臧晗偉 楊麗娟 杜昭啟 李偉

1濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院心臟大血管外科，濱州 256603；2濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學研究中心，濱州 256603

主動脈瘤是指主動脈局部或彌漫性的擴張，通常主動脈直徑超過正常直徑的50%即可診斷為主動脈瘤，絕大多數的主動脈瘤患者無明顯癥狀，但瘤體發(fā)生破裂后病死率極高［1-2］。近年來，受社會壓力和不良生活習慣的影響，主動脈瘤的患病率呈上升趨勢，隨著影像學技術的發(fā)展和醫(yī)療資源的改善，主動脈瘤的就診率和檢出率也相應提高。介入技術的逐步成熟及廣泛應用使得大部分患者得到了及時的救治。但該病當前并無有效的預防和藥物治療手段，因此研究疾病的發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點是主動脈瘤防治的重中之重。

不同于其他組織，主動脈瘤臨床樣本的獲取難度較大，因此，主動脈瘤的研究主要通過細胞或動物實驗進行，穩(wěn)定、合理的主動脈瘤模型是開展科學研究的基礎。目前，主動脈瘤動物模型包括藥物誘導模型、基因工程模型和手術模型，其中藥物誘導模型最為常見。不同的模型模擬了不同的發(fā)病機制，呈現(xiàn)不同的病理表現(xiàn)，適用于不同的實驗研究，且動物存活率、造模費用等也大不相同，本文就主動脈瘤動物模型的構建方法及優(yōu)缺點等進行綜述。

主動脈瘤概述

1.主動脈瘤的臨床診療

主動脈瘤根據發(fā)病部位可分為胸主動脈瘤和腹主動脈瘤［1-2］。無論是胸主動脈瘤還是腹主動脈瘤，在早期多無明顯癥狀，多因查體發(fā)現(xiàn)，部分患者可在后期因瘤體壓迫臨近組織器官或破裂后發(fā)現(xiàn)。而夾層動脈瘤作為主動脈瘤的一種特殊類型，在疾病的早期即可表現(xiàn)為劇烈的疼痛，主動脈夾層發(fā)病急驟，破裂風險高，需盡早治療。彩超檢查由于費用低、無創(chuàng)，是篩查主動脈瘤最常用的影像學手段，主動脈CT血管造影（CTA）可以較為精確地顯示出動脈瘤大小、形態(tài)、附壁血栓、主動脈分支血管受累狀況，是主動脈瘤診斷的金標準。

無論是胸主動脈瘤還是腹主動脈瘤，手術均為其首選治療方法［1-2］。手術又包括介入手術及開放手術兩種，對于病變位于升主動脈的患者而言，常需選擇創(chuàng)傷較大、風險較高的開放手術，術前需嚴格評估瓣膜功能，明確是否需同期行瓣膜置換，術中常需切除整段病變血管并進行人工血管置換。位于主動脈弓、降主動脈或腹主動脈的動脈瘤多采用介入手術，其優(yōu)點是創(chuàng)傷小、操作時間短，術后恢復快。

2.主動脈瘤的病理特征及發(fā)病機制

主動脈瘤的主要病理表現(xiàn)包括：細胞外基質（extracellular matrix，ECM）降解、血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的凋亡及表型轉化、管壁炎癥細胞浸潤，這些病理表現(xiàn)相互作用，共同參與了疾病的進展。ECM由彈力蛋白和膠原蛋白構成，是構成主動脈中膜的重要成分，負責維持血管穩(wěn)態(tài)。處于合成態(tài)的VSMCs可產生大量基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），并作用于ECM，促使彈力蛋白和膠原蛋白降解，誘導腹主動脈瘤發(fā)生［3］。VSMCs是構成主動脈中膜的主要細胞成分，在主動脈瘤疾病進程中，VSMCs發(fā)生異常凋亡，并從收縮態(tài)向合成態(tài)轉化，導致彈性蛋白和膠原合成減少，降解增多，動脈管壁發(fā)生退化［4］。炎癥細胞浸潤是主動脈瘤發(fā)病過程中的另一重要病理表現(xiàn)，在主動脈瘤患者的主動脈壁中，可觀察到巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞等多種炎癥細胞，炎癥細胞分泌的多種細胞因子和趨化因子可誘導MMP的活化，引起ECM降解和VSMCs凋亡［5］。

主動脈瘤的病因及發(fā)病機制當前并不明確，主要危險因素包括年齡、性別、吸煙、肥胖、高血壓。除此之外，主動脈瘤還受遺傳因素影響，如與FBN1基因突變相關的馬凡綜合征（Marfan syndrome，MFS）［6］，與MYH11基因相關的家族性胸主動脈瘤及夾層［7］，洛伊斯-迪茨綜合征（Loeys-Dietz syndrome，LDS）患者的基因突變類型則可以分為5種亞型，分別是轉化生長因子-β（TGF-β）受體1和2基因（TGFBR1、TGFBR2）的突變，TGF-β 途徑中的 TGFB2、TGFB3以及SMAD3基因的突變［6］。

主動脈瘤模型

與胸主動脈瘤動物模型相比，腹主動脈瘤的動物模型較多，也比較成熟。研究表明，在某些腹主動脈瘤的建模過程中，也能觀察到胸主動脈瘤的發(fā)生，但發(fā)病率較低。目前應用較多的建模方法主要包括藥物誘導法、基因修飾法和手術法等。

1.藥物誘導模型

藥物誘導模型是通過局部或全身應用藥物，誘導動物形成主動脈瘤。常用藥物有氯化鈣（CaCl2）、彈性蛋白酶（porcine pancreatic elastase，PPE）、血 管 緊 張 素 Ⅱ（angiotensin-Ⅱ，AngⅡ）、β-氨基丙腈（β-aminopropionitrile monofumarate，BAPN）等，這些藥物可單獨使用，也可聯(lián)合應用來誘導模型的形成，而不同藥物誘導模型的形成機制、病理表現(xiàn)及藥物使用方法各不相同。

1.1.CaCl2浸潤法誘導模型

CaCl2可引起主動脈中膜血管平滑肌的丟失和內膜血管內皮細胞的損傷，使管壁增厚、鈣化，彈性纖維斷裂，同時還能引起炎癥細胞（包括巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞）浸潤管壁，促使動脈瘤形成［8］。1988年Gertz等［9］使用CaCl2浸潤兔頸總動脈成功建立了頸總動脈瘤的動物模型；在2000年，Chiou等［10］首次使用該方法在C57BL/6小鼠建立了腹主動脈瘤的模型，他們使用0.68 M CaCl2浸泡的濕紗布覆蓋小鼠的腹主動脈10 min，于術后21 d觀察到了腹主動脈瘤的形成。此后經過多次改良，現(xiàn)已廣泛應用。

該模型手術方式簡單，小鼠麻醉后，取腹部正中切口，游離位于雙側腎動脈至髂動脈分叉處的主動脈，暴露主動脈外膜，使用CaCl2浸泡的紗布濕敷后，使用生理鹽水沖洗腹腔后關腹，實驗所需CaCl2濃度及孵育時間在大鼠和小鼠差異較大，小鼠可選用1 mol/L CaCl2孵育50 min，術后14 d就可發(fā)現(xiàn)腹主動脈擴張。大鼠則可采用1 mol/L CaCl2溶液孵育主動脈10 min，飼養(yǎng)28 d觀察成模情況［8，11］。該模型具體機制并不明確，目前認為血管浸潤CaCl2后，游離的鈣離子轉運入細胞內，在VSMCs堿性磷酸酶的催化下，鈣離子轉化為磷酸鈣，由于鈣離子與彈性蛋白親和力較高，磷酸鈣可在彈性蛋白網上沉淀，引起彈性纖維的斷裂［12-13］。該模型可模擬人腹主動脈瘤平滑肌細胞凋亡、炎癥細胞浸潤、彈性纖維鈣化等特征，但該方法誘導的模型不會破裂，且不會形成粥樣硬化及附壁血栓，與人腹主動脈瘤的病理特征有一定差別。

1.2.PPE灌注法誘導模型

1990年Anidjar等［14］經腹主動脈灌注PPE 2 h成功建立了大鼠的腹主動脈瘤模型。2002年國內學者將PPE的灌注時間縮短到了30 min，模型成功率在90%左右，灌注時間超過30 min，延長灌注時間，模型成功率無明顯變化［15］。Pyo等［16］在2000年改進建模方法，成功將該方法應用于小鼠，并將灌注時間縮短至5 min。

PPE能穿透管壁中層，造成彈性纖維的損傷，引起局部腹主動脈擴張。病理切片發(fā)現(xiàn)，灌注后的第1周彈性纖維無明顯損傷，灌注后第2周開始，管壁出現(xiàn)明顯的彈性纖維降解和炎癥細胞浸潤，巨噬細胞和中性粒細胞是主要的炎癥細胞，并且檢測到了MMP-2和MMP-9的表達增加［16］。

該模型的手術操作要求較高，且在灌注過程中存在PPE滲漏、血管破裂等風險，對手術者的操作要求高。此種建模方法可選擇C57BL/6J小鼠或Wistar大鼠作為實驗動物，建模時需暴露雙側腎動脈至髂動脈分叉處的腹主動脈，暴露區(qū)上下兩端腹主動脈使用絲線結扎，插入灌注針頭進行灌注。C57BL/6小鼠可使用1.5 U/ml的PPE 30 μl灌注5 min，Wistar大鼠可使用50 U/ml的PPE 1 ml灌注30 min，灌注結束后沖洗腹腔并逐層關腹，術后第14天可觀察到動脈瘤［15-17］。該模型無法誘導形成主動脈夾層、動脈粥樣硬化和附壁血栓，動脈瘤破裂率也較低，但是其組織切片可觀察到炎癥細胞浸潤和中膜的降解，該病理特點與人動脈瘤病理表現(xiàn)相似。

1.3.AngⅡ誘導的模型

AngⅡ誘導形成主動脈瘤是當前常用的建模方法，該方法于2000年被Daugherty等［18］報道，實驗動物常選擇載脂蛋白E缺失（ApoE-/-）小鼠或低密度脂蛋白受體缺陷（LDLR-/-）小鼠［19］，但也有選擇野生型C57BL/6小鼠的報道［20］。AngⅡ進入小鼠體內后可損傷主動脈內膜，血液由損傷處進入管壁，形成主動脈壁間血腫，最終引起血管擴張［21］。蘇木精-伊紅（HE）染色提示主動脈管壁增厚，中膜及外膜可見炎癥細胞浸潤，彈力纖維染色還可觀察到彈力纖維的降解［22］。

將含有AngⅡ的微量泵植入小鼠背部皮下，以1.44 mg（/kg·d）的劑量持續(xù)泵入，術后高脂飼料喂養(yǎng)28 d成瘤［23］。AngⅡ誘導的動脈瘤病理表現(xiàn)與人主動脈瘤病理特征相似，可見主動脈中膜降解、主動脈擴張、伴有動脈粥樣硬化和壁內血栓的形成。該方法手術創(chuàng)傷較小，操作簡單，缺點是人類腹主動脈瘤多位于腎下方，而本模型主要形成腎上型腹主動脈瘤，且因為需要使用微量泵及轉基因鼠，實驗費用較高。

1.4.BAPN誘導的動物模型

BAPN是一種賴氨酰氧化酶（Lox）強效抑制劑，Lox由VSMCs釋放，能夠氧化膠原和彈性蛋白的賴氨酸殘基，使這些纖維性蛋白共價交聯(lián)產生ECM，BAPN能競爭性地結合彈性蛋白或氨基烷基，抑制彈性蛋白和膠原蛋白交聯(lián)，使主動脈中膜發(fā)生退化，最終形成夾層［24］。組織學可見彈力纖維破壞、數量減少，血管壁變薄和炎癥細胞浸潤［25］。

1952年I.V. Ponseti等發(fā)現(xiàn)，將山黧豆種子及正常飼料按照1∶1的比例混合飼養(yǎng)大鼠，5～9周后部分大鼠發(fā)生夾層破裂而死亡，提示山黧豆中的某種成分可致主動脈夾層發(fā)生，隨后的研究證實導致主動脈夾層的有效成分為BAPN，從此，BAPN被逐步運用于動脈瘤模型的制作［26］。BAPN主要誘導夾層動脈瘤的形成，病變多位于胸主動脈，而腹主動脈較少見［25］。因為Lox活性可隨著年齡增長而降低，成年動物使用BAPN處理后可誘導血管硬化和彈力纖維降解，但并不能誘導主動脈瘤的形成，因此該模型多選擇2～3周的雄性C57BL/6小鼠［27-29］。此方法動脈瘤破裂和動物死亡風險較高，但建模費用低，操作簡單。

1.5.醛固酮受體激動劑加高鹽飲水誘導的模型

乙酸脫氧皮質甾酮（deoxycorticosterone acetate，DOCA）是醛固酮的前體，Liu等［30］在使用DOCA和鹽誘導小鼠高血壓時發(fā)現(xiàn)部分小鼠因主動脈瘤破裂而死亡，提示DOCA或醛固酮加高鹽飲水可誘導小鼠動脈瘤形成。具體方法為：將50 mg的DOCA緩釋藥片植入10月齡的C57BL/6J小鼠背部，同時給予含有0.9%氯化鈉（NaCl）和0.2%氯化鉀（KCl）的水飼養(yǎng)3周即形成動脈瘤，此方法誘導形成的模型，腹主動脈瘤、胸主動脈瘤和主動脈瘤破裂的發(fā)生率分別為62%、44%和18%，且產生胸主動脈瘤的小鼠均合并有腹主動脈瘤［30］。由于DOCA是醛固酮的前體，該團隊嘗試200 μg（/kg·d）的醛固酮加高鹽飲水飼養(yǎng)動物，也誘導形成了主動脈瘤。與DOCA和鹽誘導的主動脈瘤相比，醛固酮和鹽誘導的主動脈瘤多位于腎上腹主動脈，且主動脈瘤破裂率更高。該模型有明顯的鼠齡限制，10月齡小鼠主動脈瘤發(fā)病率及瘤體最大徑明顯高于10周齡小鼠。由于醛固酮對腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)有負反饋調節(jié)作用，而該系統(tǒng)可引起高血壓升高，為排除血壓對實驗的影響，研究者使用依那普利和洛沙坦阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的升壓作用，發(fā)現(xiàn)動脈瘤的發(fā)生率和瘤體擴張程度無明顯變化，而應用醛固酮受體拮抗劑螺內酯則能明顯縮小主動脈瘤的體積，降低發(fā)病率，說明此類動脈瘤的形成取決于醛固酮的作用，而非血壓的升高［31］。

此模型造模方法簡單，且與人主動脈瘤的病理表現(xiàn)相似，均觀察到彈力纖維降解、MMP分泌增加、巨噬細胞等炎癥細胞浸潤、VSMCs凋亡和主動脈血管壁重塑等。

1.6.多種藥物聯(lián)合誘導的模型

多種藥物聯(lián)合誘導的模型是指為提高模型成功率，聯(lián)合應用2種或2種以上藥物誘導構建主動脈瘤模型。目前最常用的方法是Tanaka等［32］提出的在PPE灌注的基礎上聯(lián)合CaCl2局部浸潤的方法，在進行PPE灌注的過程中使用CaCl2紗布濕敷主動脈20 min，4周后可成瘤，成功率可達到92.7%。為研究吸煙對主動脈瘤的影響，有學者通過微量泵將4 mg（/kg·d）的尼古丁和0.72 mg（/kg·d）的AngⅡ泵入小鼠體內28 d后，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合誘導小鼠腹主動脈瘤的成功率顯著高于單獨應用AngⅡ組［33］。除此之外，還有部分學者使用AngⅡ聯(lián)合BAPN建立主動脈瘤模型，通過AngⅡ腹腔注射聯(lián)合飲用BAPN水溶液的方法構建出的主動脈瘤模型，相較于單獨使用一種藥物的方法而言，模型成功率明顯提高，達到了80%［34］。多藥物聯(lián)合應用顯著提高了動脈瘤的擴張比率和發(fā)生率，但也面臨死亡率升高的風險。不同藥物誘導出的主動脈瘤其病理表現(xiàn)也不同，因此通過聯(lián)合用藥的方法所誘導出的主動脈瘤可觀測到更多的病理變化，更能模擬臨床動脈瘤的演變過程。

2.基因工程模型

基因工程模型是通過轉基因或基因敲除等基因修飾技術使動物發(fā)生基因突變或缺失，在此基礎上單獨或聯(lián)合藥物，引起ECM、彈力蛋白、膠原蛋白、主動脈管壁細胞結構或關鍵酶異常，形成主動脈瘤。由于C57BL/6小鼠已完成全基因組測序，基因操作技術較為成熟，也就成為了目前最常用的轉基因實驗動物［35］?；蚬こ棠Ｐ涂梢詮幕?、分子角度來探索主動脈瘤的發(fā)病機制，尤其適用于MFS等基因異常引起的主動脈瘤，此外，還有部分基因工程模型可增加動物動脈瘤發(fā)生的易感性，并已廣泛應用于實驗研究。

建立動脈瘤模型常用的基因工程鼠是ApoE-/-小鼠及LDLR-/-小鼠，主要是因ApoE和低密度脂蛋白基因缺失可引起脂代謝異常，引發(fā)高脂血癥，通過聯(lián)合使用AngⅡ，使VSMCs受損形成腹主動脈瘤。此模型可出現(xiàn)主動脈粥樣硬化、附壁血栓形成等病理特征［22-23］。由于MMP參與了主動脈瘤管壁彈力纖維的降解，因此，Apo與MMP基因雙敲除小鼠應運而生。該模型更適用于研究MMP在腹主動脈瘤發(fā)病中的作用，且模型成功率與ApoE-/-小鼠相比明顯升高，但由于敲除了2個關鍵基因，小鼠早期死亡風險也相應增加［36］。

針對基因特征明確的特定疾病，研發(fā)出了專用的基因工程動物模型，如研究MFS的FBN1基因突變小鼠，MFS是一種累及多器官的結締組織病，其患者由于FBN1基因突變，使主動脈中層彈力蛋白減少［6］。研究LDS的TGFBR1、TGFB2和TGFBR2基因突變小鼠，在組織學上表現(xiàn)為主動脈壁中膜變性及彈力纖維斷裂，這一點與MFS病理學表現(xiàn)相似［6，37］。但是，由于基因突變動物價格昂貴，飼養(yǎng)條件要求較高，使其應用受到了限制。

3.手術模型

手術模型是指通過手術方法直接構建符合疾病特點的動物模型，其不同于藥物誘導模型和基因工程模型，手術模型無法呈現(xiàn)動脈瘤的病理特征，因此多用于主動脈瘤的腔內治療及血流動力學等方面的研究。

3.1.主動脈修補手術模型

常用的主動脈瘤模型手術方法是將主動脈縱形切開后使用補片對切口進行修補，由于所使用補片與主動脈相比結構相對較弱，手術部位在血壓作用下擴張形成動脈瘤。常選擇腎動脈以下、髂動脈分叉處以上的腹主動脈進行造模，實驗所用的移植物或補片通常來自自體靜脈、腸管等，也可使用人工補片［38-40］。該實驗方法由于所選擇的補片及主動脈切口大小受研究者自行控制，因此其最終形成的動脈瘤瘤體大小相對可控，但手術操作時間長、創(chuàng)傷大，且無法表現(xiàn)出動脈粥樣硬化、ECM降解、管壁炎癥細胞浸潤等病理變化，僅用于主動脈瘤的形態(tài)學研究。

3.2.脫細胞移植手術模型

1994年Allaire等［41］將豚鼠腹主動脈經十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）脫細胞處理，造成管壁的細胞結構破壞，只保留彈性蛋白和膠原蛋白等ECM成分，經脫細胞處理并移植入Lewis大鼠體內的主動脈作為外源移植物，成了免疫反應的靶器官，在宿主免疫作用下，移植血管表現(xiàn)為ECM破壞和主動脈擴張，術后8周的病理切片可以觀察到管壁中層變薄，變薄的管壁在血壓的影響下發(fā)生重塑，形成動脈瘤。該方法手術難度較大，需要術者具備成熟的血管吻合技術，目前多用于研究VSMCs對腹主動脈瘤的保護作用及平滑肌細胞對MMP的抑制作用。

3.3.人工血管移植及腔內手術模型

目前腹主動脈瘤多采用介入治療，因此，我國龔萬和等人成功建立了犬的主動脈瘤模型，主要方法是使用將兩段直徑6 mm的人工血管與直徑29 mm的人工血管的兩端進行吻合，制作成為一段中間部位膨大腹主動脈瘤假體，并將假體與腹主動脈進行吻合，術后5個月解剖見假體部位腹主動脈血流通暢［42］。該模型主要應用于主動脈覆膜支架的設計，但手術操作難度高，需要術者掌握熟練的血管吻合技術，手術時間長，約120 min，隨時間的延長，動物下肢缺血、癱瘓的風險也相應增加。

景在平等學者還曾通過腔內手術操作直接損傷血管內膜，在術后2周成功誘導形成胸主動脈夾層動脈瘤［43］。該方法需要特殊的造瘤器械，并且對操作人員有放射性損傷。但該方法成瘤周期短，尤其適用于夾層動脈瘤破裂、介入手術治療等的研究。

小 結

主動脈瘤模型建模方法較多，而理想的模型應具備成功率高、死亡率低、可重復性強、操作簡單、成本低等特點。通過對主動脈瘤動物模型的制作方法、病理表現(xiàn)的研究，我們發(fā)現(xiàn)不同方法構建的模型各有特色，但均不能完美地模擬人類主動脈瘤的全部病理生理特征，因此，在研究中我們還需要根據實驗要求而選擇合適的主動脈瘤模型。