胡愈炘，金 磊，劉 威，譚慶軍，梅增榮，胡 圣，王英才，熊少凱，鄧 玥

(1.生態(tài)環(huán)境部長江流域生態(tài)環(huán)境監(jiān)督管理局 生態(tài)環(huán)境監(jiān)測與科學(xué)研究中心，武漢 430010； 2.華能瀾滄江水電股份有限公司，昆明 650214； 3.云南啟迪實業(yè)發(fā)展有限公司，昆明 650214)

1 研究背景

瀾滄江，境外稱為湄公河，是發(fā)源于青海唐古拉山北麓查加日瑪，流經(jīng)中國、緬甸、老撾、泰國、柬埔寨和越南的國際大河，其水資源、水能資源極其豐富，戰(zhàn)略地位重要[1]。瀾滄江在我國境內(nèi)河長2 161 km，流域面積16萬多km2[2]。近年來瀾滄江干流梯級電站的開發(fā)形成了梯級庫群，導(dǎo)致河流水文情勢發(fā)生改變[3]，河流生態(tài)連續(xù)性的改變導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境改變，對瀾滄江浮游生物的群落組成和空間分布產(chǎn)生了較大影響[4-5]。

浮游生物是水體中營浮游生活的微小生物，在能量流動和物質(zhì)循環(huán)中起重要作用，其多樣性和群落特征能夠反映生態(tài)環(huán)境優(yōu)劣[6]。浮游生物分為原核和真核兩類，其中原核浮游生物包括細(xì)菌、藍(lán)藻和放線菌等。程豹等[5]基于16S rRNA高通量測序技術(shù)探究了瀾滄江流域浮游細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)自然河道段和水庫段浮游細(xì)菌多樣性和驅(qū)動因子存在顯著差異。真核浮游生物主要包括浮游植物和浮游動物，浮游植物的群落結(jié)構(gòu)組成對環(huán)境具較強(qiáng)指示作用[7]，浮游動物在水域生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化、能量流動、信息傳遞過程中發(fā)揮著重要作用[8]。目前瀾滄江真核浮游生物群落研究主要集中于浮游植物，例如孫勝浩等[9]研究了瀾滄江硅藻的地理分布模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硅藻的分布存在顯著的空間差異；朱海濤等[10]利用浮游植物群落結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)對瀾滄江進(jìn)行水質(zhì)評價，數(shù)據(jù)顯示瀾滄江源區(qū)水生態(tài)狀況整體優(yōu)良；殷大聰?shù)萚11]對瀾滄江源區(qū)浮游植物進(jìn)行調(diào)查和分析，據(jù)此發(fā)現(xiàn)江源地區(qū)水環(huán)境狀況較好。

本研究基于18S rRNA宏條形碼技術(shù)研究瀾滄江真核浮游生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化，該技術(shù)能夠深入挖掘真核浮游生物的多樣性[12]，以充分探討空間差異下不同真核浮游生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性，以期為瀾滄江生態(tài)環(huán)境保護(hù)提供參考依據(jù)。

2 材料方法

2.1 研究區(qū)域與樣品采集

2020年10月在瀾滄江進(jìn)行樣品采集，共布設(shè)了36個樣點，采樣區(qū)域涵蓋瀾滄江自源區(qū)至下游近2 000 km的范圍，樣點布設(shè)如圖1所示。

圖1 瀾滄江樣點分布Fig.1 Location of sampling sites in the Lancang River

對于環(huán)境DNA樣品，采用高壓滅菌處理后的采水器采集1.5 L表層水樣，使用0.2 μm聚碳酸酯濾膜(Whatman)真空抽濾，每次抽濾前使用次氯酸鈉對抽濾裝置進(jìn)行浸泡消毒，洗凈后進(jìn)行抽濾。抽濾后將濾膜裝于液氮中運(yùn)輸至實驗室，使用DNA提取試劑盒(Mobio)提取DNA，在液氮中保存DNA。

對于水質(zhì)樣品，利用YSI多參數(shù)水質(zhì)測量儀(Xylem)現(xiàn)場測量每個樣點的水溫、pH值、溶解氧(DO)、電導(dǎo)率(EC)等水質(zhì)指標(biāo)。水體總磷(TP)、總氮(TN)、硝酸鹽(NO3-N)等環(huán)境因子的測定參照《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)。堿度(A)的測定參照《堿度(總堿度、重碳酸鹽和碳酸鹽)的測定》(SL 83—1994)。

2.2 高通量測序及生物信息學(xué)分析

采用引物5’-CCAGCASCYGCGGTAATTCC-3’和5’-ACTTTCGTTCTTGATYRA-3’進(jìn)行18S rRNA V4區(qū)擴(kuò)增[13]。PCR采用20 μL反應(yīng)體系，包括4 μL的5×FastPfu Buffer(反應(yīng)緩沖液)、2 μL的2.5 mM dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)、正向和反向引物各0.8、0.4 μL的FastPfu Polymerase(聚合酶)、0.2 μL的BSA(牛血清白蛋白溶液)溶液、10 ng的DNA模板，然后使用ddH2O(雙蒸水)補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s(25個循環(huán))；最后72 ℃延伸10 min。每個樣品進(jìn)行3次PCR技術(shù)重復(fù)，以無菌水作為陰性對照，陰性對照無可見擴(kuò)增，將3份產(chǎn)物混合后采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫后，再用2%瓊脂糖電泳檢測。使用Miseq建庫試劑盒(TruSeqTM DNA Sample Prep Kit)進(jìn)行文庫的構(gòu)建，庫檢合格后使用MiSeq PE300平臺(Illumina)進(jìn)行上機(jī)測序。

測序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)使用FastQC(http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)進(jìn)行質(zhì)控，使用Cutadapt v1.17軟件去除接頭序列[14]，使用USEARCH v11.0.667軟件進(jìn)行雙端序列拼接[15]，基于QIIME軟件在97%的相似水平下進(jìn)行OTU(Operational Taxonomy Unit)的聚類，通過樸素貝葉斯分類器將OTU序列比對至Silva數(shù)據(jù)庫(Release138 http：//www.arb-silva.de)進(jìn)行OTU注釋[16]。α多樣性、空間差異分析及RDA(Redundancy Analysis)分析等使用R語言中的vegan包計算[17]。

3 結(jié)果與討論

3.1 測序結(jié)果

使用Miseq高通量平臺對36個樣品進(jìn)行測序，獲得的原始序列數(shù)目為49 955～74 777條，平均為67 693條；各樣品原始序列長度為368～382 bp，平均為376 bp?；?7%的相似度一共獲取了1 269個OTU，涵蓋45門284屬。OTU聚類情況如圖2(a)所示，聚類出的OTU數(shù)目為104～593個，其中L2點位聚類出的OTU數(shù)量最少(104個)，L10點位聚類出的OTU數(shù)量最多(593個)。聚類出OTU數(shù)量>400的點位主要位于L6—L14區(qū)域，而OTU數(shù)量<400的點位則在整個瀾滄江均有分布。

從每個樣本中隨機(jī)抽取序列，統(tǒng)計每次隨機(jī)抽取序列中包含的OTU數(shù)量(OTU的數(shù)量即種類數(shù)，代表著物種豐富度)，據(jù)此構(gòu)建稀釋性曲線，結(jié)果如圖2(b)所示。圖2(b)中每一條曲線代表一個樣本，隨著隨機(jī)抽取序列數(shù)的增加，每個樣本統(tǒng)計得到的OTU數(shù)量逐漸增加。當(dāng)隨機(jī)抽取序列數(shù)目在40 000條以上時，樣本統(tǒng)計得到的OTU數(shù)量不再顯著增加，意味著更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，說明本次測序深度合理[18]，能夠覆蓋絕大多數(shù)的多樣性。

圖2 各樣點OTU注釋結(jié)果Fig.2 OTU annotation results of sampling sites

3.2 真核浮游生物群落的空間差異分析

真核浮游生物群落各樣點的空間差異分析見圖3?；讦露鄻有苑治鰹憸娼婧烁∮紊锏目臻g差異，非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling，NMDS)結(jié)果如圖3(a)所示，其中每個點代表一個樣本，各點距離越近，差異越小。L1—L10樣本形成一個分組，L11—L23樣本形成一個分組，L24—L36樣本形成一個分組。NMDS平均脅強(qiáng)系數(shù)(Stress)為0.092 7，在0.05和0.1之間，表明結(jié)果可信[19]。L1—L10位于瀾滄江上游，該區(qū)域為自然河道段，平均水溫為4 ℃，平均流速為0.33 m/s；L11—L23位于瀾滄江中游，該區(qū)域處于烏弄龍電站和功果橋電站之間，平均水溫為14 ℃，62.5%的點位顯示平均流速為0.41 m/s，37.5%的點位水面平靜導(dǎo)致流速無法測量；L24—L36位于瀾滄江下游，包括了功果橋電站及以下區(qū)域，平均水溫為20 ℃，現(xiàn)場監(jiān)測結(jié)果顯示下游所有點位均流速過緩，低于檢出下限，其水體流速相對中游明顯更緩；3個區(qū)域在水體自然狀態(tài)上有明顯區(qū)別，較好地體現(xiàn)了真核浮游生物群落在上、中和下游的空間差異。

圖3 各樣點的空間差異分析Fig.3 Spatial differences of sampling sites

基于相似性分析(analysis of similarities，ANOSIM)驗證分組結(jié)果的統(tǒng)計顯著性，如圖3(b)所示。其中“組間”代表組間樣品的兩兩差異，其他3組代表各組組內(nèi)兩兩差異的波動范圍。結(jié)果顯示組間差異大于組內(nèi)差異，中游區(qū)域的樣本間異質(zhì)性相對較大?？傮w分組R2=0.683>0，P=0.001<0.05，說明不同分組間差異顯著。

根據(jù)分組信息統(tǒng)計各組得到的OTU種類如圖3(c)所示。上游特有OTU占比14%，共有OTU占比61%；中游特有OTU占比3%，共有OTU占比57%；下游特有OTU占比8%，共有OTU占比64%；上、中、下游共有OTU占比更多而特有OTU占比較少。由此可見，特有物種造成的差異不是瀾滄江上、中、下游分組的根源，因此需進(jìn)一步開展多樣性和群落組成分析。

3.3 瀾滄江真核浮游生物群落不同空間的α多樣性

基于α多樣性分析瀾滄江真核浮游生物群落在上、中、下游的差異。Shannon-Wiener指數(shù)能夠反映生物群落整體的多樣性，Pielou均勻度指數(shù)能夠反映群落組成的均勻程度[20]，Chao1指數(shù)能夠反映群落中的豐富度[21]，各分組3個指數(shù)的結(jié)果如圖4所示，其中***表示P≤0.001，**表示P≤0.01，NS表示差異不顯著。

圖4 瀾滄江真核浮游生物群落的α多樣性Fig.4 The α diversity of eukaryotic plankton community in the Lancang River

上游的Shannon-Wiener指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)均顯著高于中下游，但三者的Chao1指數(shù)無顯著差異，說明3個區(qū)域物種豐富度無顯著差異，但上游浮游生物組成最為均勻，因此具有最高的多樣性；中游和下游的Shannon-Wiener指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)和Chao1指數(shù)均不具顯著差異，說明兩個區(qū)域的浮游生物多樣性狀況類似。由于瀾滄江干流梯級電站的位置主要分布于中下游，電站的開發(fā)改變了河流自然生態(tài)系統(tǒng)狀況，因此不僅可能造成中游和下游兩個區(qū)域浮游生物多樣性的類似，也可能造成中下游浮游生物多樣性與上游多樣性的差異。

3.4 瀾滄江真核浮游生物群落的空間分布

為探究真核浮游生物群落在瀾滄江各區(qū)域的空間分布情況，在門的分類學(xué)水平上基于熱圖展示了各類群在各樣點的相對豐度情況，結(jié)果如圖5(a)所示；參照Levins生態(tài)位寬度的概念計算各類群的生態(tài)位寬度[22]，結(jié)果如圖5(b)所示。

圖5 瀾滄江真核浮游生物群落的空間分布Fig.5 Spatial distribution of eukaryotic plankton community in the Lancang River

隱藻門(Cryptophyta)是瀾滄江真核浮游生物中相對豐度最大的一個門，主要分布于瀾滄江的下游及中游少數(shù)區(qū)域，其生態(tài)位寬度排在所有類群中的前五。這與之前的研究結(jié)果相一致，隱藻能夠廣泛分布的主要原因在于能夠適應(yīng)各種類型的水體而且不存在季節(jié)特異性[23]。

金藻門(Chrysophyta)和硅藻門(Bacillariophyta)主要分布于瀾滄江的上游，生態(tài)位寬度分別為第七和第五，也屬于分布較為廣泛的類群。其中金藻門多分布于溫度相對較低的水體中[24]，而本次調(diào)查中上游的平均水溫為3.7 ℃，中下游的平均水溫為16.4 ℃，因此水溫可能是其分布差異的重要原因之一。硅藻門的分布結(jié)果則與之前的研究結(jié)果相一致[9]。

纖毛門(Ciliophora)是瀾滄江真核浮游生物中生態(tài)位最寬的一個類群，該類群廣泛分布于瀾滄江的上、中、下游。該類群是微食物網(wǎng)的重要組成部分，廣泛分布于各類水體中，其分布格局由多種環(huán)境因子共同決定[25]。

3.5 瀾滄江真核浮游生物群落對環(huán)境的響應(yīng)

使用除趨勢對應(yīng)分析(Detrended Correspondence Analysis，DCA)分析門水平上的浮游生物群落數(shù)據(jù)，結(jié)果排序軸長度<3，因此使用線性模型探究瀾滄江真核浮游生物群落對環(huán)境的響應(yīng)。對浮游生物群落數(shù)據(jù)進(jìn)行Hellinger轉(zhuǎn)換后進(jìn)行冗余分析(RDA)。根據(jù)方差膨脹系數(shù)衡量環(huán)境因子中的多重共線性，篩選后使用的環(huán)境因子包括：溶解氧(DO)、水溫(Temp)、pH、電導(dǎo)率(EC)、堿度(A)、銨鹽(NH4-N)、總磷(TP)、正磷酸鹽(PO4-P)、總氮(TN)、硝酸鹽氮(NO3-N)和二氧化硅(SiO2)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 瀾滄江真核浮游生物群落對環(huán)境的響應(yīng)Fig.6 Response of eukaryotic plankton community to environmental factors in the Lancang River

RDA所有約束軸的全模型置換檢驗P值為0.001，說明RDA分析結(jié)果可信。分析使用的環(huán)境因子中，水溫(Temp)和堿度(A)的R2最大(分別為0.64和0.52)，是對瀾滄江真核浮游生物群落影響較大的環(huán)境因子。水溫是被廣泛認(rèn)為能夠影響浮游生物分布的重要環(huán)境因子；堿度是指水中所含有的能與氫離子相化合的物種含量，包括重碳酸鹽堿度、碳酸鹽堿度和氫氧化物堿度等，堿度可能會對浮游生物產(chǎn)生毒性[26]，或者影響浮游生物對無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)的同化[27]，從而影響浮游生物的生命活動。

根據(jù)Mantel Test對環(huán)境因子和不同區(qū)域(上、中、下游)種水平上的真核浮游生物群落組成進(jìn)行相關(guān)性檢驗，不同區(qū)域受影響較大的環(huán)境因子各有不同，如表1所示。對于上游，銨鹽(R2=0.56，P=0.02)和電導(dǎo)率(R2=0.58，P=0.04)相關(guān)性顯著，根據(jù)R2發(fā)現(xiàn)電導(dǎo)率是對真核浮游生物群落影響較大的環(huán)境因子。對于中游，溶解氧(R2=0.33，P=0.02)、水溫(R2=0.34，P=0.02)和堿度(R2=0.26，P=0.05)相關(guān)性顯著，根據(jù)R2發(fā)現(xiàn)水溫是對真核浮游生物群落影響相對較大的環(huán)境因子；對于下游，水溫(R2=0.59，P=0.00)、電導(dǎo)率(R2=0.60，P=0.00)、堿度(R2=0.27，P=0.04)、銨鹽(R2=0.39，P=0.04)、總磷(R2=0.70，P=0.01)、硝酸鹽氮(R2=0.35，P=0.01)和二氧化硅(R2=0.61，P=0.01)相關(guān)性顯著，根據(jù)R2發(fā)現(xiàn)總磷對真核浮游生物群落影響相對較大。

表1 基于Mantel Test的真核浮游生物群落組成與環(huán)境因子相關(guān)性Table 1 Correlation between eukaryotic plankton community composition and environmental factors based on Mantel Test

4 結(jié) 論

在瀾滄江進(jìn)行真核浮游生物群落調(diào)查，基于18S rRNA宏條形碼技術(shù)從空間差異、群落組成和環(huán)境響應(yīng)等方面進(jìn)行了分析，得到以下結(jié)論：

(1)瀾滄江真核浮游生物群落可以劃分為3個分組，包括：上游(自然河道段)、中游(位于水電站烏弄龍和功果橋之間的區(qū)域)和下游(功果橋電站及以下區(qū)域)，不同類型群落的組間差異要大于組內(nèi)差異，且差異顯著。

(2)上游真核浮游生物群落組成是3個區(qū)域中最為均勻的，金藻門和硅藻門是該區(qū)域分布較為廣泛且相對豐度較高的類群，電導(dǎo)率是對該區(qū)域影響較大的環(huán)境因子；中游和下游的浮游生物多樣性類似，隱藻門是中下游分布較為廣泛且相對豐度較高的類群，對中游和下游影響較大的環(huán)境因子分別是水溫和總磷。

(3)對于整個瀾滄江而言，水溫和堿度是本次測定的所有環(huán)境因子中對真核浮游生物群落有重要影響的因子，纖毛門是分布最為廣泛且相對豐度較高的類群。