李婉麒，楊鳳娟，賈德臣，姜衛(wèi)紅，顧陽(yáng)

（1 中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，中國(guó)科學(xué)院合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032；2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100039；3 上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

合成氣是一類以一氧化碳、二氧化碳和氫氣為主要組分、可用于化工生產(chǎn)的原料氣。其來(lái)源廣泛，可由含碳礦物質(zhì)如煤、石油、天然氣、污泥和生物質(zhì)等制備而來(lái)，且根據(jù)來(lái)源、組成和用途的不同，又被稱為煤氣、合成氨原料氣、甲醇合成氣等。此外，鋼鐵、煤化工企業(yè)排放的廢氣也是合成氣的來(lái)源之一。在化工生產(chǎn)領(lǐng)域，以合成氣為原料合成氨、含氧化合物和烴類等技術(shù)已投入商業(yè)運(yùn)行?；诨瘜W(xué)催化路線的合成氣轉(zhuǎn)化利用雖然效率高，但對(duì)于不同的目標(biāo)產(chǎn)品而言所需的合成氣成分并不一樣，因此需要調(diào)整氣體組成。合成氣化學(xué)轉(zhuǎn)化涉及的反應(yīng)均在高溫高壓下完成，條件苛刻，產(chǎn)物種類也比較有限。

近年來(lái)，合成氣的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)引起了極大關(guān)注。自然界中存在可利用合成氣中一氧化碳和二氧化碳的化能自養(yǎng)型細(xì)菌，主要為梭菌屬、醋酸桿菌屬和穆爾氏菌屬[1?3]。這類微生物在吸收、利用合成氣的同時(shí)能夠生成少量有機(jī)酸（如乙酸和丁酸）和有機(jī)醇（如乙醇、丁醇、己醇），因而具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值（圖1）。與化學(xué)催化過(guò)程相比，化能自養(yǎng)微生物介導(dǎo)的合成氣催化、轉(zhuǎn)化路徑具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，主要包括：①微生物可利用各種類型的合成氣，且能夠適應(yīng)合成氣中各組分比例的較大變化；②較低的能耗和運(yùn)行成本；③可合成化學(xué)催化難以獲得的中、長(zhǎng)碳鏈化合物，且產(chǎn)物合成的選擇性較好。

圖1 合成氣發(fā)酵示意圖

2017 年，美國(guó)朗澤公司和首鋼集團(tuán)有限公司合作建設(shè)了4.6萬(wàn)噸/年規(guī)模的鋼廠尾氣制乙醇生產(chǎn)線，并正式運(yùn)行。2021 年，朗澤公司又在寧夏平羅建立了4.5 萬(wàn)噸/年規(guī)模的鋼廠尾氣制乙醇生產(chǎn)線。上述氣體轉(zhuǎn)化工藝所采用發(fā)酵菌株均為食氣梭菌，表明基于梭菌的工業(yè)含碳尾氣轉(zhuǎn)化制造化學(xué)品的技術(shù)路線具有工業(yè)應(yīng)用的可行性，但目前的商業(yè)化產(chǎn)品只局限于乙醇。顯然，將合成氣通過(guò)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)價(jià)值更高的中、長(zhǎng)碳鏈燃料以及大宗化學(xué)品，對(duì)于拓展合成氣轉(zhuǎn)化途徑、實(shí)現(xiàn)合成氣高值化利用具有重要意義。需要指出的是，生物催化路線也存在不足，主要體現(xiàn)在較低的氣體吸收、轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)物合成速率，從而阻礙了這類技術(shù)的廣泛應(yīng)用，亟需改進(jìn)和優(yōu)化。

近年來(lái)，隨著我國(guó)“碳達(dá)峰、碳中和”目標(biāo)的提出，基于生物路線的合成氣利用技術(shù)及相關(guān)研究愈發(fā)凸顯其重要性。同時(shí)，得益于以CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列）?Cas基因組編輯工具為代表的高效分子遺傳操作技術(shù)的開發(fā)，化能自養(yǎng)細(xì)菌這類難操作微生物的分子改造及合成生物學(xué)研究也取得了較大的進(jìn)展?；诖?，本文對(duì)這一領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀和存在的問(wèn)題進(jìn)行梳理和總結(jié)，并展望未來(lái)的發(fā)展前景和方向。

1 合成氣的來(lái)源與制備

煤氣化和天然氣轉(zhuǎn)化是目前化工路線生產(chǎn)合成氣的兩種主要方法[4]。煤氣化是指以煤或煤焦為原料，以氧氣（空氣、富氧或工業(yè)純氧）、水蒸氣作為氣化劑，在高溫條件下通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將煤或煤焦中的可燃部分轉(zhuǎn)化為可燃性氣體，所獲得的合成氣又被稱之為煤氣。這也是20 世紀(jì)50 年代以前主流的合成氣制備技術(shù)。此外，天然氣中的主要成分——甲烷，在高溫條件下與氧氣、水蒸氣或二氧化碳進(jìn)行重整反應(yīng)也可制得合成氣，主要的制備路徑包括甲烷水蒸氣重整制合成氣、甲烷?二氧化碳重整制合成氣以及甲烷部分氧化制合成氣等[5]。其中，甲烷水蒸氣重整和甲烷?二氧化碳重整制合成氣均是強(qiáng)吸熱過(guò)程，在高溫條件下進(jìn)行，因此整個(gè)工藝過(guò)程能耗高。而甲烷部分氧化法制合成氣則是一個(gè)溫和放熱反應(yīng)過(guò)程，可在相對(duì)較低的溫度（750～800℃）進(jìn)行，因此該法具有能耗低、反應(yīng)速率快、生產(chǎn)強(qiáng)度大等優(yōu)點(diǎn)。與水蒸氣重整法相比，甲烷部分氧化制合成氣的反應(yīng)器體積小、效率高、能耗低，可顯著降低設(shè)備投資和生產(chǎn)成本。不同原料來(lái)源的合成氣組成見表1。

表1 不同原料來(lái)源的合成氣組成[5]

生物質(zhì)氣化也是制備合成氣的一個(gè)重要途徑。目前，生物燃料如乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)仍主要依賴糖類和淀粉質(zhì)原料，較高的原料價(jià)格影響了這一技術(shù)路線的經(jīng)濟(jì)性。各種農(nóng)林廢棄生物質(zhì)（例如玉米秸稈、小麥和大麥秸稈）、農(nóng)業(yè)加工副產(chǎn)品（例如玉米纖維、甘蔗渣、種子餅等）以及能源作物（例如柳枝稷、楊樹、香蕉草、芒草等）等價(jià)格低廉，儲(chǔ)量豐富，亟待得到有效利用。熱化學(xué)途徑可以將這些木質(zhì)纖維素類原料熱裂解成以一氧化碳（CO）、氫氣（H2）和二氧化碳（CO2）為主并含有少量甲烷（CH4）的合成氣（表2）[6]，從而被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化和利用。

表2 來(lái)自各種木質(zhì)纖維素生物質(zhì)來(lái)源的合成氣組成[7]

2 合成氣的生物利用及定向轉(zhuǎn)化

2.1 可利用合成氣的微生物及其代謝特點(diǎn)

目前已知的合成氣發(fā)酵微生物主要是產(chǎn)乙酸菌（Acetogens）。產(chǎn)乙酸菌是厭氧菌，可通過(guò)Wood?Ljungdahl（WL）途徑同化CO和CO2（圖2），該途徑也被稱為還原性乙酰輔酶A 途徑[8]。這些產(chǎn)乙酸菌普遍存在于土壤、海洋沉積物和糞便等環(huán)境中，表現(xiàn)出各種形態(tài)（如桿狀、球菌或螺旋體），且具有比較寬泛的最佳生長(zhǎng)溫度（嗜冷、嗜溫或嗜熱）[9]。絕大多數(shù)產(chǎn)乙酸菌屬于厚壁菌門，且分布于二十多種細(xì)菌屬[10]，其中比較有代表性的是醋桿菌屬（Acetobacterium）和梭菌屬（Clostridium）（表3）。

圖2 產(chǎn)乙酸菌Wood?Ljungdahl途徑

表3 不同產(chǎn)乙酸菌的特征

產(chǎn)乙酸菌利用Wood?Ljungdahl 途徑同化CO 和CO2生產(chǎn)乙酰輔酶A，并進(jìn)一步合成有機(jī)醇（乙醇、丁醇、己醇等）以及有機(jī)酸（乙酸、乳酸、丁酸、己酸等）（圖2）。而在以糖為碳源的異養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中，產(chǎn)乙酸菌的糖酵解途徑產(chǎn)生的CO2可被Wood?Ljungdahl 途徑重新吸收利用，從而避免了過(guò)多的碳流失，這也是相對(duì)于異養(yǎng)微生物的一大優(yōu)勢(shì)。但產(chǎn)乙酸菌的固碳是一個(gè)能量?jī)粝倪^(guò)程，其通過(guò)建立跨膜離子梯度驅(qū)動(dòng)ATP合成以維持基本能量需求[9]。研究者在熱乙酸穆爾氏菌（Moorella thermoacetica）、熱自養(yǎng)穆爾氏菌（Moorella thermoautotrophica）、甲酸梭菌（Clostridiumformicoaceticum）和醋酸梭菌（Clostridium aceticum）中檢測(cè)到甲基萘醌或細(xì)胞色素[52?54]，因此推測(cè)它們可能利用這些電子載體輔助鐵氧還蛋白、黃素氧還蛋白、黃素蛋白和紅素氧還蛋白等完成各種氧化還原反應(yīng)。而木醋桿菌（Acetobacterium woodii）不含有細(xì)胞色素和醌，因此其可能主要通過(guò)鈉動(dòng)力鐵氧還蛋白?NAD氧化還原酶（Rnf）在細(xì)胞膜上產(chǎn)生鈉離子電位，并進(jìn)一步通過(guò)膜整合型Na+F1F0ATP 合酶驅(qū)動(dòng)ATP的合成。與A. woodii一樣，食氣永達(dá)爾梭菌C. ljungdahlii也不含細(xì)胞色素，而是主要依賴Rnf產(chǎn)生跨膜離子梯度驅(qū)動(dòng)ATP 合成；但不同的是，C. ljungdahlii中的Rnf 復(fù)合物依賴于質(zhì)子而不是鈉離子生成ATP[10]。

合成氣中的CO2分子具有高度的熱力學(xué)穩(wěn)定性，其還原和轉(zhuǎn)化需要較多的能量輸入。然而，天然固碳微生物中負(fù)責(zé)能量傳遞的電子通道效率較低以及固碳生物元件活性普遍不高，從而限制了微生物對(duì)合成氣中所有組分的高效利用和轉(zhuǎn)化。

大多數(shù)產(chǎn)乙酸菌如A. woodii、C. aceticum和M. thermoacetica合成乙酸作為其主要產(chǎn)物[55?57]。這類產(chǎn)乙酸菌可以通過(guò)Wood?Ljungdahl 途徑使用一分子ATP 將一碳?xì)怏w固定為乙酰輔酶 A，然后通過(guò)乙酸激酶（ACK）將其轉(zhuǎn)化為乙酸，從而獲得一分子ATP。而有些產(chǎn)乙酸菌，如C. ljungdahlii、C. autoethanogenum和C. ragsdalei除了合成乙酸外，還可合成以乙醇為主的醇類產(chǎn)物。乙醇合成可以通過(guò)兩種代謝途徑完成；第一條途徑由乙酰輔酶A經(jīng)乙醛/乙醇脫氫酶兩步催化完成；第二條途徑則依靠醛鐵氧還蛋白氧化還原酶（AOR）催化乙酸生成乙醇。

丁酸也是產(chǎn)乙酸菌的產(chǎn)物之一， 在C. carboxidivorans、C. drakei、C. magnum、C. scatologenes、C. methoxybenzovorans的氣體發(fā)酵產(chǎn)物中均可檢測(cè)到丁酸的存在[58]。在丁酸合成過(guò)程中，電子轉(zhuǎn)運(yùn)黃素蛋白（EtfA和EtfB）對(duì)丁酰輔酶A脫氫酶（Bcd）的活力起著至關(guān)重要的作用[59]。C. ljungdahlii、C. autoethanogenum和C. ragsdalei還能夠產(chǎn)生2,3?丁二醇。2,3?丁二醇的合成過(guò)程需要三種酶：丙酮酸：乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脫羧酶和2,3?丁二醇脫氫酶。丙酮酸首先脫羧形成乙酰乳酸，進(jìn)一步脫羧產(chǎn)生乙偶姻，乙偶姻最終被還原生成2,3?丁二醇[23]。上述三種菌株還可以從丙酮酸通過(guò)乳酸脫氫酶產(chǎn)生乳酸。此外，B. methylotrophicum、E. limosum和B. producta也能夠利用一碳?xì)怏w產(chǎn)生乳酸[60?62]。

總體而言，上述自養(yǎng)細(xì)菌合成的產(chǎn)物中乙酸占據(jù)了主導(dǎo)地位，主要原因是其合成路徑短（由乙酰輔酶A 經(jīng)兩部催化），效率高，且在合成過(guò)程中生成ATP，這對(duì)于能量?jī)粝牡墓烫即x過(guò)程至關(guān)重要。而對(duì)于其他產(chǎn)物，由于反應(yīng)路徑較長(zhǎng)且需消耗較多能量，因此其合成水平受到較大限制。

2.2 食氣梭菌的生理生化特征

食氣梭菌是目前最主要的合成氣發(fā)酵微生物，屬于革蘭氏陽(yáng)性、厭氧梭狀芽胞桿菌。已報(bào)道的食氣梭菌主要包括永達(dá)爾梭菌（C. ljungdahlii）、自產(chǎn)乙醇梭菌（C. autoethanogenum）、食一氧化碳梭菌（C. carboxidivorans）等。

C. ljungdahlii最初是從養(yǎng)雞場(chǎng)廢棄物中分離出來(lái)的，后續(xù)的研究揭示其可利用 H2和 CO2、CO、甲酸鹽、乙醇、丙酮酸、延胡索酸以及糖（包括果糖和木糖）等碳源支持其生長(zhǎng)[31]。隨后，有研究者從兔子糞便中也分離出一種與C. ljungdahlii高度相似的細(xì)菌[22]，并命名為C. autoethanogenum。最新的基因組測(cè)序結(jié)果表明，這兩種食氣梭菌的基因組序列相似度達(dá)到99.3%，具有極高的親緣關(guān)系。C. ljungdahlii和C. autoethanogenum的 產(chǎn) 物 種 類相同，都產(chǎn)生大量的乙酸和乙醇以及少量的2,3?丁二醇和乳酸。值得一提的是，研究者發(fā)現(xiàn)C. ljungdahlii除了可以利用合成氣生產(chǎn)乙醇外，在發(fā)酵后期還會(huì)啟動(dòng)乙醇的回用，對(duì)這一乙醇合成與消耗的動(dòng)態(tài)變化機(jī)制的理解有助于構(gòu)建乙醇高產(chǎn)菌株[63]。此外，食氣梭菌在發(fā)酵不同成分組成的氣體時(shí)其合成的產(chǎn)物類型也存在較大差異。例如，C. ljungdahlii在發(fā)酵CO 時(shí)主要產(chǎn)生乙醇，而在利用CO2/H2時(shí)主要合成乙酸，這可能與兩種氣體條件下細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)的差異有關(guān)[64]。

由于以C. ljungdahlii和C. autoethanogenum為代表的食氣梭菌可將一碳?xì)怏w轉(zhuǎn)化為醇類化合物，因而相關(guān)技術(shù)和工藝具有良好的應(yīng)用前景。目前，基于食氣梭菌的鋼廠尾氣制乙醇技術(shù)已經(jīng)在國(guó)內(nèi)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，充分表明這一生物技術(shù)路線產(chǎn)業(yè)化的可行性。然而，食氣梭菌的主要天然產(chǎn)物是乙酸和乙醇，能合成的高值長(zhǎng)碳鏈化學(xué)品極為有限且產(chǎn)量較低，這也是亟待解決的問(wèn)題。

2.3 食氣梭菌分子遺傳操作工具

電穿孔和電轉(zhuǎn)化是將外源DNA 引入食氣梭菌最常用的方法，這些策略已在C. ljungdahlii、C. autoethanogenum、C. acetum、A. woodii等菌中得到應(yīng)用[65]。此外，第三代測(cè)序技術(shù)如單分子實(shí)時(shí)測(cè)序 （Single molecule real?time sequencing）的出現(xiàn)，為鑒定細(xì)菌的限制性修飾位點(diǎn)提供了可靠的幫助。2014 年，研究者使用該技術(shù)成功鑒定了C. autoethanogenum基因組中的甲基化修飾位點(diǎn)，并將相關(guān)的甲基化酶在大腸桿菌中表達(dá)用于穿梭質(zhì)粒的甲基化修飾，從而提高了這些質(zhì)粒對(duì)于該菌的電轉(zhuǎn)化效率[66]。

基于上述的外源DNA 轉(zhuǎn)化方法，研究者逐步建立了適用于食氣梭菌的基因失活技術(shù)。2007年，Heap 等[67]開發(fā)了一種基于乳酸乳球菌二類內(nèi)含子的ClosTron基因敲除技術(shù)，并首先用于構(gòu)建丙酮丁醇梭菌和艱難梭菌的突變體。后期，這一方法在C. autoethanogenum和C. ljungdahlii等中也得到了成功應(yīng)用[68?69]，為這類自養(yǎng)細(xì)菌的分子操作提供了新的路徑。需要指出的是，盡管也有單純依靠同源重組實(shí)現(xiàn)C. ljungdahlii中基因缺失的研究報(bào)道[70]，但效率較低，需要進(jìn)行改良和優(yōu)化。此外，Cre?lox系統(tǒng)也已被應(yīng)用于食氣梭菌中實(shí)現(xiàn)了基因在染色體上的整合。2014年，Ueki等[71]將異源丁酸合成途徑整合到永達(dá)爾梭菌C. ljungdahlii的染色體上，實(shí)現(xiàn)了工程菌發(fā)酵氣體合成丁酸。

CRISPR?Cas 系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于微生物的基因組編輯。2016 年，國(guó)內(nèi)的研究者首次在C. ljungdahlii中建立了基于CRISPR/cas9 的基因組編輯技術(shù)，實(shí)現(xiàn)4個(gè)基因的缺失[72]。除了最常用的Cas9 蛋白外，Cas12a（原名Cpf1）也被應(yīng)用C. ljungdahlii中，可以更好地滿足梭菌低GC 含量的特點(diǎn)。2019年，Zhao 等[73]在C. ljungdahlii中建立了基于CRISPR?Cas12a 的基因組編輯方法，實(shí)現(xiàn)了有效的基因刪除和轉(zhuǎn)錄干擾（CRISPRi）。此外，Huang 等[74]將噬菌體來(lái)源的Att/Int 元件引入了C. ljungdahlii，并結(jié)合CRISPR?Cas9 系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了將9.1kb 大小的丁酸合成途徑整合至該菌染色體上，并實(shí)現(xiàn)工程菌發(fā)酵氣體合成丁酸。

研究者在開發(fā)食氣梭菌適用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子方面也取得了進(jìn)展。Areen Banerjee 等[75]將來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌的乳糖誘導(dǎo)系統(tǒng)（bgaR-PbgaL） 引入C. ljungdahlii，用于調(diào)控胞內(nèi)代謝流優(yōu)化丙酮等產(chǎn)物的合成。此外，四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子被用于C. ljungdahlii和C. autoethanogenum中 以 實(shí) 現(xiàn)CRISPRi 系統(tǒng)的誘導(dǎo)表達(dá)[76]。

除了上述理性改造技術(shù)外，基于轉(zhuǎn)座子的染色體上DNA隨機(jī)整合方法也被用于食氣梭菌的改造。近年來(lái)，研究者針對(duì)食氣梭菌開發(fā)了多種基于Himar1 轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變系統(tǒng)，并借助這一系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了基因的失活和大片段DNA 在基因組的插入和整合[77]。例如，Philipps 等[78]在C. ljungdahlii中建立了一種有效的基因轉(zhuǎn)移和基因組整合系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過(guò)誘導(dǎo)Himar1 轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)將大片段DNA（>5kb）整合到染色體上。除整合大片段基因的功能外，轉(zhuǎn)座子也可用于功能基因組學(xué)研究，如利用轉(zhuǎn)座子插入測(cè)序技術(shù)（TIS）快速高效地篩選重要表型相關(guān)的功能基因[79]。這一技術(shù)已被用于發(fā)掘和鑒定C. autoethanogenum中與一氧化碳代謝相關(guān)的必需基因[80]。

2.4 食氣梭菌代謝工程改造

對(duì)于食氣菌而言，其遺傳改造的目的主要涵蓋兩個(gè)方面：增強(qiáng)固碳效率和提高產(chǎn)物定向合成能力。例如，為增強(qiáng)A. woodii的固碳效率，研究者在該菌中過(guò)量表達(dá)了Wood?Ljungdahl 途徑的關(guān)鍵基因，從而顯著提高了工程菌在自養(yǎng)生長(zhǎng)條件下的乙酸產(chǎn)量[81]。此外，鑒于一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合酶（CODH/ACS）復(fù)合體在食氣梭菌轉(zhuǎn)化CO 或CO2為乙酰輔酶A 的過(guò)程中起著重要作用，研究者在C. autoethanogenum中過(guò)表達(dá)CODH/ACS 編碼基因（CAETHG_1620?1621）時(shí)，可有效加速菌株在氣體發(fā)酵中的生長(zhǎng)速度，提高乙醇和乳酸產(chǎn)量[77]。研究者還在C. ljungdahlii中引入了丙酮丁醇梭菌來(lái)源的丙酮合成途徑，并采用混合碳源 （糖/一碳?xì)怏w）發(fā)酵策略，使得糖酵解途徑產(chǎn)生的CO2被重新利用，減少了糖酵解途徑的碳流失，并通過(guò)高密度連續(xù)發(fā)酵實(shí)現(xiàn)丙酮的高產(chǎn)[82]。

此外，合適的啟動(dòng)子元件對(duì)于食氣梭菌的基因表達(dá)優(yōu)化也極為重要。2017 年，研究者構(gòu)建了C. ljungdahlii的啟動(dòng)子文庫(kù)，將原始啟動(dòng)子Pthl的?35區(qū)、?10區(qū)以及兩者之間的間隔序列進(jìn)行隨機(jī)突變，得到一系列不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子，并利用catP?lacZ雙報(bào)告系統(tǒng)來(lái)表征啟動(dòng)子強(qiáng)度，從而篩選到了比原始啟動(dòng)子活性高出一個(gè)數(shù)量級(jí)的人工啟動(dòng)子。這些人工啟動(dòng)子被用于在C. ljungdahlii中表達(dá)驅(qū)動(dòng)熱休克蛋白基因dnaK，顯著提高了主要產(chǎn)物乙酸和乙醇的產(chǎn)量[83]。

就新產(chǎn)物合成而言，研究者近年來(lái)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了食氣梭菌合成丁醇、2,3?丁二醇、丙酮、異丙醇、3?羥基丁酸、3?羥基丙二酸、甲羥戊酸等[65,84]（圖3）。例如，研究者將來(lái)源于丙酮丁醇梭菌（C. acetobutylicum） 的丁醇合成基因簇導(dǎo)入C. ljungdahlii和C. autoethanogenum中表達(dá)，并強(qiáng)化表達(dá)相關(guān)的電子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因etfAB，實(shí)現(xiàn)了這兩株食氣梭菌中的丁醇合成，產(chǎn)量分別為0.36g/L和1.54g/L[85?86]；而研究者將C. acetobutylicum的丙酮合成基因簇在C. aceticum、C. ljungdahlii和C. autoethanogenum中進(jìn)行表達(dá)，也實(shí)現(xiàn)了這三種梭菌發(fā)酵一碳?xì)怏w合成丙酮，產(chǎn)量分別為9mg/L、0.76g/L 和5.8g/L[56,75,87]。此外，研究人員在C. ljungdahlii中以來(lái)源于C. acetobutylicum的丁酸合成基因簇替代其自身乙酸合成途徑中的磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因pta，實(shí)現(xiàn)了丁酸的合成，產(chǎn)量達(dá)到1.32g/L[88]。除了這些有機(jī)酸/醇以外，C. autoethanogenum作為底盤細(xì)胞被改造用于表達(dá)聚3?羥基丁酸（PHB）合成途徑的三個(gè)關(guān)鍵基因，即phaA、phaB 和phaC，并在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下進(jìn)行氣體發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)了PHB的生產(chǎn)[89]。

圖3 食氣梭菌合成產(chǎn)物的代謝途徑

抑制或敲除旁路途徑也是提高代謝途徑中目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的方法之一。研究者利用同源重組和二類內(nèi)含子介導(dǎo)的基因失活方法抑制了C. autoethanogenum丁二醇合成途徑中乙酰乳酸脫羧酶基因（budA）的表達(dá)，提高了乙醇產(chǎn)量[86]。另一項(xiàng)研究表明，在C. autoethanogenum中抑制乳酸脫氫酶基因（ldhA）同樣使乙醇產(chǎn)量得到了提高[86]。此外，產(chǎn)物毒性也會(huì)制約菌株的合成能力。為減弱高濃度乙醇對(duì)于菌株的抑制作用，研究者們?cè)贑. autoethanogenum中過(guò)表達(dá)了兩個(gè)與蛋白折疊相關(guān)的輔因子GroES 和GroEL，有效提高了菌株對(duì)乙醇的耐受能力[86]。

值得一提的是，在最近的一項(xiàng)研究中，新西蘭朗澤公司聯(lián)合多家研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種針對(duì)食氣梭菌的產(chǎn)物合成途徑體外測(cè)試方法（iPROBE）?；谠摲椒?，研究者先后實(shí)現(xiàn)了3?羥基丁酸、丙酮、丁醇、己醇等產(chǎn)物途徑關(guān)鍵酶的體外測(cè)試和優(yōu)化，并將最優(yōu)途徑轉(zhuǎn)化到梭菌宿主中表達(dá)，成功實(shí)現(xiàn)了上述產(chǎn)物的高效合成[87?88,90]，產(chǎn)量分別達(dá)到15g/L、5.8g/L、1.6g/L 和0.26g/L；其中，3?羥基丁酸的合成水平是已報(bào)道的合成氣發(fā)酵研究中最高的。

總體而言，目前的合成氣發(fā)酵生產(chǎn)長(zhǎng)碳鏈化合物的水平距離工業(yè)化應(yīng)用還有一定距離，在產(chǎn)量和和合成效率方面仍有待提升。

2.5 其他合成氣發(fā)酵微生物及改造優(yōu)化

如上所述，A. woodii也是主要的產(chǎn)乙酸菌，可以利用CO 和CO2作為碳源合成較高濃度的乙酸[13]。為了對(duì)該菌進(jìn)行有效的遺傳改造，研究者借鑒了梭狀芽孢桿菌的同框缺失方法[91]，使用pyrE基因依次作為正篩選和負(fù)篩選標(biāo)記來(lái)指示重組事件?；谠摲椒?，A. woodii中涉及糖轉(zhuǎn)運(yùn)和乙醇利用的基因被成功敲除[92]。

研究者也利用A. woodii合成了一些新產(chǎn)物。2016 年，Sabrina 等[93]將丙酮丁醇梭菌的丙酮合成途徑導(dǎo)入A. woodii中實(shí)現(xiàn)氣體發(fā)酵生產(chǎn)丙酮，在連續(xù)氣體發(fā)酵條件下的丙酮濃度最高達(dá)到52mmol/L。此外，也有研究者[94]在A. woodii中通過(guò)組合使用來(lái)自丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）和醋酸梭菌（Clostridium aceticum）的基因構(gòu)建了丙酮合成途徑，重組菌株在生產(chǎn)乙酸和丙酮的同時(shí)還生成了異丙醇，暗示該菌中含有可將丙酮合成途徑產(chǎn)生的丙酮催化為異丙醇的功能酶伯/二芳醇脫氫酶（sadh）。

合成氣中CO 對(duì)自養(yǎng)細(xì)菌的毒性是限制發(fā)酵效率的一個(gè)重要因素。產(chǎn)乙酸菌的生長(zhǎng)通常受到高濃度CO 的抑制。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Kang 等[95]應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化策略來(lái)增強(qiáng)E.limosum對(duì)CO的適應(yīng)能力。該菌在含有較高濃度CO 的合成氣條件下被連續(xù)傳代（150 代），最終能夠有效利用含CO的合成氣作為碳源支持其生長(zhǎng)。同時(shí)，為了探究導(dǎo)致上述表型變化的基因突變，研究者通過(guò)基因組測(cè)序結(jié)合遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)揭示了編碼CODH/ACS復(fù)合物亞單位的基因的突變導(dǎo)致了菌株對(duì)CO 適應(yīng)能力的增強(qiáng)?；谠撏蛔兙辏芯空邔?dǎo)入了合成乙偶姻所需的alsS和alsD基因，實(shí)現(xiàn)了比原始菌株更多的產(chǎn)物合成。

嗜熱菌在降低發(fā)酵過(guò)程染菌風(fēng)險(xiǎn)、提高底物溶解度以及提高代謝率和蛋白質(zhì)表達(dá)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。為評(píng)估嗜熱菌在一碳?xì)怏w利用方面的潛力，研究者通過(guò)同源重組將編碼α?淀粉酶的基因整合到超嗜熱羧基營(yíng)養(yǎng)型氫古細(xì)菌Thermococcus onnurineus的染色體上，實(shí)現(xiàn)其利用CO 發(fā)酵合成α?淀粉酶[96]。該工程菌株還可作為全細(xì)胞生物催化劑用于淀粉糖化[96]。此外，研究者在另一種嗜熱產(chǎn)乙酸菌Thermoanaerobacter kivui中發(fā)現(xiàn)了具有依賴氫氣作為還原力的CO2還原酶（HDCRs），可以催化CO2生成甲酸，并且甲酸鹽的滴度最高可達(dá)130mmol/L[97]。

3 合成氣發(fā)酵系統(tǒng)的優(yōu)化

為了利用已有設(shè)備實(shí)現(xiàn)最長(zhǎng)的生產(chǎn)時(shí)間從而節(jié)省單位產(chǎn)品的固定資產(chǎn)投資、設(shè)備維護(hù)成本等，工業(yè)規(guī)模的氣體發(fā)酵必然要采用連續(xù)發(fā)酵模式。連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器（continuous stirred?tank reactor，CSTR）是目前實(shí)驗(yàn)室使用較多的氣體反應(yīng)器，可通過(guò)機(jī)械攪拌將通入的氣體變成微小氣泡，從而增大氣液接觸面積，達(dá)到較好的氣液傳遞效果。與連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器相比，鼓泡塔反應(yīng)器通過(guò)噴射方式將氣體注入培養(yǎng)基，氣體分散效果較好，無(wú)需機(jī)械攪拌，具有良好的傳熱和傳質(zhì)效率[98]。除上述反應(yīng)器外，單片生物膜反應(yīng)器（monolithic biofilm reactors）和滴床生物反應(yīng)器也在合成氣的發(fā)酵中得以應(yīng)用[99]。其中，單片生物膜反應(yīng)器在常壓下運(yùn)行，可讓微生物依附在生物膜上生長(zhǎng)，無(wú)需對(duì)氣體進(jìn)行攪拌，降低了發(fā)酵能耗。在滴床反應(yīng)器中，液體培養(yǎng)基通過(guò)填充介質(zhì)向下流動(dòng)，而合成氣可以向下（共流）或向上（逆流）移動(dòng)，培養(yǎng)基和發(fā)酵氣體可不需要機(jī)械攪拌自發(fā)混合，從而顯著降低能耗[100]。

研究者還借鑒了化工中流化床和固定床的概念，采用填料在厭氧反應(yīng)器中固定化Moorella thermoacetica進(jìn)行氣體發(fā)酵。數(shù)據(jù)表明，在采用海藻酸鈣包埋法固定化細(xì)胞進(jìn)行的半連續(xù)發(fā)酵中，乙酸濃度可達(dá)32.3g/L，乙酸平均空時(shí)產(chǎn)率達(dá)3.20g/(L·d)[101]。采用固定化細(xì)胞進(jìn)行合成氣發(fā)酵，不僅提高了菌體的重復(fù)利用率，而且簡(jiǎn)化了細(xì)胞和產(chǎn)物的分離工序[101]。

氣液傳質(zhì)效率是一碳?xì)怏w發(fā)酵的主要限速步驟之一。高效的氣液傳質(zhì)效率是氣體生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)的關(guān)鍵，給予更多的能量供體、加快氣體流通速度或增加發(fā)酵罐內(nèi)壓力等均可以提升氣液傳質(zhì)效率。目前，微氣泡分散技術(shù)在合成氣發(fā)酵中被廣泛應(yīng)用。微氣泡又稱膠體氣泡，平均直徑約為50μm，遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)生物反應(yīng)器中的氣泡直徑（3～5mm），因此可顯著提升氣液傳質(zhì)效率[102]。此外，為了解決食氣梭菌發(fā)酵中的低生物量問(wèn)題，研究者在氣體發(fā)酵裝置中加入一些吸附菌體的填料和介質(zhì)來(lái)提升細(xì)胞密度。例如，采用中空纖維膜富集細(xì)胞，可有效提高發(fā)酵氣體時(shí)的丙酮產(chǎn)量[82]。

發(fā)酵優(yōu)化如改良培養(yǎng)基以及過(guò)程控制對(duì)于氣體發(fā)酵同樣重要。雖然化能自養(yǎng)細(xì)菌以CO、CO2、H2為碳源和能源，但仍需要其他成分如維生素、微量元素、礦物質(zhì)元素和還原劑等保持菌種的代謝活性[26,103?106]。例如，Kundiyana 等[107]在C. carboxidivoransP7 的培養(yǎng)基中使用棉花籽提取物替代酵母提取物等成分，使得合成氣發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量得到明顯提高。其他的一些有效策略還包括：調(diào)整培養(yǎng)基中的微量金屬離子濃度能夠提高某些金屬離子依賴的氧化還原酶的活力，可提升食氣梭菌中乙醇的產(chǎn)量[108]；優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中各礦質(zhì)元素的濃度，同時(shí)采用低溫培養(yǎng)的方式能提高食氣梭菌的產(chǎn)物合成能力[26]；在培養(yǎng)基中加入還原劑，如甲基紫精、Na2S 以及生物碳等也能顯著提升菌株的氣體發(fā)酵水平[109?111]。在培養(yǎng)基中添加少量甲醇可促進(jìn)Eubacterium limosum對(duì)合成氣的利用效率[112]；調(diào)整合成氣中的氫氣和一氧化碳的配比會(huì)顯著影響發(fā)酵產(chǎn)物中的有機(jī)酸/醇的比例[113]。此外，pH和溫度等對(duì)食氣梭菌的生長(zhǎng)也有重要的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在pH=6.8時(shí)，C. ljungdahlii的細(xì)胞密度和乙醇產(chǎn)量均高于pH=5.5 時(shí)的水平[114]。食氣梭菌最適生長(zhǎng)溫度在30～40℃之間，培養(yǎng)溫度不僅影響底物利用率、生長(zhǎng)率和膜脂組成，而且影響氣體碳源在培養(yǎng)中的溶解度。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度雖然會(huì)造成食氣梭菌生長(zhǎng)速率的一定延遲[115?116]，但最終的產(chǎn)物合成量相對(duì)于常規(guī)培養(yǎng)溫度有顯著提高。例如，研究者發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)溫度從37℃降至30℃時(shí)，C. carboxidivoransP7發(fā)酵合成氣的己醇產(chǎn)量顯著升高[117]，這一現(xiàn)象背后的分子機(jī)制尚待解析。

4 結(jié)語(yǔ)

綠色生物制造從根本上改變了傳統(tǒng)制造業(yè)加工模式的弊端，是工業(yè)可持續(xù)發(fā)展最有希望的領(lǐng)域之一。富含CO2/CO 的合成氣生物轉(zhuǎn)化代表著綠色生物制造領(lǐng)域的前沿技術(shù)，引領(lǐng)了新一代的生物制造產(chǎn)業(yè)模式，對(duì)于提升我國(guó)生物制造產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展能力意義重大。此外，從全生命周期分析的角度來(lái)看，利用各種來(lái)源的合成氣（如工業(yè)廢氣和氣化生物質(zhì)）進(jìn)行發(fā)酵是接近“零碳”甚至是“負(fù)碳”的技術(shù)路線，即整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程的碳排放量極低甚至為負(fù)，這是與傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的最大區(qū)別之一，有望在助力我國(guó)“雙碳”目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

目前，合成氣生物發(fā)酵技術(shù)的研究取得長(zhǎng)足進(jìn)展，工業(yè)應(yīng)用已初具規(guī)模，但仍只局限于乙醇、乙酸等少數(shù)產(chǎn)品。因此，核心微生物底盤細(xì)胞和分子元件的開發(fā)與設(shè)計(jì)方面需要進(jìn)一步突破，從而解決基于合成氣的生物制造產(chǎn)業(yè)的瓶頸問(wèn)題，拓展產(chǎn)品種類，搶占這一生物制造領(lǐng)域的制高點(diǎn)。此外，不同來(lái)源的合成氣組成成分差異較大，通常含有一氧化碳、二氧化碳和氫氣中的一種或多種，并且還存在一些雜質(zhì)，比如烷烴、烯烴、焦油等。因此，在工藝和工程方面，需要針對(duì)不同的氣源，選擇適合的凈化設(shè)備，并調(diào)整優(yōu)化相應(yīng)的工藝參數(shù)，以實(shí)現(xiàn)較高的氣體轉(zhuǎn)化率和目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)率。在產(chǎn)品提取方面，也需要耦合微生物生長(zhǎng)和代謝的參數(shù)，優(yōu)化后處理方法，在過(guò)程中減少能耗，提高得率，兼顧效率和經(jīng)濟(jì)性?？傮w而言，今后需要針對(duì)合成氣生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的共性關(guān)鍵技術(shù)設(shè)置任務(wù)模塊，建立核心技術(shù)與裝備體系，并進(jìn)行基礎(chǔ)研究?技術(shù)創(chuàng)新?產(chǎn)業(yè)示范的全鏈條設(shè)計(jì)，從而為工業(yè)低碳/零碳制造提供新的示范。