王劉星，楊弘鑫，戴 禮，陳太春，梁百闖，王 黔,△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽 550001；2.鄂州市中心醫(yī)院，湖北鄂州 436000;3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，貴陽 550001)

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，全球每年新增胃癌病例數(shù)約為100萬，死亡病例數(shù)約為80萬，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排名第5位，死亡率排名第3位[1]。在我國，胃癌的發(fā)病率和死亡率分別位于所有惡性腫瘤的第2位和第3位，遠高于世界平均水平[2]。由于早期胃癌癥狀不典型，且我國高危人群胃癌篩查意識并不強烈，導(dǎo)致患者確診時已是進展期胃癌或有遠處轉(zhuǎn)移，標(biāo)準(zhǔn)的D2手術(shù)治療效果較差。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌術(shù)后低生存率的主要原因[3]。

循環(huán)腫瘤細胞(CTC)是原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移瘤之間銜接的重要“橋梁”，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。CTC從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤脫落，通過血液循環(huán)進行遷移。在遷移過程中，大多數(shù)CTC經(jīng)過失巢凋亡、受到血流剪切應(yīng)力的機械損傷及機體免疫細胞的消除，最終僅有<0.01%具有高轉(zhuǎn)移潛能的CTC可以存活，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，在遠處器官中形成新腫瘤[4-7]。腫瘤的進展與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)有關(guān)。EMT在CTC存在的各個過程中發(fā)揮著重要作用。CTC上皮標(biāo)志物表達在EMT過程中會發(fā)生下調(diào)、甚至消失，根據(jù)EMT標(biāo)志物的表達可將CTC分為上皮型[表達E鈣黏著蛋白、上皮細胞黏附分子(EpCAM)、細胞角蛋白(CK)等]、間質(zhì)型(表達N鈣黏著蛋白、波形蛋白、snail蛋白等)、混合型(同時表達上皮和間質(zhì)標(biāo)志物)。與上皮型CTC比較，間質(zhì)型CTC具有更強的侵襲轉(zhuǎn)移能力，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程起主要作用[8-10]。CTC是一種非侵入性液體活檢方法，已在乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中被證實與患者臨床病理特征及預(yù)后有關(guān)[11-13]。而關(guān)于CTC在胃癌的應(yīng)用，特別是CTC各表型在胃癌中的應(yīng)用研究極少。本研究分析外周血中CTC數(shù)目及其表型與胃癌臨床病理特征之間的相關(guān)性，探討CTC及其分型作為判斷胃癌預(yù)后標(biāo)志物的可行性?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年4月1日至2020年4月1日就診于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科并經(jīng)病理確診為胃癌的68例患者納入研究，其中男34例，女34例，平均年齡(55.0±12.3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～80歲；(2)術(shù)前胃鏡及活檢證實為胃癌，行根治性胃癌切除術(shù)；(3)術(shù)前未行抗腫瘤藥物治療；(4)主要臟器功能基本正常；(5)東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)評分為0～1分；(6)無嚴重并發(fā)癥；(7)自愿參與并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)非根治性胃切除治療的胃癌患者；(2)孕婦或哺乳期婦女；(3)主要臟器功能受損；(4)各種原因所致活動性出血的患者；(5)患有嚴重的急慢性疾病；(6)有嚴重感染性疾??；(7)臨床病理資料不全或失訪。

1.2 外周血CTC檢測及CTC鑒定

CTC檢測：術(shù)前當(dāng)天清晨7：00，空腹采集5 mL外周血，采用新的CTC分離富集技術(shù)分離，鑒定胃癌患者外周血中的CTC。樣本采集：準(zhǔn)備乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝采血管、樣本保存管和樣本采集連通器；使用8號采血針和EDTA抗凝采血管采集5 mL外周血；血樣采集后，將EDTA抗凝采血管上下顛倒混勻10次；揭開樣本采集連通器上的灰色標(biāo)簽；將EDTA抗凝采血管插入孔內(nèi)，使孔中針頭刺穿采血管橡膠塞；揭開樣本采集連通器上的紅色標(biāo)簽；將樣本保存管插入孔內(nèi)，使孔中針頭刺穿樣本保存管橡膠塞，EDTA抗凝采血管內(nèi)的血液將自動輸入樣本保存管內(nèi)；待樣本保存管內(nèi)的液面不再上升后，拔出樣本保存管，上下顛倒混勻10次；室溫放置30 min。CTC富集：離心去除上清液，固定劑固定8 min；通過真空歧管將過濾器與真空泵連接。將樣本保存管中的液體轉(zhuǎn)移至過濾器中。MRIA樣本制備：甲醛溶液室溫固定60 min。CTC鑒定和觀察：采用多重RNA探針，固定后的濾膜樣本使用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3次。加入特異性生物標(biāo)記探針EpCAM、CK8/18/19、間質(zhì)型生物標(biāo)記探針堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1(Twist)與波形蛋白(Vimentin)，以及白細胞標(biāo)志物CD45進行雜交，在40 ℃雜交反應(yīng)3 h。未結(jié)合探針用1 000 μL洗脫液[0.1×SSC(Sigma公司,美國)]洗滌3次。加入100 μL預(yù)擴增液[30%馬血清(Sigma公司,美國),1.5%十二烷基硫酸鈉(Sigma公司,美國),3 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 8.0)，0.5 fmol預(yù)擴增探針]，置于40 ℃孵育30 min，進行信號擴大探針反應(yīng)。將膜進行冷卻，用1 000 μL洗脫液洗脫3次(0.1×SSC)，然后與100 μL擴增溶液[30%馬血清,1.5%十二烷基硫酸鈉,3 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 8.0)，1 fmol預(yù)擴增探針]在40 ℃孵育30 min。加入3種標(biāo)記熒光蛋白，分別為熒光染料Alexa Fluor 594(用于標(biāo)記上皮生物標(biāo)記探針EpCAM、CK8/18/19)，Alexa Fluor 488(間質(zhì)型生物標(biāo)記探針Vimentin和Twist)及Alexa Fluor 750(用于標(biāo)記白細胞標(biāo)志物CD45)，置于40 ℃孵育30 min。用0.1×SSC進行洗脫，然后使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進行細胞核染色5 min，在油鏡(100×)下使用自動化熒光掃描顯微鏡，對樣本進行觀察。針對多種CTC特異性基因，通過不同顏色熒光信號，可進一步將CTC分型。其中Ⅰ型CTC顯示為紅色熒光信號點，Ⅲ型CTC顯示為綠色熒光信號點，而Ⅱ型CTC同時顯示紅色熒光及綠色熒光信號點，表達Ⅰ型和Ⅲ型特異性基因。

A：上皮型CTC圖，顯示紅色熒光信號；B：混合型CTC圖，顯示紅色和綠色混合熒光信號；C：間質(zhì)型CTC圖，顯示綠色熒光信號。

1.3 隨訪及預(yù)后監(jiān)測

定期對68例胃癌術(shù)后患者進行嚴格的隨訪。每3個月對出院的患者進行1次門診或電話隨訪。末次隨訪時間為2021年12月20日，術(shù)后隨訪時間3～44個月，中位隨訪時間28個月，截至末次隨訪日期，共有35例患者存活，33例患者死亡?？傮w生存期(OS)定義為手術(shù)后至患者因任何原因所致死亡。時間以月為單位統(tǒng)計，詳細記錄患者術(shù)后組織病理學(xué)資料、隨訪資料。隨訪內(nèi)容：血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、腹部彩色多普勒超聲、計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)，胃鏡、癌胚抗原、糖類抗原125(CA-125)及CA-199等。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CTC檢測結(jié)果

根據(jù)既往文獻[14-15]報道及本試驗結(jié)果，將CTC≥2個視為檢測結(jié)果陽性，CTC總數(shù)<2個視為檢測結(jié)果陰性，將各亞型CTC≥1個視為檢測結(jié)果陽性，各亞型CTC<1個視為檢測結(jié)果陰性。依據(jù)該判斷標(biāo)準(zhǔn)， 68例胃癌患者治療前外周血中，CTC檢出個數(shù)為0～80個，中位數(shù)為6個，CTC陽性患者56例，CTC陰性患者12例，陽性檢出率為82.4%(56/68)。而間質(zhì)型CTC檢出個數(shù)為0～11個，中位數(shù)為1個，間質(zhì)型CTC陽性患者35例，CTC陰性患者33例，陽性檢出率為51.5%(35/68)。

2.2 CTC及其表型與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系

胃癌患者治療前外周血CTC陽性與其年齡、性別、體重指數(shù)(BMI)、ECOG評分、腫瘤部位、腫瘤分化程度、有無癌結(jié)節(jié)、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)；而與臨床分期及浸潤深度明顯相關(guān)。見表1。胃癌患者治療前外周血上皮型CTC陽性與其年齡、性別、BMI、ECOG評分、腫瘤部位、腫瘤分化程度、有無癌結(jié)節(jié)、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、臨床分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)。胃癌患者治療前外周血間質(zhì)型CTC陽性與其年齡、性別、BMI、ECOG評分、腫瘤部位、腫瘤分化程度、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)；與有無癌結(jié)節(jié)、臨床分期、腫瘤浸潤深度明顯相關(guān)。見表2。因混合型為上皮型和間質(zhì)型復(fù)合形成，且各自所占比例不一，沒有可比性，本研究不作比較。

表1 CTC與胃癌臨床病理特征之間的相關(guān)性

表2 間質(zhì)型CTC與胃癌臨床病理特征之間的相關(guān)性

2.3 CTC及其表型與胃癌術(shù)后總生存率的關(guān)系

CTC總數(shù)陰性組患者死亡率為8.3%(1/12)，而CTC總數(shù)陽性組患者死亡率為57.1%(32/56)。CTC總數(shù)陰性組術(shù)后總生存率高于CTC總數(shù)陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)，見圖2。上皮型CTC陰性組患者死亡率為33.3%(8/24)，而上皮型CTC陽性組患者死亡率為56.8%(25/44)。上皮型CTC陰性組術(shù)后總生存率高于上皮型CTC陽性組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.069)，見圖3。間質(zhì)型CTC陰性組患者死亡率為21.2%(7/33)，平均總生存時間為38.3個月[95%置信區(qū)間(95%CI)=34.3～42.3]，間質(zhì)型CTC陽性組患者死亡率為74.3%(26/35)，平均總生存時間為19.2個月(95%CI=14.9～23.5)。間質(zhì)型CTC陰性組術(shù)后總生存率高于間質(zhì)型CTC陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖4。

圖2 胃癌患者CTC總數(shù)陰性組與陽性組術(shù)后

圖3 胃癌患者上皮型CTC陰性組與陽性組術(shù)后

圖4 胃癌患者間質(zhì)型CTC陰性組與陽性組術(shù)后

3 討 論

CTC檢測是液體活檢最主要的組成之一，也是推動腫瘤精準(zhǔn)診療的新技術(shù)。與普通侵入式的組織活檢及細胞學(xué)檢查相比，CTC檢測具有一系列優(yōu)勢，如標(biāo)本獲取容易、可反復(fù)檢測等。與循環(huán)腫瘤核酸(ctDNA)比較，CTC作為完整的腫瘤細胞，可分析的內(nèi)容多、獲取的基因信息全面，是與組織活檢一致性最高的液體活檢手段[16]；CTC也可以在體外進行腫瘤細胞的分析[17]。CTC在EMT的幅度上表現(xiàn)出了相當(dāng)程度的表型異質(zhì)性，但CTC各亞型在胃癌中的應(yīng)用研究極少。本研究從CTC的EMT分型著手，探索CTC及其EMT分型與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

既往有關(guān)于CTC與胃癌臨床病理特征相關(guān)性的研究，但這些研究得出的結(jié)論不盡相同，但總體而言，大多研究認為CTC與胃癌患者的年齡、性別、BMI、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤分化程度無明顯相關(guān)性，而與胃癌的臨床分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)[18-20]。本研究利用Canpatrol Ⅲ檢測技術(shù)檢測胃癌患者外周血中CTC[21-22]，該技術(shù)采用生物納米膜過濾法+多重mRNA熒光原位雜交方法，不依賴于生物標(biāo)志物，避免陽性生物富集方法漏檢已發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化表型的CTC,避免陰性生物富集方法漏檢與白細胞相互作用的CTC。結(jié)果顯示，CTC在Ⅰ期和Ⅱ～Ⅲ期胃癌患者中的檢出率分別為63.2%和89.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。為進一步探討原發(fā)腫瘤浸潤程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與CTC檢出率有無相關(guān)性，本研究對TNM分期進一步細化，分析不同T分期和N分期與CTC檢出率的關(guān)系。原發(fā)腫瘤為T1～T2和T3～T4期患者CTC檢出率分別為66.7%和90.9%，兩組間CTC檢出率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.030)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否的CTC檢出率分別為72.4%和89.7%，但兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.064)。這與HUANG等[23]的meta分析結(jié)果類似，該研究者納入了包含2 566例胃癌患者的26項研究用于分析，發(fā)現(xiàn)CTC在Ⅰ/Ⅱ期患者中的檢出率明顯低于Ⅲ/Ⅳ期患者(OR=0.39，95%CI為0.23～0.67)。ZHENG等[24]同樣發(fā)現(xiàn)，CTC陽性率和胃癌TNM分期、T分期明顯相關(guān)。但楊艷麗等[25]研究發(fā)現(xiàn)，CTC與胃癌患者是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P=0.034)，這與本研究結(jié)果相差較大。考慮產(chǎn)生這些結(jié)果的原因主要有：(1)CTC的檢測方法不同，不同的檢測方法會導(dǎo)致檢驗結(jié)果的敏感度和特異度均存在一定差異；(2)選擇截斷值存在一定差異；(3)研究樣本數(shù)量存在差異。另一方面，間質(zhì)型CTC比上皮型CTC具有更強的轉(zhuǎn)移侵襲能力和耐藥能力，故本研究進一步細化CTC各亞型與胃癌臨床病理特征之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)間質(zhì)型CTC檢出同樣與胃癌的TNM分期、T分期明顯相關(guān)，而上皮型CTC的檢出與胃癌的TNM分期、T分期無明顯相關(guān)性，可能提示了間質(zhì)型CTC在CTC各亞型中的重要性。

在腫瘤的轉(zhuǎn)移中，EMT在促進靜止腫瘤細胞的遷移和侵襲等部分具有關(guān)鍵作用[26]。在EMT的形成過程中，上皮細胞將失去上皮特性，出現(xiàn)間質(zhì)特征，例如鈣黏蛋白、Vimentin、Twist和纖維連接蛋白將過度表達，從而導(dǎo)致其侵襲能力增強[27]。已有證據(jù)表明，間質(zhì)型CTC與轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療結(jié)果間存在關(guān)聯(lián)[28]。HIRAIWA等[29]在44例胃癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性疾病患者的CTC數(shù)量明顯高于局限性疾病患者。但作者并未深入探討各患者CTC分型及其數(shù)目。由于CTC具有異質(zhì)性，僅進行CTC總計數(shù)的預(yù)測價值有限，有必要鑒定CTC各亞型的數(shù)量。此外，間質(zhì)型CTC在胃癌中的預(yù)后價值極少被研究，也未發(fā)布相關(guān)指南或共識來指導(dǎo)其在胃癌臨床實踐中的應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)，單純的CTC檢出并不能較好地預(yù)測腫瘤患者的疾病轉(zhuǎn)歸，間質(zhì)型CTC的檢出可能更加重要。一篇針對乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)[30]，在接受治療的乳腺癌緩解病例中，仍有部分患者CTC數(shù)量呈增多趨勢，但間質(zhì)型CTC卻呈減少趨勢，另有患者治療后CTC數(shù)量呈減少趨勢，但間質(zhì)型CTC卻呈增多趨勢，最終疾病出現(xiàn)臨床進展。這提示間質(zhì)型CTC在預(yù)測乳腺癌預(yù)后中的重要作用。本研究中，上皮型CTC陰性組術(shù)后總生存率高于上皮型CTC陽性組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.069)；CTC總數(shù)陰性組術(shù)后總生存率高于CTC總數(shù)陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)；間質(zhì)型CTC陰性組術(shù)后總生存率高于間質(zhì)型CTC陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。死亡患者外周血間質(zhì)型CTC計數(shù)高于存活患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。大多數(shù)CTC在外周血液循環(huán)中發(fā)生凋亡，從而被免疫系統(tǒng)清除，只有極少數(shù)CTC才能存活下來并形成轉(zhuǎn)移，而這部分存活并形成轉(zhuǎn)移的CTC絕大多數(shù)是間質(zhì)型CTC或循環(huán)腫瘤微栓子(CTM)。由于CTC侵襲轉(zhuǎn)移能力是由EMT賦予[31]，因此，對CTC分型特別是間質(zhì)型CTC進行檢測，能更加精準(zhǔn)地評估胃癌患者。

本研究利用Canpatrol Ⅲ CTC檢測技術(shù)檢測胃癌患者的CTC計數(shù)及其分型，分析了CTC及其表型的檢出水平與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，比較了間質(zhì)型CTC的檢出與胃癌患者總生存期的關(guān)系。結(jié)果表明，CTC及間質(zhì)型CTC可以作為胃癌輔助分期的指標(biāo)，間質(zhì)型CTC檢出水平與胃癌患者的預(yù)后相關(guān)。但本研究樣本量小，隨訪時間較短，還需對研究對象進行長期隨訪，有待下一步對CTC及其分型用于動態(tài)監(jiān)測患者治療有效性及疾病進展情況等方面的研究。