徐雯琦,高 宇,李慧穎,南光賢

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130033)

腦卒中具有高死亡率及高致殘率的特點，其死亡率在全球范圍內(nèi)位居第二[1]，其所導(dǎo)致的長期殘疾為家庭和社會帶來了沉重的負擔(dān)。治療缺血性腦卒中最有效的策略之一是立即恢復(fù)大腦的血流，盡管這會導(dǎo)致進一步的細胞壞死和神經(jīng)損傷，即缺血再灌注損傷?，F(xiàn)階段已經(jīng)有關(guān)于缺血性卒中的研究[2-3]發(fā)現(xiàn)了先天免疫系統(tǒng)炎癥相關(guān)的損傷機制引發(fā)了神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞的死亡，進而導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損癥狀。且Endres等人[4]發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)強烈的炎癥反應(yīng)。NLRP3炎癥小體是研究最深入的炎癥小體，它是一種體內(nèi)先天免疫機制形成的無菌性免疫復(fù)合體，其主要有NLRP3、凋亡相關(guān)斑點狀接頭蛋白ASC和下游效應(yīng)酶procaspase-1組成。NLRP3炎癥體促進caspase-1的激活，caspase-1將IL-1β和IL-18的前體裂解成活性形式，特異性地介導(dǎo)缺血性卒中期間對無菌組織損傷的炎癥反應(yīng)，并推動一種稱為焦亡的炎性細胞死亡[5]。已經(jīng)有研究[6]證實缺血性腦卒中后神經(jīng)元死亡與炎癥小體的激活有關(guān)，但是炎癥小體激活是否參與缺血及缺血再灌注后血管內(nèi)皮細胞損傷，其證據(jù)尚不充足。因為血腦屏障的破壞已經(jīng)成為缺血及缺血再灌注后腦損傷的主要機制之一，所以研究血腦屏障的破壞機理尤為必要。已有動物實驗研究[7-8]表明，NLRP3炎癥小體通過減少梗塞面積和血腦屏障損傷改善了缺血性卒中后小鼠的腦損傷。為了進一步研究NLRP3炎癥小體與缺血性腦卒中血腦屏障破壞的關(guān)系，本研究以bEnd.3細胞系為主要研究對象，觀察在不同氧糖剝奪及復(fù)氧復(fù)糖時間點NLRP3炎癥小體及其下游因子的表達變化。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

bEnd.3細胞系購于ATCC

1.2 主要試劑、材料和儀器

DMEM無糖培養(yǎng)基(Gibico)，DMEM培養(yǎng)基(Gibico)，胎牛血清(Gibico)，胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)(Solarbio)，抗NLRP3抗體(ABMART)，抗β-actin抗體(Affinity)，鼠二抗(Cell Signaling Technology)，BCA蛋白定量試劑盒(Signalway)，小鼠白介素IL-1β、IL-18Elisa試劑盒(Bioswamp)厭氧培養(yǎng)袋(日本三菱)，厭氧袋產(chǎn)氣包(日本三菱)，恒溫二氧化碳培養(yǎng)(Sanyo)，顯微鏡(Nikon)，垂直板電泳槽、電轉(zhuǎn)槽(Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1bEnd.3細胞培養(yǎng) bEnd.3細胞用含10%胎牛血清、1% 青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在 37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2氧糖剝奪再復(fù)氧復(fù)糖模型制作 棄掉細胞培養(yǎng)皿中原有培養(yǎng)基，PBS洗一次，棄掉PBS，換成DMEM無糖培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)袋中，迅速排出袋中空氣，將厭氧產(chǎn)氣袋放入培養(yǎng)袋內(nèi)，再將培養(yǎng)袋密封好，放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2、4、6 h后取出細胞，棄掉DMEM無糖培養(yǎng)基，換成含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育6、12、24 h，取出細胞后繼續(xù)進行后續(xù)實驗。

1.3.3Western blot 用胰酶消化收集各組細胞，PBS清洗2次，加入適量體積的ripa裂解液，在預(yù)冷的離心機中12000rcf離心10 min，收集上清液即為細胞總蛋白。根據(jù)BCA法進行蛋白定量，測定蛋白濃度。取相同質(zhì)量的蛋白樣本進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉進行封閉，TBST洗3次，用鼠抗NLRP3、β-actin抗體4℃孵育過夜，TBST清洗3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗避光孵育1 h,將PVDF膜放置在Odyssey掃膜儀上掃描，并用ImageJ進行定量分析。

1.3.4ELISA 取對數(shù)生長期的bEnd.3細胞，按照每孔12000個細胞濃度接種于6孔板，培養(yǎng)36小時后，制作相應(yīng)時間點的氧糖剝奪及復(fù)氧復(fù)糖模型，收集各組細胞上清液，按小鼠白介素IL-1β、IL-18ELISA試劑盒說明書加入試劑盒內(nèi)的試劑，用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即為各組IL-1β及IL-18的濃度含量。

2 結(jié)果

2.1 OGD2h、4h、6h，bEnd.3細胞中NLRP3、caspase-1的表達情況及IL-1β、IL-18的濃度水平

氧糖剝奪后NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18對照組表達水平較低，OGD2h時NLRP3表達較對照組略升高，caspase-1表達較對照組略升高(P<0.05)，IL-1β、IL-18濃度較對照組略升高。OGD4h時NLRP3表達進一步升高(P<0.01)，caspase-1表達進一步升高(P<0.01)，IL-1β、IL-18濃度進一步升高。OGD6h時NLRP3表達升高(P<0.01)，但低于OGD4h組，仍高于對照組，caspase-1表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，IL-1β、IL-18濃度升高，但低于OGD4h組，仍高于對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。

注：與對照組相比，*表示有統(tǒng)計學(xué)意義，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 在OGD6hR6h、12h、24h，bEnd.3細胞中NLRP3、caspase-1的表達情況及IL-1β、IL-18的濃度水平

氧糖剝奪6 h后復(fù)氧復(fù)糖，NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18對照組表達水平較低，復(fù)氧復(fù)糖6 h時NLRP3表達較對照組非常顯著升高(P<0.001),caspase-1表達較對照組非常顯著升高(P<0.0001),IL-1β、IL-18濃度水平較對照組升高(P<0.05)。復(fù)氧復(fù)糖12 h時NLRP3表達較對照組顯著升高(P<0.01),caspase-1表達較對照組非常顯著升高(P<0.0001)，IL-1β、IL-18濃度水平較對照組升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。復(fù)氧復(fù)糖24 h時NLRP3表達較對照組顯著升高(P<0.01)，caspase-1表達較對照組非常顯著升高(P<0.0001)，IL-1β、IL-18濃度水平較對照組升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨著再灌注時間的延長，NLRP3、caspase-1的表達水平及IL-1β、IL-18的濃度水平均呈逐漸下降的趨勢，見圖 2。

3 討論

缺血性卒中后的病理生理學(xué)是一系列復(fù)雜的過程，包括酸中毒、興奮毒性、生物學(xué)功能障礙、血腦屏障破壞、活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激、白細胞浸潤、細胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、細胞離子穩(wěn)態(tài)喪失以及花生四烯酸產(chǎn)物的產(chǎn)生和補體的激活。在卒中的多種潛在機制中，氧化應(yīng)激和炎癥參與了腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機制，適當(dāng)調(diào)節(jié)炎癥對卒中的預(yù)防和治療有重要作用。研究表明[9-10]，NLRP3相關(guān)蛋白主要在內(nèi)皮細胞和小膠質(zhì)細胞中表達。當(dāng)前關(guān)于NLRP3炎癥小體在內(nèi)皮細胞中缺血再灌注損傷早期表達規(guī)律的研究報道較少。本研究采用體外缺氧缺糖再復(fù)氧模型模擬腦缺血再灌注損傷，分別于氧糖剝奪2、4、6 h和氧糖剝奪6 h復(fù)氧復(fù)糖0 h、6 h、12 h和24 h不同時間點觀察NLRP3炎癥小體及其下游因子的蛋白及濃度的動態(tài)變化，觀察其在血管內(nèi)皮細胞中缺血再灌注損傷早期的變化規(guī)律，為腦缺血再灌注損傷中血腦屏障的破壞情況，提供一定的理論依據(jù)。

注：與對照組相比，*表示有統(tǒng)計學(xué)意義，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

腦缺血再灌注過程中產(chǎn)生大量的活性氧，使NLRP3炎癥小體激活，進一步促進caspase-1、IL-1β、IL-18的生成。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧缺糖條件下，對照組NLRP3蛋白水平及IL-1β、IL-18濃度水平較低，缺氧缺糖2 h表達略增加，于4 h達到高峰后，6 h下降。該結(jié)果提示，缺氧缺糖4 h時，炎癥小體對血管內(nèi)皮細胞損傷較大。缺氧缺糖再復(fù)氧條件下，對照組NLRP3蛋白水平及IL-1β、IL-18濃度水平較低,復(fù)氧復(fù)糖后6 h表達增加，12 h下降，24 h進一步下降。該結(jié)果提示，復(fù)氧復(fù)糖6 h時，炎癥小體對血管內(nèi)皮細胞損傷較大，隨著復(fù)氧時間的延長，炎癥小體在血管內(nèi)皮細胞中的表達逐漸減少，對血腦屏障的影響逐漸減小，說明在此期間復(fù)氧復(fù)糖對血管內(nèi)皮細胞起到一定的保護作用。

眾所周知，炎癥是有害還是有益，取決于缺血性損傷的嚴重程度、頻率和持續(xù)時間。早期的炎癥反應(yīng)可能會加重缺血性損傷，而晚期的炎癥反應(yīng)可能有助于修復(fù)受損的血腦屏障和組織。本研究探索了炎癥小體在缺血及缺血再灌注后血管內(nèi)皮細胞中的表達情況，以及炎癥小體對腦卒中后血腦屏障損傷的影響，為缺血性卒中患者開發(fā)新治療策略提供了線索。