活血湯臨床治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移提供新的視角。

1 材料

1.1 實驗動物及細胞

雌性，SPF 級， 體質(zhì)量15～20 g，5～6 周齡的BALB/c裸鼠30 只，動物由湖南中醫(yī)藥大學統(tǒng)一購買（來源于湖南斯萊克景達有限公司），許可證號：SCXK（湘）2019-0009，符合湖南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會要求（LLBH-202141404）。 鼠源性TNBC 細胞系4T1（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：CL-0007，傳代至約18 代），用含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的1640 培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2孵育。細胞密度達80%傳代。

1.2 試劑與藥品

p-PI3K 兔單克隆抗體(批號：PA5-38905)，購自美國thermofisher 公司；磷酸化蛋白質(zhì)激酶B（phosphorylated protein kinase B, p-Akt）兔單克隆抗體(批號：9271S)，購自美國Thermofisher 公司；活化T 細胞胞質(zhì)核因子1（nuclear factor of activated T cells c1,NFATc1）小鼠單克隆抗體(批號：66963-1-Ig)、β-肌動蛋白（β-actin）小鼠單克隆抗體(批號：66009-1-Ig)、一抗、二抗稀釋液(批號：SA00001-1、SA00001-2)均購自美國Proteintech 公司；基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2, MMP-2）兔單克隆抗體(批號：Ab92536)購自英國Abcam 公司；蘇木精核染液（批號：20210809）、伊紅染色液（批號：20210809）、TRAP 染色試劑盒（批號：20210918）均購自中國Abiowell 公司。 補腎活血湯全部中藥均由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一采購，具體成分如下：杜仲15 g（批號：2112192），獨活15 g（批號：NG22032103），沒藥6 g（批號：2021120201），紅花6 g（批號：SX22032203），當歸尾12 g（批號：TH22042504），熟地黃12 g（批號：21120141B），山茱萸15 g（批號：SX22032207），補骨脂15 g（批號：HY22051001），枸杞子15 g（批號：CK22053105），菟絲子15 g（批號：SX22041301），肉蓯蓉15 g（批號：21121841A）。PI3K抑制劑LY294002(批號:154447-36-6-50 mg)，購自中國MCE 公司。

1.3 儀器

YT-CJ-2NB 型超凈工作臺(北京亞泰隆公司)；DH-1601 型恒溫培養(yǎng)箱(上海三藤儀器公司)；YD-315 型病理切片機(浙江金華益迪試驗器材)；DYY-6C 型電泳儀、DYCZ-40D 型轉(zhuǎn)膜儀(中國北京六一公司)；BX43 型光學顯微鏡(日本Olympus 公司)；E7242X 型醫(yī)用診斷X 線射線管組件（中國深圳威圖公司）。

2 方法

2.1 動物造模[20]、分組

30 只BALB/c 裸鼠，隨機選取6 只裸鼠作為空白組（蒸餾水灌胃20 mL·kg-1，每天1 次；取對數(shù)生長期4T1 乳腺癌細胞接種于其余BALB/c 裸鼠右側(cè)脛骨，接種后標記并進行完全隨機分組：模型組（蒸餾水灌胃20 mL·kg-1，每天1 次）、補腎活血湯組（中藥液灌胃36.67 g·kg-1，每天1 次）、LY294002 組（LY294002 腹腔注射，50 mg·kg-1，每周2 次）、補腎活血湯聯(lián)合LY294002 組（中藥液灌胃，36.67 g·kg-1，每天1 次＋LY294002 腹 腔 注 射，50 mg·kg-1，每周2次）；每組6 只。 具體造模操作為：制備細胞懸液密度約1×106細胞，接種體積20 μL，準備27 G 胰島素注射器，吸入人乳腺癌4T1 細胞懸液備用。 4%水合氯醛注射液（0.15 mL/10 g）腹腔注射麻醉。 麻醉成功后用左手固定后肢，屈膝呈90°暴露膝蓋和脛骨之間的白色髕韌帶。 用75%乙醇將裸鼠的右后肢進行消毒，右手握住針平行于脛骨，并將針通過髕韌帶中心扎入脛骨近端骨髓腔內(nèi)，緩慢注入大約20 μL的細胞懸液，拔出針頭后用棉花按壓針口。 約3 d脛骨區(qū)可見瘤體，經(jīng)X 線檢測發(fā)生溶骨性改變，本研究以脛骨區(qū)可見瘤體為模型成功評價標準。

2.2 藥物制備與給藥劑量

將中藥材倒入電陶瓷煎藥壺中，一煎加水1000 mL浸泡30 min，武火(500 W)煮沸，轉(zhuǎn)文火(200 W)煎60 min，過濾藥渣；二煎加水800 mL 煎煮45 min，過濾合并2 次煎液，混勻。 將煎液倒入圓底燒瓶中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮（70 ℃，-0.1 MPa），至約1 g/mL 時停止。 將濃縮后的煎液倒入蒸發(fā)皿中，恒溫水浴鍋蒸干，轉(zhuǎn)移至真空減壓干燥箱，干燥后得補腎活血湯浸膏。 收集浸膏，用鋁箔袋封裝，保存于干燥器中。根據(jù)70 kg 人與20 g 小鼠等效劑量比例1∶9.1 折算并取2 倍濃縮劑量得到裸鼠給藥劑量：補腎活血湯36.67 g·kg-1，灌胃前蒸餾水溶解浸膏成生藥濃度為1.8 g·mL-1；PI3K 抑制劑（LY294002）[21]，按說明書進行配制，給藥劑量為50 mg·kg-1。

2.3 各組裸鼠生長情況及瘤體變化情況

從造模后第4 天開始干預，連續(xù)干預14 d，同時觀察裸鼠的生存狀態(tài)，實驗開始后每2 天測量一次裸鼠右下肢直徑（mm）。所有裸鼠在實驗期間用同一電子秤、游標卡尺統(tǒng)一測量體質(zhì)量及右下肢直徑。第15 天脫頸處死后取材，對各組瘤體進行常規(guī)石蠟切片，采用HE、TRAP 染色進行觀察。分多聚甲醛固定及-80 ℃凍存。

2.4 X 線評估骨轉(zhuǎn)移破壞情況

X 線掃描多聚甲醛固定標本，評估骨溶解情況。設(shè)置參數(shù)為：40 kV、32 mA、6 mAs。

2.5 HE 及TRAP 染色

處死后對裸鼠右下肢骨組織制備石蠟切片，進行病理學HE 染色檢測，確認為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移。TRAP 染色評估破骨細胞數(shù)量。

2.6 Western blot 檢測骨組織相關(guān)蛋白表達

轉(zhuǎn)移瘤標本在冷RIPA 緩沖液中溶解，并在12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，離心半徑7 cm。將裂解物從10% SDS-PAGE 凝膠上電泳轉(zhuǎn)移到NC膜上。 將膜在含有5%脫脂奶的Tris 緩沖鹽（PBST）緩沖液中于室溫下封閉1.5 h 后，膜與抗β-actin、抗p-PI3K、p-Akt、MMP-2、NFATc1 的抗（分別為1∶5000、1∶1000、1∶1000、1∶1000、1∶2000）室溫孵育過夜，洗膜后與二抗（鼠源1∶6000，兔源1∶5000）室溫下孵育1.5 h。加入ECL 顯影液，放于化學凝膠成像系統(tǒng)顯影，采用全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析，以目標條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示蛋白的相對表達水平。

2.7 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 19.0 及Graphpad Prism 5.0 軟件進行統(tǒng)計分析，每組至少重復3 次，所有計量資料以“±s”表示，檢驗各組數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗和方差齊性，組間比較采用單因素方差分析，重復測量資料進行球形分布檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組裸鼠生長曲線及瘤體變化情況

造模成功率100%。 由于移植瘤表現(xiàn)為局部膝關(guān)節(jié)腫脹，與普通皮下移植瘤不同，故測量下肢腫脹部分最大直徑進行對比。 結(jié)果顯示：與A 組相比，B組、C 組、D 組及E 組裸鼠右下肢直徑增長明顯，其中B 組增長速度最為迅速（P＜0.01）；與B 組相比，C組、D 組及E 組增長較緩，且各組增長程度呈遞減趨勢，以E 組最為明顯（P＜0.01）。 詳見表1、圖1。

圖1 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠、瘤體圖

表1 補腎活血湯對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠右下肢直徑的影響（mm，±s，n=6）

表1 補腎活血湯對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠右下肢直徑的影響（mm，±s，n=6）

注：A.空白組；B.模型組；C.補腎活血湯組；D.LY294002 組；E.補腎活血湯聯(lián)合LY294002 組。 整體組別比較，P=0.034＜0.05；與A 組相比，**P＜0.01；與B 組相比，##P＜0.01。

組別ABCDE干預時間0 d 2 d 4 d 6 d 8 d 10 d 12 d 6.89±0.32 7.18±1.16 6.50±0.35 7.14±0.59 6.75±0.76 7.11±0.26 7.23±1.15 6.56±0.35 7.23±0.61 6.83±0.77 7.32±0.33 8.46±1.83 7.36±0.88 7.28±0.72 6.78±1.00 7.51±0.37 9.05±1.42 8.04±1.47 7.83±0.89 7.34±1.00 7.74±0.30 11.49±3.25 9.27±1.45 8.90±1.42 8.35±0.92 7.89±0.30 11.92±2.49 10.75±1.04 9.71±1.87 9.16±1.25 7.99±0.30 14.15±3.21**11.76±1.05 10.71±1.26 9.73±0.93##

3.2 補腎活血湯對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移灶的影響

與A 組比較，B 組、C 組、D 組和E 組HE 染色可見腫瘤細胞浸潤，核大深染，部分可見與正常組織分界，明確發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，證實造模成功（如圖2）。 對下肢組織進行X 線檢測，與A 組比較，B 組、C 組、D組及E 組裸鼠右側(cè)脛骨呈現(xiàn)溶骨性改變，嚴重者骨干消失，C 組、D 組及E 組骨溶解情況均較B 組稍輕（如圖3）；TRAP 染色提示，與A 組比較，B、C、D、E組破骨細胞數(shù)量增多，且C 組、D 組、E 組破骨細胞數(shù)量均較B 組有不同程度減少（如圖4）。

圖2 補腎活血湯對裸鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移灶病理組織學（HE，×200）

圖3 補腎活血湯對裸鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移灶影像學影響

圖4 補腎活血湯對裸鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移灶TRAP 染色的影響（TRAP，×400）

3.3 補腎活血湯對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移瘤組織中通路蛋白表達情況的影響

與A 組比較，B 組、C 組、D 組裸鼠瘤組織中p-PI3K、p-Akt、MMP-2 和NFATc1 蛋白的表達均升高（P＜0.01 或P＜0.05），E 組裸鼠瘤組織中p-PI3K、p-Akt 和MMP-2 蛋白的表達均升高（P＜0.01 或P＜0.05）；與B 組比較，C 組、D 組及E 組裸鼠瘤組織中p-PI3K、p-Akt、MMP-2 和NFATc1 的表達均降低（P＜0.01 或P＜0.05）；與C 組比較，E 組裸鼠瘤組織中p-PI3K、p-Akt、MMP-2 的表達均降低（P＜0.01 或P＜0.05），D 組及E 組裸鼠瘤組織中NFATc1 的表達呈現(xiàn)遞減趨勢（P＞0.05）。 詳見表2、圖5。

圖5 各組裸鼠骨轉(zhuǎn)移瘤組織p-PI3K、p-Akt、MMP-2、NFATc1 蛋白表達圖

表2 補腎活血湯對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤組織中p-PI3K、p-Akt、MMP-2 和NFATc1 蛋白表達的影響（±s，n=6）

表2 補腎活血湯對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤組織中p-PI3K、p-Akt、MMP-2 和NFATc1 蛋白表達的影響（±s，n=6）

注：與A 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與C 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 A.空白組；B.模型組；C.補腎活血湯組；D.LY294002 組；E.補腎活血湯聯(lián)合LY294002 組。

組別A B C D E F 值P 值p-PI3K/β-actin 0.083±0.015 0.573±0.011**0.430±0.010**##0.300±0.040**##0.210±0.060**##△△95.81 0.000 p-Akt/β-actin 0.100±0.046 0.550±0.090**0.362±0.008**##0.275±0.057*##0.177±0.031##△△31.70 0.000 MMP-2/β-actin 0.097±0.015 0.460±0.036**0.345±0.035**##0.240±0.010**##△0.187±0.035*##△△72.88 0.000 NFATc1/β-actin 0.100±0.026 0.660±0.165**0.355±0.055*#0.260±0.070##0.197±0.060##17.43 0.000

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學治療乳腺癌有手術(shù)、放化療、靶向治療、內(nèi)分泌治療、中醫(yī)藥等多種綜合治療手段，藥物選擇豐富多樣[4]。 但是對于晚期乳腺癌，特別是轉(zhuǎn)移率高達65%～75%的骨轉(zhuǎn)移[22]，治療手段及療效仍有待進一步開發(fā)研究。 PI3K/Akt 通路是細胞內(nèi)的信號傳導通路，其突變在TNBC 中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)，高達70%[23-24]。PI3K/Akt 通路可促使M2 巨噬細胞發(fā)生極化并釋放特異性降解細胞外基質(zhì)的MMP-2[25-30]；MMP-2 作為乳腺癌侵襲性的標志物，能促進腫瘤細胞和腫瘤基質(zhì)細胞的遷移，導致腫瘤細胞更難以被免疫細胞識別、追蹤與殺傷[31-32]；另外，PI3K/Akt 信號通路可以通過調(diào)控破骨細胞特異性蛋白質(zhì)NFATc1 的表達來影響破骨細胞形成和分化。 因此，PI3K/Akt 信號通路可能通過調(diào)控MMP-2、NFATc1 達到改善乳腺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移的作用[33-35]。

中醫(yī)學認為，乳腺癌病機為正虛邪戀，正氣虧虛，邪毒凝結(jié)，病位在乳，歸經(jīng)屬于肝、胃、腎。邪毒以痰、瘀、毒為主[7，36-37]。 加上手術(shù)、放化療等伴隨的毒副反應，導致氣血精的進一步虛損，臟腑功能隨之減退，全身呈現(xiàn)免疫低下、代謝減退及紊亂等狀態(tài)。 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移以腎虛為本，血瘀為標，瘀血邪毒趁虛而入流于至虛病所，深入經(jīng)筋骨骱之中，膠著不去，使經(jīng)脈凝滯不通，發(fā)為病灶，出現(xiàn)骨痛等現(xiàn)象。 補腎活血湯出自《傷科大成·跌打引經(jīng)用藥法》，方中杜仲、熟地黃、補骨脂、獨活共為君藥，具有補腎壯陽、益精生髓、強筋壯骨之效；沒藥、當歸尾、紅花共為臣藥，助君藥以補腎填精、祛瘀通絡(luò)、活血止痛；肉蓯蓉、菟絲子、山茱萸、枸杞子均為佐藥，性甘溫平，善于補腎益精助陽。全方以補為主，標本同治，有補腎填精、活血化瘀之效。研究證實，補腎活血湯有改善局部血液循環(huán)、提高成骨細胞活性、促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化、抑制破骨形成等作用[38-40]。

本研究結(jié)果顯示，造模后，組織中p-PI3K、p-Akt、NFATc1 及MMP-2 蛋白的表達增高，藥物干預后，C 組、D 組及E 組的轉(zhuǎn)移瘤組織中p-PI3K、p-Akt、NFATc1 及MMP-2 蛋白的表達均較B 組下降；組間比較發(fā)現(xiàn)，E 組表達最低，呈現(xiàn)協(xié)同作用。 由此可見，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生時，機體內(nèi)PI3K/Akt 通路被激活，破骨細胞活性增加，腫瘤侵襲性增強；補腎活血湯能抑制PI3K/Akt 信號通路的活化，PI3K/Akt通路的抑制下調(diào)了NFATc1 及MMP-2 蛋白的表達，減弱了破骨細胞的活性及腫瘤細胞侵襲性。 因此，補腎活血湯可能通過抑制PI3K/Akt 通路下調(diào)MMP-2 及NFATc1 的表達發(fā)揮治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用。 本課題組選用人源性TNBC 細胞株MDAMB-231 細胞裸鼠脛骨注射造模，在預實驗進行動物造模時出現(xiàn)造模周期長，成模率低的困境，故后期調(diào)整為鼠源性TNBC 細胞株4T1 細胞。 由于實驗設(shè)備等的原因，對于X 線結(jié)果無法進行量化分析，評估存在一定局限性，無法獲得統(tǒng)計學的驗證，后續(xù)研究可結(jié)合小動物CT 進行檢測，進一步評估骨小梁、骨密度等指標。

綜上所述，補腎活血湯可抑制PI3K/Akt 通路以下調(diào)MMP-2 及NFATc1 的表達，削弱破骨細胞的活性和腫瘤侵襲性來治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移。 本研究為補腎活血湯的進一步深入研究提供了方向，為補腎活血湯的臨床運用提供了數(shù)據(jù)支持。