王富喜，鄧宏圖 綜述，王 濱 審校

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東 濱州 256600)

靶向給藥系統(tǒng)是指通過局部給藥或經(jīng)全身血液循環(huán)，由載體對目標(biāo)組織、細胞或細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)進行選擇性濃集和定位的給藥系統(tǒng)。靶向給藥能使藥物濃度富集于靶標(biāo)，從而減少用藥劑量，同時提高藥物療效，減少不良反應(yīng)，還能控制釋藥速率和方式，最終達到高效低毒的效應(yīng)。靶向給藥系統(tǒng)可分為脂質(zhì)體、微囊、微球、納米粒等，目前應(yīng)用最為廣泛的為靶向脂質(zhì)體[1]。

臨床前的藥理評價可以為臨床研究提供可靠的實驗支持，為臨床研究提供有關(guān)藥物有效性或安全性的重要參數(shù)。臨床前藥理學(xué)研究的主要內(nèi)容包括：(1)主要藥效學(xué)研究，內(nèi)容包括客觀評價受試藥的優(yōu)劣，并與已上市的、公認(rèn)的有效藥物進行比較后，經(jīng)過科學(xué)嚴(yán)格的實驗設(shè)計，確定取舍；(2)一般藥理學(xué)研究，指對受試藥主要藥效之外的藥物效應(yīng)進行研究；(3)作用機制的研究；(4)臨床前藥動學(xué)的研究，是研究藥物吸收、分布、轉(zhuǎn)化和排泄，并根據(jù)數(shù)學(xué)模型得出重要的藥物動力學(xué)參數(shù)[2]。本文首先簡要介紹靶向脂質(zhì)體的分類及理化性質(zhì)評價，再從藥效學(xué)、靶向性、體外及體內(nèi)實驗評價等全面綜述靶向脂質(zhì)體的藥理學(xué)評價。

1 靶向脂質(zhì)體的分類及特點

根據(jù)作用機制的不同，靶向脂質(zhì)體可分為物理化學(xué)靶向、主動及被動脂質(zhì)體。物理化學(xué)靶向脂質(zhì)體是在脂質(zhì)體中加入一些特殊的磁性材料，使脂質(zhì)體對光、熱、pH、磁場等刺激產(chǎn)生反應(yīng)，從而使藥物直接作用于目標(biāo)組織，如磁性、溫度敏感型、pH敏感型靶向脂質(zhì)體等均屬此類[3]。主動靶向脂質(zhì)體是指在脂質(zhì)體表面連接能夠與靶蛋白結(jié)合的一些糖殘基、抗體、激素和受體配體等，使脂質(zhì)體主動到達特定的靶器官、靶組織和細胞系后釋放藥物而發(fā)揮藥效。被動靶向脂質(zhì)體是指脂質(zhì)體通過靜脈注射進入機體后易被體內(nèi)的吞噬細胞吞噬，形成了天然傾向的富集作用，其與主動靶向脂質(zhì)體最大的區(qū)別是脂質(zhì)雙分子層沒有修飾，具有特定功能的配體、抗體等[4]。

此外，脂質(zhì)體的關(guān)鍵質(zhì)量屬性包括形態(tài)、粒徑、包封率、釋放度、靶向性等，其表征方法包括理化性質(zhì)評價和藥理學(xué)評價[5]。

2 靶向脂質(zhì)體的理化性質(zhì)評價

理化性質(zhì)評價通常包括粒徑大小及分布均勻程度、穩(wěn)定性及包封率等方面。粒徑大小及分布除與其包封率及穩(wěn)定性有關(guān)外，同時對載藥脂質(zhì)體的治療效果有直接的影響。因物理和生理作用，機體能夠選擇性地在肝、脾、肺、淋巴等部位聚集不同大小的載藥脂質(zhì)體，從而使其釋放藥物發(fā)揮藥效。脂質(zhì)體形態(tài)與粒徑的檢測主要通過3種途徑：(1)光學(xué)顯微鏡，是最常規(guī)的鏡檢方式，其適于檢測粒徑較大的脂質(zhì)體。(2)電子顯微鏡，是最通用的鏡檢方式，也是直接測定粒徑最準(zhǔn)確的方法。(3)激光散射法，又稱動態(tài)光散射法，能夠測定出脂質(zhì)體樣品的平均粒徑[6]。

穩(wěn)定性是通過檢測Zeta電位來評價的。Zeta電位越高，粒子間的斥力越大，體系因不易聚集從而穩(wěn)定性越強。此外，Zeta電位高時進入擴散層的反離子較多，吸附層的反離子較少，在膠粒周圍會產(chǎn)生水化膜從而穩(wěn)定性好，因為離子在雙電層中具有較強的水化作用[7]。

包封率一般采用重量包封率表示，其測定時須分離載藥脂質(zhì)體和游離藥物。包封率受藥物的性質(zhì)、粒徑、藥脂比、制備方法等多種因素影響。測定方法包括紫外分光光度法、電子順磁波譜法、核磁共振波譜、高效液相色譜法及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法[8]。新藥研發(fā)中，要求脂質(zhì)體對藥物的包封率一般不得低于80%。

3 靶向脂質(zhì)體的藥理學(xué)評價

3.1靶向脂質(zhì)體的藥效學(xué)評價 靶向脂質(zhì)體的藥效學(xué)評價是指經(jīng)過科學(xué)、嚴(yán)格的實驗，并經(jīng)過與已上市及公認(rèn)的經(jīng)典藥物比較，至少在體內(nèi)及體外2種以上的模型上進行實驗，從而客觀評價新制劑的優(yōu)劣。脂質(zhì)體所荷載的藥物主要包括抗腫瘤藥物、抗生素及抗病毒藥物等。近年來，在抗肝損傷、抗動脈粥樣硬化、抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗腦卒中、抗血栓及抗腫瘤等體內(nèi)實驗研究中，承載常規(guī)藥物或基因藥物的靶向脂質(zhì)體得到了廣泛應(yīng)用，并表現(xiàn)出了明顯的高效、低毒等優(yōu)良特性。

抗腫瘤藥物脂質(zhì)體是近年來研究的熱點之一?？鼓[瘤靶向脂質(zhì)體的體外藥效學(xué)評價包括MTT等方法檢測腫瘤細胞的增殖，TUNEL法檢測細胞的凋亡，劃痕法檢測細胞的遷移，Transwell法檢測細胞的侵襲等。體內(nèi)藥效學(xué)評價一般以荷瘤鼠為研究對象，觀察實驗鼠的生存狀態(tài)(包括精神狀態(tài)、自主活動、毛發(fā)狀態(tài)等)，記錄動物的體重，測量腫瘤的大小及計算腫瘤抑制率，檢測血清中的氧化炎癥因子及腫瘤標(biāo)志物，分子生物學(xué)手段檢測目的基因及目的蛋白的表達等[9]。

抗生素靶向脂質(zhì)體的體外藥效學(xué)評價一般通過LPS刺激RAW264.7細胞致炎癥模型進行，實驗檢測體系包括腫瘤壞死因子、白細胞介素、一氧化氮等炎癥因子水平的檢測及活性氧水平的檢測等。體內(nèi)藥效學(xué)評價一般采用肝損傷、肺損傷、關(guān)節(jié)炎等動物模型，肝或肺損傷模型的檢測指標(biāo)包括靶組織損傷特異性標(biāo)志物的檢測、血清炎癥及氧化應(yīng)激因子水平的測定，靶組織病理學(xué)檢測、目的基因及目的蛋白的表達檢測等；關(guān)節(jié)炎動物模型的檢測指標(biāo)包括關(guān)節(jié)腫脹度的測定，關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)的測定、血清及關(guān)節(jié)組織炎癥因子水平的測定，關(guān)節(jié)組織病理學(xué)檢測等[10]。

3.2靶向脂質(zhì)體的靶向性評價 在靶向制劑的研究過程中，建立良好的靶向評價體系是必不可少的。首先，需要建立可視化的數(shù)據(jù)或圖表支持制劑靶向、并能夠精準(zhǔn)客觀反映靶向性的評價體系；其次，需要為制劑的條件優(yōu)化提供實驗依據(jù)。體外實驗通常采用細胞攝取實驗，將靶向脂質(zhì)體接上熒光素，再與選定的細胞進行共孵育，一定時間后檢測細胞內(nèi)熒光強度，從而表明制劑的細胞靶向性。體內(nèi)實驗通常采用具體的動物模型，仍然是將靶向脂質(zhì)體接上熒光素，再將其靜脈注射入動物體內(nèi)，一定時間后檢測動物全身各處熒光強度的差異，表明制劑的組織靶向性。

3.2.1體外評價方法 體外評價內(nèi)容包括粒徑大小、電位、體外釋放特性、載藥量檢測、包封率、體外細胞研究、組織切片技術(shù)等。不同類型的靶向制劑最佳的體外評價標(biāo)準(zhǔn)需要根據(jù)其本身及靶標(biāo)的特性以及采用的靶向策略而定。

3.2.1.1粒徑大小 例如，脂質(zhì)體粒徑小于50 nm時一般都能夠靶向至脾組織；在50～100 nm時能靶向至肝組織；在0.1～0.2 μm時能夠靶向至肝組織肝巨噬細胞的溶酶體；在7～12 μm時可被肺組織細胞攝??；>12 μm時能夠被毛細血管上皮細胞攝取進而到達荷瘤組織內(nèi)；>15 μm時能被腸系膜動脈等血管上皮細胞攝取[11]。因此，針對制劑不同大小顆粒的阻留性，可根據(jù)機體不同組織的生理學(xué)特性構(gòu)建靶向釋藥制劑，通過觀察顆粒大小，可對該類制劑的靶向進行評價。

3.2.1.2釋放度測定 釋放度指在一定時間內(nèi)藥物從制劑溶入特定介質(zhì)中的累計百分率。針對靶向脂質(zhì)體的釋放度測定除了選用常規(guī)釋放介質(zhì)外，還需要根據(jù)不同疾病特點選用特定介質(zhì)。某些病變組織常伴有一些物理化學(xué)性質(zhì)的改變，研究指出，腫瘤細胞內(nèi)通常伴有高熱、高酸性、特殊微菌群產(chǎn)生多種酶等特性，因此針對腫瘤通常需要設(shè)計出pH、溫度或酶敏感的靶向制劑。此外，物理化學(xué)因素敏感的靶向脂質(zhì)體主要是通過在不同組織有不同的釋放度這一特點而實現(xiàn)靶向行為；同時還應(yīng)考慮到，理化因素除了會影響藥物擴散速度，還會影響基質(zhì)材料的降解速度[4]。

3.2.1.3體外實驗評價 評價靶向脂質(zhì)體將藥物遞送至靶細胞，主要是通過檢測制劑的細胞攝取率來實現(xiàn)。(1)細胞成像技術(shù)是將熒光素與磷脂等進行結(jié)合，制備具有熒光標(biāo)記的靶向脂質(zhì)體，利用細胞成像等方法檢測靶向效果[12]。(2)激光掃描共聚焦顯微鏡(confocallaserscanningmicroscope，CLSM)可用于實時觀察細胞水平的藥物制劑釋放行為。CLSM原理是對藥物在細胞內(nèi)的相對熒光值進行動態(tài)比較。細胞將大分子物質(zhì)以質(zhì)膜的方式攝入細胞內(nèi)，并由此引發(fā)一系列連續(xù)的過程，如膜小泡的產(chǎn)生、融合及轉(zhuǎn)運等，這是基本且重要的靶向給藥系統(tǒng)內(nèi)化相應(yīng)靶細胞作用的模式，正因為這種模式，通過CLSM可精準(zhǔn)地檢測靶向脂質(zhì)體進行細胞的過程，包括方式、速率及程度等[13-14]。(3)流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是一種在快速直線流動狀態(tài)下進行檢測或分選單列細胞或生物顆粒的技術(shù)，通過流式細胞儀可測定載藥靶向脂質(zhì)體細胞內(nèi)化相對量[15]。有研究將配體樹枝狀聚合物與表柔比星復(fù)合，將復(fù)合物在MCF-7和C16細胞(目標(biāo)細胞)中進行細胞攝取實驗，F(xiàn)CM發(fā)現(xiàn)復(fù)合物在細胞中的熒光強度顯著大于游離多柔比星在細胞中的熒光強度，同時發(fā)現(xiàn)復(fù)合物在MCF-7細胞中的熒光強度要明顯低于其在C16細胞中的光強，表明通過FCM檢測靶向制劑可鑒別靶細胞和非靶細胞[16]。(4)鄰位連接技術(shù)(proximity ligation assay，PLA)常用來檢測腫瘤標(biāo)志物，靈敏度高、特異性強。PLA是將寡核苷酸單鏈分別標(biāo)記在單克隆抗體等試劑上作為鄰位探針，當(dāng)探針在空間上因識別同一靶蛋白而接近時，寡核苷酸的自由端點被拉近，在一個附加連接寡核苷酸的作用下進行雜交實現(xiàn)鄰位連接，連接酶再以連接探針為模板連接探針的輔助核酸序列，從而實現(xiàn)鄰位連接。MIRZAVI等[17]在體外實驗中通過PLA檢測HSP90 的抑制劑TAS-116對其選擇性，結(jié)果顯示，TAS-116對HSP90具有極高的選擇性，能夠?qū)SP90發(fā)揮明顯抑制作用。

3.2.2體內(nèi)實驗評價 體內(nèi)評價主要是采用動物實驗分析藥物在體內(nèi)的藥動學(xué)和藥效學(xué)，方法包括藥動學(xué)/藥效學(xué)模型(PK/PD模型)、成像技術(shù)分析等。

3.2.2.1PK/PD模型 靶向脂質(zhì)體的靶向性可通過體內(nèi)分布直觀地評價。一般以小鼠或荷瘤裸鼠為受試對象，按預(yù)定的給藥途徑將靶向脂質(zhì)體給藥后，于不同的時間點處死動物，取血，分離主要組織并勻漿，測定血清或組織中的藥物水平，據(jù)此繪制血液及不同組織中的藥物濃度-時間曲線，進行動力學(xué)處理，以同劑量非靶向制劑做對照，評價靶向制劑在動物體內(nèi)的分布[18]。通過PK/PD模型檢測制劑的靶向性可由以下3個參數(shù)體現(xiàn)：(1)相對攝取率(re)，其表示不同制劑對同一組織或細胞的選擇性。re越大(一般大于1)代表該制劑對靶組織或細胞的靶向性越好。(2)靶向效率(te)，te越大(一般大于1)表示該制劑對靶組織或細胞的選擇性越好。(3)峰濃度比(Ce)，也反映了不同制劑對同一組織或器官的選擇性。Ce越大表示該制劑改變藥物分布的能力越強[19-20]。

3.2.2.2放射性同位素技術(shù) 放射性同位素標(biāo)記靶向脂質(zhì)體后，通過實驗動物整體自顯影或活體動態(tài)顯影的方式，觀察動物體內(nèi)不同組織、不同時間的藥物分布，優(yōu)點是直觀方便，缺點是不宜定量評價分布情況；也可標(biāo)記載體后制備微粒，給藥后，用新制劑的體內(nèi)變化間接描述藥物的體內(nèi)過程，不同時間處死動物后檢測靶組織放射性強度以評價體內(nèi)過程。此外，還可用放射性同位素標(biāo)記藥物，測定給藥后不同時間各靶器官放射強度，優(yōu)點是靈敏度和重現(xiàn)性均較好[21-23]。

3.2.2.3活體熒光成像(Biofluores-CenceImaging，BFI)技術(shù) BFI技術(shù)多采用近紅外熒光，可用來評估靶向脂質(zhì)體在體內(nèi)的靶向性，特點是穿透能力強及圖像分辨率高。將靶向制劑上接上熒光標(biāo)記物后注射到動物體內(nèi)，再進行實時及原位熒光強度測定。BFI常用染料包括AlexaFluor、CY7、DIR等。研究表明，在關(guān)節(jié)炎大鼠模型上，通過BFI可表征多種腫瘤壞死因子α抑制劑(賽妥珠單抗、阿達木單抗等)在其正常組織和炎癥組織中的分布[24]。此外，粒徑相同但標(biāo)記的不同熒光染料的脂質(zhì)體在動物體內(nèi)的分布也不同相同，可通過BFI進行熒光強度定量，以此對納米載體驅(qū)動藥物在體內(nèi)的分布進行進一步的確證[25]。

4 結(jié) 論

近年來，主動靶向脂質(zhì)體研究最為廣泛，其不僅能夠?qū)⑺幬镏鲃影邢虻桨薪M織從而提高藥物的生物利用度，還能夠負載診斷試劑在腫瘤等疾病診斷領(lǐng)域發(fā)揮獨特優(yōu)勢[26]。但主動靶向脂質(zhì)體藥物與其他脂質(zhì)體藥物一樣同樣存在著部分缺點，如穩(wěn)定性不夠、包被不同藥物的理化性質(zhì)差別較大、制備工藝難以工業(yè)化、包封率及載藥量低下等。但目前，主動靶向脂質(zhì)體種類日益繁多，且新設(shè)計的主動靶向脂質(zhì)體可以同時利用多種靶向功能，如單克隆抗體與長循環(huán)脂質(zhì)體相結(jié)合，能夠明顯增強長循環(huán)脂質(zhì)體的靶向性。靶向脂質(zhì)體存在很多優(yōu)點，但目前大部分相關(guān)研究仍局限于動物體內(nèi)藥效學(xué)及藥動學(xué)研究，且通過動物模型得到的研究結(jié)果并不能完全代表人體的臨床實際情況。雖然靶向脂質(zhì)體應(yīng)用于臨床還有待深入研究，但藥理學(xué)評價方法的發(fā)展和利用將為創(chuàng)制出更多更好的新型靶向脂質(zhì)體提供有力的技術(shù)支撐，使其作為載體在疾病的治療和診斷中具有更廣闊的應(yīng)用前景。