郭 艷，陳松梅，張鐘文，劉環(huán)燚，劉 超

(樂山師范學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)創(chuàng)新研究中心,四川樂山 614004)

川澤瀉(Alismaplantago-aquaticaLinn.)屬澤瀉科澤瀉屬水生地道中藥，在福建、浙江、廣西和四川有廣泛分布，種植規(guī)模巨大，2018年產(chǎn)量約20 000 t，僅四川年產(chǎn)量最大，約11 000 t，廣西次之[1]。川澤瀉的藥用處理常采用炮制方法，利用率低，經(jīng)濟(jì)效益差，導(dǎo)致近年來種植戶積極性不高。四川澤瀉和廣西、福建澤瀉品質(zhì)有差異，有“川澤瀉”“廣澤瀉”和“建澤瀉”之稱[2-3]。劉紅昌等[4]和金立陽等[5]分別對(duì)四川澤瀉進(jìn)行了指紋圖譜研究，為川澤瀉和其他產(chǎn)區(qū)澤瀉品質(zhì)鑒定提供了依據(jù)。澤瀉富含澤瀉醇等有機(jī)物，具有利尿、抗結(jié)石、降血脂、降血糖和保肝等藥效，張慧娟等[6]通過澤瀉中有機(jī)化合物成分的分析，對(duì)澤瀉的生理應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)總結(jié)。除小分子有機(jī)化合物外，澤瀉藥用塊莖中富含蛋白質(zhì)，劉超等[7]從四川種植基地川澤瀉塊莖中分離出一種能使人紅細(xì)胞凝集的N-乙酰葡萄糖胺及其衍生物專一性結(jié)合含糖凝集素蛋白，分子質(zhì)量為22.45 kD，等電點(diǎn)pI為6.0。同時(shí)利用熒光淬滅技術(shù)[7]對(duì)川澤瀉凝集素生色基團(tuán)的分布進(jìn)行了初步研究，并用化學(xué)修飾的方法[8]對(duì)川澤瀉凝集素的凝集活性中心氨基酸組成和生物學(xué)構(gòu)象進(jìn)行了研究。不同來源的凝集素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和生理功能行駛要求不同的環(huán)境因素，特別是凝集素所處微環(huán)境的物理與化學(xué)因素對(duì)凝集素結(jié)構(gòu)和生理功能有明顯的影響，但物理和化學(xué)因素對(duì)川澤瀉凝集素凝集血細(xì)胞活性的影響鮮見報(bào)道。該研究探討了溫度、pH、金屬離子等不同物理和化學(xué)因素對(duì)該生物學(xué)活性的影響，為揭示凝集素生物學(xué)構(gòu)象及凝集活性與理化環(huán)境的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑試驗(yàn)用川澤瀉采自四川彭山謝家鎮(zhèn)和樂山五通橋冠英鎮(zhèn)。人血液采自樂山師范學(xué)院校醫(yī)院。兔、雞、魚等動(dòng)物血液采自樂山市中區(qū)海棠路農(nóng)貿(mào)市場。所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1川澤瀉凝集素樣品的制備。參照文獻(xiàn)[7]方法并稍作改動(dòng)，川澤瀉干燥塊莖經(jīng)研磨、硫酸銨沉淀、離子交換層析(DEAE-Sepharose)和甲殼素N-乙酰葡萄糖胺親和層析得到凝集素樣品，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2血細(xì)胞懸液的制備。分別取人血(4種血型)和動(dòng)物(家兔、家雞、鯉魚)血樣10 mL，加少許枸櫞酸鈉，用0.9%生理鹽水1∶1(v/v)混勻離心(2 500 r/min，4 ℃，15 min),重復(fù)至少3次洗去血漿其他成分，血細(xì)胞沉淀用0.9%生理鹽水稀釋至2%，滴1～2滴0.2%疊氮化鈉，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3凝集素凝集血細(xì)胞活力的測定。參照文獻(xiàn)[9]在96孔“V”型板上倍比稀釋法檢查凝集血細(xì)胞活性。

1.2.4溫度對(duì)川澤瀉凝集素凝集血細(xì)胞活性的影響。按10 ℃梯度在20～100 ℃，凝集素樣品恒溫10 min后用自來水流水或冰水冷卻至室溫，用A型血細(xì)胞懸液測定凝集血細(xì)胞活性[10]。

1.2.5pH對(duì)川澤瀉凝集素凝集血細(xì)胞活性的影響。凝集素樣品對(duì)pH為2.0、2.5、3.4、4.0、4.6、5.4、6.0、6.8、7.6、8.4、9.0的系列緩沖液充分透析2 h后用A型血細(xì)胞懸液檢查凝集血細(xì)胞活性[9]。

1.2.6金屬離子對(duì)凝集素凝集血細(xì)胞活性的影響。將凝集素樣品溶液在0.05 mol/L的EDTA溶液中充分透析并放置過夜，以除去凝集素樣品中金屬離子，檢測其對(duì)血細(xì)胞的凝集活性；然后均分為7份，其中一份置于0.9%生理鹽水再次透析除去EDTA后，檢測血細(xì)胞凝集活性；再次將其余6份分別滴加一滴0.01 mol/L的K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+，以未經(jīng)EDTA處理的凝集素樣品為對(duì)照，檢測凝集A型血細(xì)胞活性[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 血細(xì)胞凝集活性川澤瀉凝集素對(duì)不同種類代表動(dòng)物血細(xì)胞的凝集活性見表1。表1顯示，川澤瀉凝集素對(duì)不同類型血細(xì)胞的凝集活性存在差異，與劉超等[7]的研究結(jié)果一致。在供試血細(xì)胞中，川澤瀉凝集素僅對(duì)人類血細(xì)胞具有敏感性，能夠使人類血細(xì)胞凝集，其中對(duì)A型血細(xì)胞具有一定偏愛性，使A型血細(xì)胞凝集的效價(jià)為0.95 μg/mL，O型、AB型和B型血細(xì)胞凝集效價(jià)分別為15.30、15.30和31.50 μg/mL。而對(duì)哺乳類家兔以及家雞血細(xì)胞無凝集能力，魚類鯉魚血細(xì)胞在與川澤瀉凝集素接觸時(shí)發(fā)生溶血性細(xì)胞破裂。凝集素能夠使血細(xì)胞凝集是高度專一和復(fù)雜的與糖或衍生物識(shí)別過程，川澤瀉凝集素能夠識(shí)別人類血細(xì)胞而不識(shí)別哺乳動(dòng)物家兔、家雞和魚類鯉魚血細(xì)胞，是因?yàn)榇蔀a凝集素是N-乙酰葡萄糖胺專一性結(jié)合凝集素[7-8]，表明川澤瀉凝集素可識(shí)別一些乙酰化的糖鏈。由于人類血細(xì)胞表面具有N-乙酰葡萄糖胺糖和N-乙酰半乳糖基團(tuán)[11]組成的糖被。凝集素和人類ABO血細(xì)胞表面的N-乙酰葡萄糖胺相互作用，通過凝集素分子橋的作用使血細(xì)胞凝集成團(tuán)。凝集素表現(xiàn)出對(duì)A型血細(xì)胞的偏愛性，可能是A型血細(xì)胞與其他類型血細(xì)胞表面糖鏈的空間構(gòu)象有差異[10]。

表1 凝集素對(duì)不同動(dòng)物血細(xì)胞凝集活性Table 1 Hemagglutinating activities of lectin samples to different animal erythrocytes

2.2 溫度對(duì)川澤瀉凝集素凝集活性的影響從圖1可以看出，隨著溫度的上升，在20～40 ℃，川澤瀉凝集素對(duì)A型血細(xì)胞保持較強(qiáng)凝集活性；當(dāng)溫度上升至40 ℃以后，血細(xì)胞凝集活性劇烈降低；當(dāng)溫度升至80～100 ℃時(shí)，凝集素完全失活。表明川澤瀉凝集素和桑巴鐮刀菌[12-13]等凝集素一樣具有40～50 ℃的低耐熱性，不如已知的楊樹菇凝集素、黃精凝集素和石蒜凝集素[14-16]具有70 ℃的高熱穩(wěn)定性。當(dāng)凝集素樣品隨溫度高于80 ℃時(shí)出現(xiàn)大量的血細(xì)胞絮凝沉淀，此時(shí)凝集素蛋白質(zhì)變性，失去凝集血細(xì)胞活性，將血細(xì)胞包裹成團(tuán)。

圖1 溫度對(duì)凝集素活性的影響Fig.1 Effects of different temperatures on the hemagglutinating activities of APL

2.3 酸堿度對(duì)川澤瀉凝集素凝集活性的影響從表2可以看出，當(dāng)pH在4.0～8.4時(shí)，川澤瀉凝集素均呈現(xiàn)對(duì)A型血細(xì)胞凝集活性，其中在pH為6.0～6.8時(shí)，凝集活性最強(qiáng)，這一結(jié)果表明凝集素對(duì)pH的耐受能力較強(qiáng)，即酸堿度對(duì)川澤瀉凝集素凝集活性中心構(gòu)象影響是漸變過程。當(dāng)pH為低于5.4或高于7.6時(shí)，凝集活性逐漸降低；當(dāng)pH≤3.4或pH≥9.0時(shí)，川澤瀉凝集素不能使血細(xì)胞凝集，反而發(fā)生過酸或過堿的溶血性細(xì)胞破裂。在凝集素等電點(diǎn)pI與pH一致且pH為6.0時(shí)凝集活性最強(qiáng)，這一現(xiàn)象與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)溶解度最低原理理論上此時(shí)凝集能力應(yīng)該降低[17]相矛盾，推測可能是由于凝集素溶于等電點(diǎn)溶液中，在測試過程中滴加了幾乎等體積生理鹽水配制的血細(xì)胞懸液使測試環(huán)境pH高于凝集素的等電點(diǎn)，也有可能是在非等電點(diǎn)環(huán)境中引起了蛋白質(zhì)自身非特異性凝集[16]。

表2 酸堿度對(duì)川澤瀉凝集素凝集活性的影響Table 2 The hemagglutinating activities of lectin samples treated with various pH

2.4 金屬離子對(duì)川澤瀉凝集素凝集活性的影響從表3可以看出，在用0.05 mol/L EDTA充分透析處理后，川澤瀉凝集素凝集A型血細(xì)胞活性消失，表明川澤瀉凝集素蛋白分子中含有維持凝集活性所必需的金屬離子，推測川澤瀉凝集素凝集血細(xì)胞生物學(xué)活性依賴于金屬離子。經(jīng)EDTA透析除去金屬離子后的川澤瀉凝集素樣品中分別加入Mg2+、Mn2+、Ca2+和K+后，凝集血細(xì)胞活性均有一定恢復(fù)，再次證明川澤瀉凝集素血細(xì)胞凝集活性對(duì)Mg2+、Mn2+、Ca2+和K+有不同程度的依賴性。其中對(duì)Ca2+的依賴性最強(qiáng)，說明該凝集素與其他凝集素相似[18]對(duì)金屬離子有一定選擇依賴性。加入Zn2+后，凝集素的凝集活性沒恢復(fù)，表明川澤瀉凝集素血細(xì)胞凝集活性對(duì)Zn2+無依賴性。在所有測試金屬離子對(duì)凝集活性過程中，發(fā)現(xiàn)在高濃度(1 000 μg/mL)凝集素條件下，測試血細(xì)胞均出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，可能是由于高濃度凝集素和金屬離子相互作用，從而引起血細(xì)胞微環(huán)境滲透壓的變化，造成血細(xì)胞破裂。

表3 金屬離子對(duì)川澤瀉凝集素凝集活性的影響Table 3 Effect of metal ions on hemagglutinating activity of APL

3 討論

凝集素是一類非免疫來源的能與糖或衍生物可逆專一性結(jié)合的蛋白質(zhì)，在植物、動(dòng)物、微生物體內(nèi)廣泛分布。由于凝集素具有細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞免疫、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)分裂、抗腫瘤以及代謝調(diào)節(jié)等生理功能[19-24]，近年來引起廣泛關(guān)注。由于腫瘤細(xì)胞中存在異常的糖基化，因此凝集素類糖蛋白常作為腫瘤生物標(biāo)記物，可以利用凝集素的糖結(jié)合專一性特點(diǎn)，開發(fā)凝集素作為腫瘤診斷試劑[25]以及腫瘤藥物定向靶位[26]等?，F(xiàn)在已經(jīng)從不同的生物體內(nèi)分離出近千種凝集素。在應(yīng)用中環(huán)境溫度、酸堿度、氣壓、磁場、金屬離子、蛋白酶以及鹽酸胍、脲、SDS等變性劑對(duì)凝集素的生物學(xué)活性均有不同程度的影響，實(shí)際應(yīng)用受到一些限制。在已知的植物凝集素研究發(fā)現(xiàn)，楊樹菇凝集素[14]、黃精凝集素[15]和石蒜凝集素[16]等普遍對(duì)70 ℃具有較強(qiáng)的耐受性，該研究的川澤瀉凝集素與長裙竹蓀菌絲體凝集素[13]類似呈現(xiàn)弱的熱穩(wěn)定性，在溫度達(dá)到40 ℃凝集活性開始降低，70 ℃時(shí)活性也僅40%左右。凝集素的熱穩(wěn)定性是由凝集素的糖結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)決定的，如果凝集素活性位點(diǎn)僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成，熱穩(wěn)定性會(huì)較低，如果凝集素活性位點(diǎn)含有糖鏈，熱穩(wěn)定會(huì)增加，由此推測川澤瀉凝集素的血細(xì)胞凝集活性位點(diǎn)無糖鏈或者含糖量較低[27]。pH梯度對(duì)川澤瀉凝集素凝集活性研究結(jié)果表明，在pH 5.4～7.6具有凝集血細(xì)胞活性，超過這個(gè)范圍凝集活性劇烈下降，在pH 6.0～6.8凝集活性最強(qiáng)，說明川澤瀉凝集素與長裙竹蓀菌絲體凝集素[13]、面包樹果實(shí)凝集素[28]等凝集素一樣具有較強(qiáng)的酸堿耐受性。有許多凝集素血細(xì)胞凝集活性依賴于金屬離子，如長裙竹蓀菌絲體凝集素[13]和條斑紫菜凝集素[29]凝集活性依賴于Ca2+和Mg2+，該研究的川澤瀉凝集素同樣表現(xiàn)出Ca2+的依賴性。據(jù)此可以推斷川澤瀉凝集素血細(xì)胞凝集活性位點(diǎn)和C型凝集素結(jié)構(gòu)上均具有Ca2+依賴型的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域[30]。對(duì)于川澤瀉凝集素的研究還將從N-乙酰葡萄糖胺專一性識(shí)別分子機(jī)理以及理化因素引起凝血活性變化的分子機(jī)構(gòu)基礎(chǔ)進(jìn)一步研究，特別是血細(xì)胞與凝集素分子間相互作用機(jī)制和基因分子水平的研究為川澤瀉應(yīng)用開發(fā)提供新的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

川澤瀉凝集素(APL)是一種N-乙酰葡萄糖胺專一性結(jié)合蛋白質(zhì)，能夠使人類細(xì)胞發(fā)生凝集作用，并且對(duì)A型血細(xì)胞還具有一定偏好性。該凝集素在50 ℃以下穩(wěn)定，當(dāng)溫度高于60 ℃構(gòu)象發(fā)生變化，凝集活性開始降低，到80 ℃完全失去凝集活性。該凝集素最適pH為6.0～6.8，并且凝集活性依賴于金屬離子，呈現(xiàn)對(duì)Ca2+、Mg2+依賴選擇性。