楊曉菲，李 強*，李延峰，王洪權(quán)

1.赤峰學院附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 內(nèi)蒙古自治區(qū) 赤峰 024000； 2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 神經(jīng)科, 北京 100050；3.航天中心醫(yī)院/北京大學航天臨床醫(yī)學院 神經(jīng)內(nèi)科, 北京 100049

缺血性卒中(ischemic stroke,IS) 是世界范圍內(nèi)死亡和長期致殘的主要原因之一，治療方法有限，因此研發(fā)治療藥物具有重要意義。NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)通過協(xié)調(diào)多種細胞保護基因表達，是機體防御氧化應(yīng)激損傷的主要調(diào)節(jié)因子[1]。近年研究顯示，通過藥物激活NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)通路可抑制氧化應(yīng)激損傷、小膠質(zhì)細胞激活和神經(jīng)炎性反應(yīng)等機制來抑制缺血性卒中神經(jīng)元丟失，發(fā)揮對腦保護作用。因此，靶向調(diào)控Nrf2/ARE通路成為治療缺血性卒中很有吸引力的新靶點。本文目的主要綜述近2年來在短暫局灶性腦缺血(transient focal cerebral ischemia, tMCAO)動物模型中通過藥物激活Nrf2/ARE通路治療腦缺血損傷研究的最新進展。

1 Nrf2/ARE通路

缺血性卒中存在Nrf2/ARE通路的激活。在生理條件下，Nrf2主要定位于細胞質(zhì)內(nèi)， 與Nrf2上游調(diào)控因子Keap1結(jié)合，經(jīng)泛素蛋白酶途徑降解，從而使Nrf2維持在基礎(chǔ)水平。當細胞在腦缺血期間受到過多的氧化刺激時，Nrf2與Keap1分離、轉(zhuǎn)運到細胞核，與抗氧化和細胞保護蛋白的ARE序列結(jié)合并激活這些保護基因，后者包括血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1), NAD(P) H:醌氧化還原酶1(NAD(P)H quinone oxidoreductase，NQO1), 谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx), 和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase, GST)家族等一些成員。

2 Nrf2/ARE通路激活在短暫局灶性腦缺血中的作用

通過短暫結(jié)扎阻塞大腦中動脈(middle cerebral artery occlusion, MCAO)造成的局灶性腦缺血/再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)的動物模型，稱之為短暫局灶性腦缺血(tMCAO)模型。研究顯示，在tMCAO模型中Nrf2/ARE通路被激活。I/R導致如過氧化氫(H2O2)等在內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高，后者反過來激活Nrf2，轉(zhuǎn)運到細胞核的Nrf2與細胞保護基因的抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant response element, ARE)結(jié)合，進而上調(diào)包括HO-1在內(nèi)的抗氧化蛋白，從而可減輕I/R期間過量產(chǎn)生的ROS所引起的氧化應(yīng)激損傷和細胞死亡。

在tMCAO后24 h腦損傷最嚴重，因此大多數(shù)研究在該時間點檢測腦組織Nrf2/ARE通路改變，包括皮層、大腦半球、海馬、紋狀體和小腦在內(nèi)不同缺血腦組織中Nrf2的變化。而有些研究延伸到早期(2～8 h)或晚期(3～14 d)。多數(shù)研究者選擇持續(xù)1～2 h的腦缺血制備tMCAO I/R動物模型。大多數(shù)研究在持續(xù)1～2 h造成tMCAO后24 h檢測缺血皮層或大腦中的總Nrf2水平，顯示Nrf2在mRNA和蛋白質(zhì)水平均上調(diào)(可高達2～3倍)。Nrf2蛋白水在8 h后開始升高[2]，可持續(xù)3～14 d。核轉(zhuǎn)位后Nrf2在細胞核內(nèi)聚集，增加與ARE結(jié)合的活性[3]，這一現(xiàn)象可出現(xiàn)在tMCAO后7 h[4]。而Nrf2靶基因，包括HO-1和NQO1等也同時上調(diào)。HO-1升高可持續(xù)2～14 d。tMCAO后24 h，缺血側(cè)海馬神經(jīng)元總Nrf2蛋白和細胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達明顯升高，并至少持續(xù)升高2 d。另有免疫組化研究顯示，1 h缺血造成tMCAO后再灌注2 h后在缺血區(qū)域周圍存在Nrf2升高，8 h后達峰，而包括HO-1在內(nèi)的Nrf2靶基因在24～72 h后明顯升高。

1 h缺血造成tMCAO后7 d[3]在神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞中存在Nrf2免疫陽性[5]。利用熒光素酶小鼠模型觀察到從腦缺血開始到tMCAO后7 d存在時間依賴性Nrf2表達。在缺血早期未檢測到體內(nèi)Nrf2表達的熒光信號，但在缺血后24 h達到峰值。這種Nrf2表達主要在缺血半暗帶區(qū)檢測到，主要定位于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞內(nèi)部[6]。通過量化綠色熒光蛋白(GFP)標記的Nrf2，發(fā)現(xiàn)缺血后4～48 h的皮質(zhì)和24 h的紋狀體中Nrf2和HO-1 蛋白增高更加明顯。

3 藥物靶向激活Nrf2/ARE通路抑制缺血性腦損傷

在腦缺血中靶向激活Nrf2/ARE通路觸發(fā)細胞保護反應(yīng)，能夠抑制缺血性腦損傷，使Nrf2激活劑成為治療實驗性短暫局灶性腦缺血的可能性。以下本文綜述近2年來通過激活Nrf2/ARE通路在tMCAO實驗?zāi)Ｐ椭兄委熌X缺血損傷的研究進展。

3.1 黃酮類化合物

槲皮素(quercetin)通過SIRT1/Nrf2/HO-1信號通路顯著降低腦梗死體積、神經(jīng)功能缺損、血腦屏障(blood brain barrier,BBB)通透性和ROS生成。此外，選擇性Sirt1抑制劑EX527逆轉(zhuǎn)了這種神經(jīng)保護作用，表明槲皮素通過SIRT1信號通路保護MCAO大鼠的BBB，從而對腦缺血再灌注損傷具有抑制作用[7]?；?pelargonidin)為常見的花青素(anthocyanidin)之一，最近研究顯示，其可通過激活Nrf2通路，上調(diào)HO-1、SOD，下調(diào)腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白細胞介素-6 (IL-6)和丙二醛(MDA)，進而在tMCAO大鼠模型中降低腦梗死面積、改善神經(jīng)功能[8]。 枇杷苷(eriocitrin)在tMCAO大鼠模型中，可通過激活Nrf2通路，上調(diào)HO-1、SOD和NQO1, 抑制NF-κB p65的磷酸化，降低腦組織內(nèi)IL-6和TNF-α的水平、增加IL-10的含量，進而通過抗氧化和抗炎作用發(fā)揮其對I/R損傷的抑制作用[9]。作為草藥主要查爾酮成分的黃腐酚(xanthoangelol, XAG)可通過激活Nrf2抑制氧化應(yīng)激誘導的凋亡，在tMCAO大鼠模型中發(fā)揮抑制神經(jīng)元損傷的作用[10]。其他黃酮類化合物如山奈酚(kaempferol)[11]、黃芪黃酮(astragalin)[12]和三葉苷(trilobatin)[13]等均可通過激活Nrf2/ARE通路發(fā)揮在tMCAO模型中的腦保護作用。綜上所述，黃酮類化合物在tMCAO模型中具有激活Nrf2通路，發(fā)揮抑制缺血性卒中損傷的作用。

3.2 多酚類化合物

多酚二苯乙烯類天然化合物白皮杉醇(piceatannol)在小鼠I/R中其可激活Nrf2, 上調(diào)HO-1和 NQO1發(fā)揮改善神經(jīng)功能評分和減少腦梗死面積，進而具有神經(jīng)保護和抗腦缺血損傷的作用[14]。 葉下珠素(phyllanthin)在I/R大鼠模型中通過激活Nrf2通路，抗神經(jīng)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和抗凋亡機制，從而改善腦功能障礙和腦水腫，抑制腦損傷[15]。綠原酸(chlorogenic acid, CGA)在tMCAO大鼠模型中抑制大腦受損，增強學習能力和改善空間記憶。此外，CGA以劑量依賴性方式促進腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)和神經(jīng)生長因子(NGF)的表達，減輕I/R誘導的神經(jīng)損傷。此外，CGA增加SOD活性和GSH水平，降低ROS和MDA的生成。值得注意的是，CGA減輕氧化應(yīng)激誘導的腦損傷和細胞凋亡，并抑制凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3和caspase-9)的表達。此外，CGA促進Nrf2、NQO-1和HO-1的表達。Nrf2途徑抑制劑ML385減弱CGA對腦損傷的抑制作用，表明CGA通過Nrf2通過發(fā)揮其抗氧化和凋亡作用[16]。綜上所述，多酚類化合物在tMCAO模型中具有激活Nrf2通路，發(fā)揮抑制缺血性腦損傷作用。

3.3 中草藥提取物

作為中藥閉苞買麻藤提取物主要成分的異丹葉大黃素(isorhapontigenin，ISO)治療顯著改善神經(jīng)功能評分，減少梗死體積、壞死神經(jīng)元，減少ROS產(chǎn)生、4-羥基壬烯醛加合物(4-HNE)和8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine, 8-OHDG)水平。同時，ISO顯著增加Nrf2和HO-1的表達。而敲除Nrf2和HO-1能夠抵消ISO的神經(jīng)保護作用，此外，蛋白激酶Cε(PKCε)基因的敲除阻斷了ISO誘導的核Nfr2和HO-1表達，因此，ISO具有抑制腦缺血再灌注損傷作用，其神經(jīng)保護機制可能與PKCε/Nrf2/HO-1通路有關(guān)[17]。補骨脂(psoralea corylifolia)提取物補骨酯酚(bakuchiol, BAK)在tMCAO小鼠模型中，減輕小鼠的神經(jīng)功能缺損，減少梗死體積、腦水腫和神經(jīng)元損傷。BAK減少了腦內(nèi) Iba1(ionized calcium binding adapter molecule 1)免疫反應(yīng)細胞的數(shù)量，表明小膠質(zhì)細胞的激活減少。BAK還降低了NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的表達，BAK促進Nrf2在細胞核內(nèi)聚集和HO-1水平的升高，表明BAK通過激活Nrf2信號通路、抑制NLRP3介導的炎性反應(yīng)從而抑制缺血性腦損傷[18]。二分生褐藻提取物氫青石烯二萜 (hydroazulene diterpenes, HDD)在tMCAO大鼠模型中通過激活Nrf2/ARE通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用[19]。丁苯酞(L-3-n-butylphthalide, L-NBP)作為治療急性腦梗死的藥物，其可通過激活Nrf2/HIF-1α/VEGF信號通路，改善大腦微循環(huán)和促進腦血管新生[20]。 研究首次證明枸杞提取物狼毒甲素(lyciumamide A, LyA)通過激活PKCε/Nrf2/HO-1通路，抑制氧化損傷和神經(jīng)元凋亡，從而抑制I/R誘導的腦損傷[21]?？傊?，中草藥提取物在tMCAO模型中具有激活Nrf2通路，發(fā)揮抑制缺血性腦損傷的作用。

3.4 萜類化合物

羽扇豆醇(lupeol)可顯著減少tMCAO大鼠的腦梗死體積和含水量，并恢復(fù)神經(jīng)行為功能，下調(diào)氧化應(yīng)激和炎性因子的表達，激活Nrf2，抑制caspase-3活性，降低BAX/Bcl-2比率，抑制p38 MAPK的磷酸化，總結(jié)其可能通過激活Nrf2和抑制細胞凋亡途徑來抑制氧化應(yīng)激和炎性因子生成，從而抑制腦缺血損傷[22]。

綜上所述，近2年來研究顯示黃酮類化合物、多酚類化合物、中草藥提取物和萜類化合物等均具有激活Nrf2/ARE通路的作用，進而在tMCAO實驗性動物模型中發(fā)揮抗氧化、抗凋亡、抗神經(jīng)炎性反應(yīng)等藥理學作用，進而發(fā)揮它們對缺血性腦損傷的抑制作用。

4 問題與展望

植物源性活性化合物具有抗氧化作用，通過激活Nrf2信號在缺血性卒中實驗?zāi)Ｐ椭芯哂猩窠?jīng)保護作用。不同的天然化合物由于其誘導Nrf2激活的能力不同，從而使包括HO-1和NQO1在內(nèi)的抗氧化酶表達增加以及降低氧化應(yīng)激標記，從而在實驗性tMCAO模型中表現(xiàn)出有益的作用。不同生物活性化合物激活Nrf2調(diào)節(jié)不同途徑，通過活化PI3K/Akt、MAPK和NF-κB等磷酸化激活Nfr2，進而上調(diào)保護基因表達，抑制缺血性腦損傷。目前作為Nrf2激活劑之一的多靶點天然化合物在腦缺血中的具體神經(jīng)保護機制還有待于深入研究。鑒于Nrf2/ARE激動劑丁苯酞和依達拉奉通過激活Nrf2對急性缺血性卒中具有治療作用，提示探索靶向Nrf2/ARE通路的藥物治療缺血性卒中的臨床試驗研究值得進一步探索。總之，本文表明，植物源性天然化合物作為Nrf2激活劑，有望成為治療缺血性卒中新的潛在藥物。