余子潔,郭大陸,李致同,羅紅燕

(西南大學 資源環(huán)境學院,重慶 400715)

甲烷是一種比二氧化碳溫室效應(yīng)強約28倍的溫室氣體[1]，它在環(huán)境系統(tǒng)中的地位對地球氣候有著重要的影響。厭氧甲烷氧化(anaerobic oxidation methane，AOM)是一個全球重要的微生物過程，它阻止了自然沉積物中相當大比例的甲烷在大氣中釋放(在某些環(huán)境中85%)[2-4]。聯(lián)合國政府間氣候變化專門委員會報告指出全球稻田土壤排放的甲烷約為35～56 Tg，約占全球甲烷排放總量的25%[2]。過去，研究學者都認為甲烷的主要代謝途徑是好氧氧化反應(yīng)，但自從1976年REEBURGH[3]首次在卡里亞科海溝水域的沉積物中發(fā)現(xiàn)AOM反應(yīng)后，AOM反應(yīng)開始被廣泛研究[4-5]。隨著研究逐步深入和拓展，越來越多種類的AOM反應(yīng)被發(fā)現(xiàn)，同時AOM反應(yīng)也被證實是控制缺氧環(huán)境中甲烷通量的關(guān)鍵[6]?；诖耍疚膶OM類型、參與過程的微生物種類以及甲烷濃度等影響AOM的因子作一綜述，以期為進一步研究AOM過程在碳、氮、硫及金屬離子循環(huán)以及環(huán)境污染中的重要意義提供參考。

1 AOM類型及參與反應(yīng)的主要微生物分類

1.1 硫酸鹽還原型厭氧甲烷氧化反應(yīng)

(ΔG=-16.6 kJ/mol)

(1)

參與硫酸鹽還原型厭氧甲烷氧化反應(yīng)的微生物主要是一類隸屬于廣古菌門的厭氧甲烷氧化古菌(Anaerobic methanotrophic archaea,ANMEs)，通常分為3類：ANME-1，ANME-2a、ANME-2b、ANME-2c及ANME-3[12]。通過對厭氧甲烷氧化古菌16S rRNA和mcr A基因序列的多樣性檢測，發(fā)現(xiàn)這3類古菌彼此之間進化距離較遠，基因序列相似度為75%～92%[13]。ANME-1常發(fā)現(xiàn)于深海、火山口等區(qū)域，與甲烷八疊球菌(Methanosarcinales)和產(chǎn)甲烷微菌(Methanomicrobiales)相似[12]。ANME-2常被檢測于冷泉、垃圾填埋場、濕地、湖泊沉積物及稻田等地方，隸屬于甲烷八疊球菌 (Methanosarcinales)[4]。ANME-3在極端環(huán)境如冰原等地被檢測到，與產(chǎn)甲烷菌( Methanococcoides )相似[4]。

1.2 反硝化型厭氧甲烷氧化反應(yīng)

(ΔG=-765 kJ/mol)

(2)

(ΔG=-928 kJ/mol)

(3)

參與反硝化型厭氧甲烷氧化反應(yīng)的微生物主要是CandidatusMethylomirabilis oxyfera(M.oxyfera)[15]，隸屬NC10門菌，形態(tài)呈細桿狀、桿狀，通常以單細胞或團聚體的形式存在。ETTWING等[16-17]利用宏基因組方法檢測濕地沉積物內(nèi)M.oxyfera細菌后，發(fā)現(xiàn)可通過該菌內(nèi)部NO歧化酶直接將NO氧化成N2和O2。NO歧化酶是一種很古老的酶，可當做檢測不同生境M.oxyfera細菌的生物標記物[18]。

1.3 金屬離子型厭氧甲烷氧化反應(yīng)

金屬離子型厭氧甲烷氧化反應(yīng)是以Fe3+、Mn4+和Cr6+等金屬離子為電子受體耦合AOM。DICHRISTINA等[19]在1988年發(fā)現(xiàn)，自然界中有微生物在厭氧環(huán)境中，可以利用鐵錳氧化物為最終電子受體獲取能量。在2009年，BEAL等[20]在加利福尼亞EelRiver流域的河流底部沉積物中發(fā)現(xiàn)，有微生物可以在不存在硫酸鹽的情況下，實現(xiàn)厭氧甲烷氧化耦合Fe3+、Mn4+的還原[21-22]，反應(yīng)式如式(4)(5)所示。從熱力和動力學角度分析，金屬離子型比硫酸鹽還原型厭氧甲烷氧化反應(yīng)更容易發(fā)生。

(ΔG=-572.157 65 kJ/mol)

(4)

(ΔG=-789.917 65 kJ/mol)

(5)

這一點的發(fā)現(xiàn)成功拓寬了AOM的領(lǐng)域。在濕地厭氧環(huán)境中，以金屬離子為最終電子受體的AOM反應(yīng)也大量存在。有學者也分別在印度尼西亞Matano湖[23]和西伯利亞Baikal湖[24]底沉積物中均發(fā)現(xiàn)金屬離子型厭氧甲烷氧化反應(yīng)。NORDI等[25]在丹麥淡水湖沉積物中發(fā)現(xiàn)以Fe3+為最終電子受體的AOM反應(yīng)。姜怡如等[26]推測金屬離子型厭氧甲烷氧化反應(yīng)更容易發(fā)生在淡水區(qū)域或濕地區(qū)域。LU等[27]通過16S rRNA基因測序觀察發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)器內(nèi)發(fā)現(xiàn)加入Cr5+離子至還原后，ANME-2古菌數(shù)量大幅度增加，其中甲烷八疊球菌和紅球菌數(shù)量增加顯著，逐漸成為AOM反應(yīng)的優(yōu)勢菌群。但目前未有報道表明這兩種菌具有還原鉻的能力，因此推測ANME-2可還原Cr5+或者可耦合其他還原菌還原Cr5+。從現(xiàn)有的研究結(jié)果分析，金屬離子型厭氧甲烷氧化反應(yīng)中所參與的微生物主要是ANME-1、ANME-2、ANME-3及脫硫單胞菌屬等[28]。

2 AOM的影響因子

AOM是在無氧或者厭氧條件下，將CH4氧化成CO2的過程。影響AOM的因子有很多，本文結(jié)合國內(nèi)外對AOM的研究進展，主要對甲烷濃度、氧化還原電位、溫度、pH值及鹽度等幾個因子進行了總結(jié)。

2.1 甲烷濃度

CH4是發(fā)生AOM的基礎(chǔ)，是AOM唯一的電子供體，適當提高甲烷濃度對AOM有著促進的作用。PIMENOV等[29]研究結(jié)果表明，CH4濃度增加至640 μL/L時，AOM反應(yīng)速率比未添加樣品高出195倍，后有研究表明AOM反應(yīng)的最適甲烷濃度為1.4 mmol/L[30]。ORCUTT等[31]在墨西哥海灣研究中發(fā)現(xiàn)，甲烷濃度最大值區(qū)域與厭氧氧化峰值出現(xiàn)的區(qū)域相同。SINISCALCHI等[32]也證實提高甲烷濃度可以促進AOM的發(fā)生。SHEN等[33]通過對還原性河床進行實驗發(fā)現(xiàn)，AOM途徑的多樣性與甲烷濃度有關(guān)，甲烷濃度高時，AOM多樣性較大。張佩等[34]通過實驗證明水合物沉積物中溶解的甲烷濃度高于有機質(zhì)分解產(chǎn)生的甲烷濃度，因此水合物沉積物中AOM反應(yīng)速率較快。一般情況，甲烷濃度對AOM反應(yīng)具有一定的促進作用。

2.2 氧化還原電位

AOM是發(fā)生在厭氧的狀態(tài)下，依靠厭氧微生物進行的反應(yīng)，因此對氧氣濃度有嚴格的要求，LUESKEN等[35]研究表明氧氣的存在會抑制AOM。袁夢冬等[36]對M.oxyfera的cDNA序列分析發(fā)現(xiàn)氧氣濃度會抑制好氧甲烷氧化過程及反硝化NO還原酶NorZ2基因等。XU等[37]研究發(fā)現(xiàn)，不同深度的湖底沉積物檢測出功能基因主要分布在深層，而少量分布在淺層。由于淺層區(qū)域的湖水更接近于大氣，與空氣進行頻繁的氣體交換，湖水中氧容量較高，氧化還原電位較高。HE等[38]研究發(fā)現(xiàn)低氧氣含量的深層土壤中，M.oxyfera豐度較高于表層土壤。YANG等[39]檢測各項多樣性指數(shù)也存在氧氣含量較低的深層樣點要高于表層和淺層樣點的現(xiàn)象。但LOU等[40]利用厭氧甲烷氧化微生物處理含氧地下水中硝酸鹽的研究發(fā)現(xiàn)，以亞硝酸鹽為電子受體的厭氧甲烷氧化細菌在氧氣受限的條件下可以實現(xiàn)相對豐度的增加，而以硝酸鹽為電子受體的厭氧甲烷氧化古菌則會被淘汰，推測以亞硝酸鹽為電子受體的厭氧甲烷氧化細菌對氧氣有耐受性。因此，氧化還原電位的高低對AOM的影響理論尚待完善。

2.3 溫度

溫度的高低會直接影響微生物體內(nèi)酶的活性，進而影響微生物的代謝能力。在一定的溫度下，升高溫度有利于AOM反應(yīng)的進行。唐熒霜等[41]通過實驗證明溫度在25～35 ℃時，溫度升高會提高反應(yīng)速率，溫度達到35 ℃左右，AOM反應(yīng)速率最大，而溫度到達45 ℃時，AOM反應(yīng)速率最小。DEUTZMANN等[42]在4 ℃的湖泊沉積物中檢測到N-DAMO，表明厭氧甲烷氧化菌對低溫有一定的適應(yīng)性。溫度也影響著底物的傳輸效率。甲烷在水中的溶解度大小受溫度的影響，理論上溫度越低甲烷在水中的溶解度越高，AOM底物濃度越大。

2.4 pH值

不同pH值條件下的AOM反應(yīng)速率不同。目前已有研究表明，AOM富集培養(yǎng)最適合的pH值為6.0～8.0，但在pH值<5.0或pH值>9.0的環(huán)境中也可以檢測出有相關(guān)功能基因的微生物[43]。ZHU等[43]和HE等[44]均認為，pH值為7.6左右是AOM最適pH值，此時厭氧甲烷氧化菌的活性最強。趙榮等[45]發(fā)現(xiàn)調(diào)控pH值至8.5和9.5的堿性環(huán)境，此時反硝化厭氧甲烷氧化速率明顯降低?；诖?，本文推測厭氧甲烷氧化微生物在參與反應(yīng)過程中，菌體內(nèi)部酶如甲醇脫氨酶、亞硝酸鹽還原酶和NO歧化酶等更適宜中性環(huán)境。

2.5 鹽度

通過對厭氧甲烷氧化菌富集培養(yǎng)后，HE等[44]發(fā)現(xiàn)反硝化型厭氧甲烷氧化反應(yīng)最佳鹽度值為20 g/L，鹽度超過20 g/L時，AOM反應(yīng)活性會明顯受到抑制作用。唐良港等[46]的實驗研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽度從0 g/L逐漸升至15 g/L時，厭氧甲烷氧化菌對亞硝酸鹽的還原速率明顯降低。在較高的鹽度環(huán)境中，甲烷的溶解量會降低。高鹽環(huán)境也影響參與厭氧甲烷氧化微生物體內(nèi)多種代謝酶的狀態(tài)，如甲醇脫氨酶、亞硝酸鹽還原酶等[46]，從而影響菌群的代謝活性。厭氧甲烷氧化菌對鹽度有良好的耐受能力，但濃度過高仍會對菌群產(chǎn)生抑制作用。

3 檢測AOM的現(xiàn)代技術(shù)方法

傳統(tǒng)微生物多樣性研究方法是將微生物從環(huán)境中分離后再于實驗室內(nèi)培養(yǎng)得到單菌株，對培養(yǎng)環(huán)境和儀器設(shè)備有較高要求，研究過程困難且獲得菌株極少。閔航等[47]首次在浙江象山市郊青紫泥水稻田土壤中分離到1株能獨立厭氧氧化甲烷的菌株，但有研究表明富集培養(yǎng)有限生境中甲烷厭氧氧化菌并不能充分描述甲烷厭氧氧化菌的多樣性[48]。隨著科技的不斷創(chuàng)新發(fā)展，現(xiàn)代分子生物學技術(shù)打破了傳統(tǒng)室內(nèi)培養(yǎng)的局限性，從分子水平客觀地揭示不同功能基因的厭氧甲烷氧化菌群的物種多樣性，有效地克服傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的不足，提高了分析檢測的速度及結(jié)果的準確性和完整性。

現(xiàn)代分子生物學技術(shù)包括熒光原位雜交技術(shù)、變性/溫度梯度凝膠電泳、高通量測序及宏基因組學等[11,49]。熒光原位雜交技術(shù)可建立克隆庫，在群落水平對環(huán)境中厭氧甲烷氧化菌物種進行鑒定、分析種群數(shù)量，操作簡便，測定靈敏。BOETIUS等[8]通過熒光原位雜交技術(shù)首次觀察到厭氧甲烷氧化古菌與硫酸鹽還原菌的共生體，并證明了其共生關(guān)系。RAGHOEBARSING等[14]同樣應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)鑒定了厭氧甲烷氧化菌與反硝化菌的共生體。

隨著研究深入，許多研究者將16S rRNA基因為標記基因，探究了不同環(huán)境中厭氧甲烷氧化古菌。16S rRNA基因測序可從群落水平角度分析和鑒定未知的厭氧甲烷化菌及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，16S rRNA相比于5S rRNA和23S rRNA，核苷酸數(shù)量適中、遺傳信息較多且應(yīng)用較廣泛[49]。朱群等[48]采用基因克隆文庫技術(shù)和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)考察了西湖底泥中反硝化厭氧甲烷氧化微生物，16S rRNA基因測序結(jié)果表明西湖底泥中有此類微生物。

宏基因組學是對環(huán)境中微生物的總基因組DNA進行研究，全面系統(tǒng)分析其組成、分類和發(fā)展進化規(guī)律，可提高發(fā)現(xiàn)新物種的概率。ARSLAN等[50]通過對AOM的富集培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)一種類似Methanoperedens古菌的基因組和轉(zhuǎn)錄組?，F(xiàn)代分子生物學檢測方法的廣泛應(yīng)用為研究自然生境中厭氧甲烷氧化菌的多樣性提供了技術(shù)支持，進一步促進了厭氧甲烷氧化菌多樣性及生態(tài)功能方面的研究[49]。

4 未來展望

AOM是全球氣候變化和元素循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，充分了解硫酸鹽還原型、反硝化型及金屬離子型等AOM的反應(yīng)機理、代謝途徑和實際應(yīng)用，有助于深入認識自然界物質(zhì)循環(huán)過程，對緩解全球氣候變暖和加強全球地球化學循環(huán)具有一定的積極作用。目前，對于AOM反應(yīng)研究仍處于初步階段，后續(xù)仍有很多問題有待解決。

1)拓寬研究區(qū)域。硫酸鹽還原型厭氧甲烷氧化反應(yīng)過程釋放能量較少，且多發(fā)現(xiàn)于硫酸鹽和甲烷交換地帶，是否也廣泛分布于淡水區(qū)域？近些年來由于過度使用氮肥，部分硝酸鹽和亞硝酸鹽隨著雨水滲透入土壤，使其在水稻田淹水層聚集。由于水稻田是甲烷匯，會釋放大量甲烷，因此為反硝化型厭氧甲烷氧化反應(yīng)提供良好的環(huán)境，并且仍有部分氮肥隨著地表徑流匯入河流，在河流底部沉積物中聚集。由于沉積物中有機質(zhì)含量較高，因此反硝化型厭氧甲烷氧化反應(yīng)也很容易發(fā)生。流失的氮肥通過河流、地下水等匯入海洋是否對入?？诘群Ｑ髤^(qū)域AOM產(chǎn)生影響？金屬離子型厭氧甲烷氧化反應(yīng)作為AOM的新類型，當前研究較少，未來可進一步對金屬離子型厭氧甲烷氧化反應(yīng)體系中，種間電子轉(zhuǎn)移機制和胞內(nèi)外電子與金屬離子之間的轉(zhuǎn)移機制進行研究。

2)尋找更多電子受體。目前，AOM過程可耦合硫酸鹽、亞硝酸鹽、硝酸鹽及鐵錳等金屬離子，是否還存在其他潛在的電子受體與其耦合？這些潛在受體的發(fā)現(xiàn)可拓寬目前對AOM的認識。

4)獲取純培養(yǎng)物。至今很多學者對厭氧甲烷氧化微生物進行富集和純培養(yǎng)，但獲取物仍較為有限[54]。為獲取純培養(yǎng)物，可進一步采用生物電化學的方法對微生物進行富集，確保得到較高富集度培養(yǎng)物或者純的培養(yǎng)物。

總之，AOM無論是在自然生境還是在實際應(yīng)用中，都具有顯著的環(huán)境生態(tài)效益。因此，AOM的相關(guān)研究仍是未來碳、氮、硫及金屬離子循環(huán)的研究熱點，可深入探究自然環(huán)境中的AOM以及其在實際環(huán)境工藝中的應(yīng)用。