胡進(jìn)紅，宋 繁，梁旺利，于雯靜，王玲霞，梁文裕

(寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,銀川 750021)

土壤鹽堿化是全球生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的日益嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。鹽脅迫是植物面臨的主要非生物脅迫之一，會(huì)導(dǎo)致植物遭受離子毒害、滲透脅迫和氧化損傷[1]，對(duì)植物形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、代謝、酶活性以及離子運(yùn)輸、吸收和分配等產(chǎn)生不利影響，可降低植物生物量、葉肉導(dǎo)度、氣體交換、蒸騰速率和光合能力[2-3]。而且鹽脅迫下的Na+在葉綠體中快速、過(guò)度積累會(huì)導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響光系統(tǒng)Ⅱ功能和電子通量密度[4]。因此，鹽脅迫對(duì)植物光合機(jī)構(gòu)和光合作用具有明顯的影響。

寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)是茄科枸杞屬的多年生落葉灌木，其果實(shí)枸杞子是著名藥材，根、莖、葉和籽也都具有豐富的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值[5]。此外，寧夏枸杞具有耐鹽堿和繁殖能力強(qiáng)等優(yōu)良特性[6]，也是鹽堿地改良和園林綠化的優(yōu)選藥用植物。雖然目前鹽脅迫對(duì)寧夏枸杞的光合生理的影響有了初步的認(rèn)識(shí)，如枸杞葉肉細(xì)胞形狀改變，葉綠體結(jié)構(gòu)變形，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔限制值和氣孔導(dǎo)度隨NaHCO3脅迫濃度的升高而下降，但細(xì)胞間隙CO2濃度升高，水分利用率呈先升后降的趨勢(shì)[7]。由于鹽脅迫下植物光合作用相關(guān)基因的差異表達(dá)對(duì)光合速率和光合活性具有重要的調(diào)控作用[8]，而寧夏枸杞在鹽脅迫條件下光合機(jī)構(gòu)及光合作用相關(guān)基因如何響應(yīng)鹽脅迫的機(jī)制并不明確。因此，本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)方法對(duì)寧夏枸杞響應(yīng)NaCl脅迫的光合作用相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，采用 qRT-PCR 進(jìn)一步分析重要基因差異表達(dá)規(guī)律，并對(duì)光合代謝相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而解析NaCl脅迫條件下寧夏枸杞光合相關(guān)基因差異表達(dá)規(guī)律，為深入認(rèn)識(shí)寧夏枸杞耐鹽堿的光合分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，也為寧夏枸杞的開(kāi)發(fā)利用和耐鹽品種的培育提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

寧夏枸杞品種‘寧杞1號(hào)’由寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞工程技術(shù)研究所惠贈(zèng)。寧夏枸杞幼苗基質(zhì)培養(yǎng)1個(gè)月后進(jìn)行Hoagland營(yíng)養(yǎng)液水培(溫度25±2 ℃、濕度42%、光周期16 h/8 h、光照強(qiáng)度60 μmol·m-2·s-1)，培養(yǎng)至8～12葉期時(shí)，將長(zhǎng)勢(shì)一致、健康的幼苗在添加NaCl的Hoagland溶液中進(jìn)行NaCl脅迫處理。試驗(yàn)共設(shè)置0 (對(duì)照組A)、100 (處理組B)、200 (處理組C)和300 (處理組D)mmol/L NaCl等4個(gè)處理。NaCl處理后第7天采集葉片樣品(圖1)，每個(gè)處理分別隨機(jī)剪取葉肉組織3 g混勻，液氮處理后，置于-80 ℃冰箱中備用。各處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及cDNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建不同濃度NaCl脅迫處理的寧夏枸杞葉片總RNA利用(Tiangen)多糖多酚植物總RNA提取試劑盒進(jìn)行提取。樣品總RNA質(zhì)量檢測(cè)合格后構(gòu)建cDNA測(cè)序文庫(kù)。使用 Qubit2.0初步定量測(cè)序文庫(kù)，稀釋至1 ng/μL的文庫(kù)插入片段采用安捷倫2100進(jìn)行檢測(cè)。使用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)方法準(zhǔn)確定量插入片段符合預(yù)期文庫(kù)的有效濃度(文庫(kù)有效濃度>2 nmol/L)，以確保其質(zhì)量達(dá)到送樣要求。

1.2.2 Illumina HiSeq 測(cè)序、質(zhì)控及從頭組裝通過(guò)高通量Illumina HiSeq PE150測(cè)序平臺(tái)對(duì)已構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序獲得原始數(shù)據(jù) (raw reads)，將原始數(shù)據(jù)中帶接頭(adapter)的讀段(reads)、無(wú)法確定堿基信息比例大于10%的讀段和低質(zhì)量讀段進(jìn)行過(guò)濾處理，獲得干凈讀段(clean reads)。利用Trinity軟件對(duì)干凈讀段(clean reads)進(jìn)行從頭組裝獲得后續(xù)分析的參考序列。

A.0 mmol/L NaCl;B.100 mmol/L NaCl;C.200 mmol/L NaCl;D.300 mmol/L NaCl;下同圖1 不同濃度NaCl處理7 d后的寧夏枸杞幼苗A.0 mmol/L NaCl;B.100 mmol/L NaCl;C.200 mmol/L NaCl;D.300 mmol/L NaCl;The same as belowFig.1 The L. barbarum seedlings stressed under different concentrations of NaCl for 7 days

1.2.3 差異基因功能注釋及差異基因篩選將獲得的轉(zhuǎn)錄組序列在Nr、Pfam、Swiss-prot、KEGG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastx比對(duì)獲得基因功能注釋。采用DESeq2進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析，以P<0.05且[|log2(FoldChange)|>1]為標(biāo)準(zhǔn)篩選與光合作用相關(guān)代謝的差異表達(dá)基因。

1.2.4 光合作用相關(guān)基因的qRT-PCR分析選擇與光合作用相關(guān)的部分重要差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。qRT-PCR定量實(shí)驗(yàn)使用(Vazyme)諾唯贊生物科技有限公司(中國(guó)，南京)試劑盒完成。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中的轉(zhuǎn)錄本序列，用Premier 5.0設(shè)計(jì)目的基因擴(kuò)增引物(表1)，Actin為內(nèi)參基因，用Roche LightCycler480型定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；60 ℃，1 min；共41個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt法[9]對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

表1 基因功能注釋及引物序列Table 1 Gene function annotation and primer sequences

1.2.5 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片光合色素含量測(cè)定葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量參照丙酮比色法測(cè)定[10]。稱取0.2 g葉片，加適量碳酸鈣、二氧化硅和3 mL 80%丙酮研磨至勻漿后，加10 mL 80%丙酮避光提取5 min后，將提取液倒入離心管中4 000 g離心10 min，將上清移至棕色容量瓶中并定容至25 mL。利用紫外分光光度計(jì)(TU-1810,PERSEE,China)在波長(zhǎng)663、646和470 nm下測(cè)定吸光度并按樣品鮮重質(zhì)量計(jì)算鹽脅迫下寧夏枸杞葉片葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。

1.2.6 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片凈光合速率和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性的測(cè)定使用德國(guó)GFS-3000便攜式光合儀測(cè)定寧夏枸杞葉片的凈光合速率。測(cè)定時(shí)設(shè)置氣體流速500 μmol·s-1，氣體混勻器的風(fēng)扇速度為7，葉室溫度為29 ℃，相對(duì)濕度為60%，利用外置光源將PAR設(shè)定為1 800 μmol·m-2·s-1，各處理組選取長(zhǎng)勢(shì)一致的獨(dú)立植株的中部葉片進(jìn)行活體測(cè)定。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)活性采用蘇州夢(mèng)犀生物醫(yī)藥科技有限公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定，按樣品蛋白濃度計(jì)算其活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS Statistics 26.0、Origin和Excel進(jìn)行方差分析、檢驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

樣本測(cè)序數(shù)據(jù)中，每個(gè)樣本的錯(cuò)誤率 ≤ 0.03%，測(cè)序堿基質(zhì)量值大于20的堿基占總體堿基的百分比在97.28%以上、大于30的堿基在91.79%以上。GC含量占總堿基的44%左右，測(cè)序數(shù)據(jù)具有較高的準(zhǔn)確性。對(duì)4個(gè)不同鹽脅迫處理的寧夏枸杞樣本進(jìn)行相關(guān)性檢測(cè)，樣本間的相關(guān)系數(shù)均大于0.771(圖2)，表明測(cè)序數(shù)據(jù)可靠、樣本間重復(fù)性良好且變異不大。

圖2 樣本間皮爾遜相關(guān)系數(shù)Fig.2 Pearson correlation between samples

2.2 NaCl脅迫下寧夏枸杞光合作用相關(guān)基因的差異表達(dá)

對(duì)NaCl脅迫下寧夏枸杞所有差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG pathway顯著性富集分析，篩選富集到與光合作用相關(guān)的代謝途徑的64個(gè)差異表達(dá)基因(P<0.05)(表2)，主要分布在卟啉和葉綠素代謝、類胡蘿卜素生物合成、光反應(yīng)和卡爾文循環(huán)代謝通路。

表2 NaCl脅迫下寧夏枸杞參與光合作用的差異表達(dá)基因Table 2 Differentially expressed genes involved in photosynthesis of L. barbarum under NaCl stress

其中，以0 mmol/L NaCl處理組(A)為對(duì)照，100 mmol/L NaCl處理組(B)寧夏枸杞光合作用相關(guān)的差異表達(dá)基因共有14個(gè)，上調(diào)差異表達(dá)基因?yàn)?個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因有6個(gè)；200 mmol/L NaCl處理組(C)寧夏枸杞光合作用相關(guān)的差異表達(dá)基因共有26個(gè)，上調(diào)差異表達(dá)基因有7個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因19個(gè)；300 mmol/L NaCl處理組(D)寧夏枸杞光合作用相關(guān)的差異表達(dá)基因共有55個(gè)，上調(diào)差異表達(dá)基因有5個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因共有50個(gè)(圖3)?？梢?jiàn)，與光合作用相關(guān)的差異表達(dá)基因數(shù)目隨著NaCl脅迫程度的增加而增加，且下調(diào)基因數(shù)遠(yuǎn)多于上調(diào)基因。

圖3 NaCl 脅迫下寧夏枸杞光合作用相關(guān)差異表達(dá)基因韋恩圖Fig.3 Venn diagram of photosynthesis-related differential genes in L. barbarum under NaCl stress

2.3 NaCl脅迫下寧夏枸杞光合作用相關(guān)基因差異表達(dá)驗(yàn)證分析

隨機(jī)挑選NaCl脅迫下寧夏枸杞的3個(gè)光合作用相關(guān)差異表達(dá)基因ATPε、CLH2、Lhcb3進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果(圖4)表明，隨著NaCl脅迫程度的加深，ATP合酶ε亞基基因(ATPε)表達(dá)量呈顯著下降的趨勢(shì)(P<0.05)，但100、200和300 mmol/L NaCl處理組之間無(wú)顯著差異；葉綠素酶2基因(CLH2)表達(dá)量隨著NaCl脅迫程度的加深呈顯著下降的趨勢(shì)，并且各處理組間均差異顯著(P<0.05)；捕光色素復(fù)合體Ⅱ葉綠素a/b結(jié)合蛋白3基因(Lhcb3)在NaCl脅迫條件下總體呈顯著下降趨勢(shì)，并且各處理組間也均差異顯著(P<0.05)?？梢?jiàn)，qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq測(cè)序結(jié)果基本一致。

不同小寫(xiě)字母表示處理組之間在0.05水平差異顯著(P<0.05)；下同圖4 不同NaCl脅迫下寧夏枸杞光合相關(guān)基因的qRT-PCR分析Different normal letters indicate that there are significant differences between treatment at 0.05 level (P<0.05);The same as belowFig.4 Analysis of qRT-PCR data of photosynthesis-related genes in leaves of L. barbarum under NaCl stress

續(xù)表2 Continued Table 2

2.4 NaCl脅迫下寧夏枸杞光合色素含量的變化

圖5顯示，寧夏枸杞葉片葉綠素a含量隨NaCl脅迫程度的增加呈顯著降低的趨勢(shì)，而100、200、300 mmol/L NaCl處理間無(wú)顯著差異，它們均顯著低于對(duì)照；葉綠素b含量也隨NaCl脅迫程度增加呈逐漸降低的趨勢(shì)，且200和300 mmol/L NaCl處理與對(duì)照差異顯著，但在100、200、300 mmol/L NaCl處理間無(wú)顯著差異；類胡蘿卜素含量隨NaCl脅迫程度的增加無(wú)顯著變化。

圖5 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片光合色素含量變化Fig.5 Changes of photosynthetic pigment contents in leaves of L. barbarum under NaCl stress

2.5 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片凈光合速率和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性的變化

寧夏枸杞葉片的凈光合速率和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)活性均隨著NaCl脅迫程度的加深呈現(xiàn)逐漸顯著下降的趨勢(shì)(P<0.05)，各NaCl脅迫處理均顯著低于對(duì)照，200 和300 mmol/L NaCl處理又均低于100 mmol/L NaCl處理，而200 和300 mmol/L NaCl處理相比均無(wú)顯著差異(圖6)。

圖6 NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片凈光合速率和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性變化Fig.6 Changes of net photosynthetic rate and Rubisco activities in leaves of L. barbarum under NaCl stress

3 討 論

3.1 NaCl脅迫對(duì)寧夏枸杞光合色素相關(guān)基因差異表達(dá)的影響

植物對(duì)外界環(huán)境變化響應(yīng)的重要途徑之一是調(diào)控葉綠素總含量及類胡蘿卜素含量變化[11]。葉綠素代謝是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，鹽脅迫會(huì)打破這種平衡，使植物細(xì)胞色素代謝紊亂，從而直接降低了植物的光合能力[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl脅迫程度的增加寧夏枸杞葉片的葉綠素含量顯著下降，說(shuō)明高濃度NaCl顯著影響了葉綠素的合成或分解。PAO、MCS和CLHs是葉綠素降解途徑的關(guān)鍵酶，POR、CAO等是葉綠素合成途徑的關(guān)鍵酶[13]。NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片PAO和MCS基因上調(diào)表達(dá)，而CLH2、CAO、POR基因下調(diào)表達(dá)，表明NaCl脅迫促進(jìn)了寧夏枸杞葉綠素降解而抑制了葉綠素合成，進(jìn)而導(dǎo)致葉綠素含量下降。因此，NaCl脅迫可導(dǎo)致寧夏枸杞通過(guò)誘導(dǎo)葉綠素合成相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)和降解相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控葉綠素含量下降。

類胡蘿卜素具有捕獲光能、傳遞電子、防御光破壞、清除活性氧等作用[14]。番茄紅素ε-環(huán)化酶(LCYE)將ε環(huán)連接到番茄紅素上生成δ-胡蘿卜素，隨后在番茄紅素β-環(huán)化酶(CYCB)的催化下將β環(huán)連接到δ-胡蘿卜素的末端生成α-胡蘿卜素；CYCB在番茄紅素的2個(gè)末端各增加一個(gè)β環(huán)來(lái)催化產(chǎn)生β-胡蘿卜素[15]。α-胡蘿卜素在ε-胡蘿卜素羥化酶(CYP97C)和β-胡蘿卜素羥化酶(BCH3)的共同作用下最終生成葉黃素[16]。在煙草中過(guò)表達(dá)番茄紅素環(huán)化酶基因Ntb-LCY1不僅增加了β-胡蘿卜素、葉黃素等類胡蘿卜素的含量，同時(shí)也提高了清除活性氧的能力，從而提高煙草耐鹽和抗旱能力[17]。本研究發(fā)現(xiàn)寧夏枸杞葉片CYCB和BCH3基因在NaCl脅迫下上調(diào)表達(dá)，LCYE基因在高濃度NaCl脅迫下下調(diào)表達(dá)，而在低NaCl濃度下表達(dá)沒(méi)有顯著差異，而且類胡蘿卜素含量沒(méi)有隨著NaCl脅迫程度的增加發(fā)生顯著變化，表明寧夏枸杞在NaCl脅迫下可通過(guò)誘導(dǎo)CYCB、BCH3和LCYE基因差異表達(dá)進(jìn)而調(diào)控類胡蘿卜素含量保持穩(wěn)定，從而參與調(diào)控光合活性或維持ROS代謝平衡。

3.2 NaCl脅迫對(duì)寧夏枸杞光反應(yīng)相關(guān)基因差異表達(dá)的影響

光合電子傳遞發(fā)生在葉綠體類囊體膜上，由捕光色素復(fù)合體(LHC)捕獲和傳遞光子，在放氧蛋白復(fù)合體的作用下將水分子氧化放氧。同時(shí)，Lhcb3、Lhcb4和Lhcb6在維持光系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能上也起重要作用[18]。有研究表明寧夏枸杞在300 mmol/L NaCl脅迫下葉綠體內(nèi)類囊體膜發(fā)生解體，基粒片層數(shù)目減少或膨脹，排列疏松，同時(shí)雙層膜受到破壞，出現(xiàn)大的空泡現(xiàn)象[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，寧夏枸杞葉片光反應(yīng)中的捕光色素復(fù)合體LHC相關(guān)基因Lhca2、Lhca5、Lhcb1、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5、Lhcb6在高濃度NaCl脅迫下均下調(diào)表達(dá)，而在低濃度NaCl脅迫下表達(dá)無(wú)顯著差異，表明低濃度NaCl脅迫下雖然寧夏枸杞凈光合速率和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性有下降現(xiàn)象，但其葉綠體結(jié)構(gòu)完整[19]，且LHC相關(guān)基因正常表達(dá)，可維持正常的光合作用和生理代謝，但高濃度NaCl脅迫導(dǎo)致寧夏枸杞葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，抑制了捕光色素復(fù)合體基因的表達(dá)，降低了捕獲和傳遞光子能力，進(jìn)而顯著影響了光合活性。

光系統(tǒng)Ⅱ是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的多蛋白復(fù)合體，參與各種調(diào)節(jié)和修復(fù)過(guò)程。鹽脅迫產(chǎn)生的離子脅迫和滲透脅迫會(huì)使PSⅡ反應(yīng)中心受到損傷，從而導(dǎo)致植物的光合電子傳遞效率和PSⅡ的光合活力降低[20]。PSⅡ相關(guān)蛋白CP47(PsbT)和CP43能夠結(jié)合近30個(gè)葉綠素分子從而發(fā)揮內(nèi)在光捕獲功能[21]。PsbP和PsbQ是PSⅡ超復(fù)合體的外部亞基，負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)PSⅡ的供體側(cè)和受體側(cè)的活性以及穩(wěn)定PSⅡ-LHCⅡ超復(fù)合物方面具有特定且重要的作用[22]，也是維持水的光解反應(yīng)所必需的。Psb28可能參與了PSⅡ損傷修復(fù)，影響PSⅡ-LHCⅡ超級(jí)復(fù)合物的組裝和穩(wěn)定性[23]。Psb27是PSⅡ重要的組裝修復(fù)因子之一，可使Mn與PSⅡ放氧復(fù)合體OEC更容易結(jié)合[24]。在本研究中，PSⅡ相關(guān)蛋白基因PsbT、PsbP、PsbQ、Psb27、Psb28在高濃度NaCl脅迫下均下調(diào)表達(dá)，而在低濃度NaCl脅迫下表達(dá)無(wú)顯著差異，表明高濃度NaCl脅迫影響了PsbT、PsbP、PsbQ、Psb27、Psb28的表達(dá)，降低了PSⅡ電子傳遞效率，進(jìn)而降低了光合速率。而低濃度NaCl脅迫對(duì)PSⅡ相關(guān)蛋白基因的影響不明顯。

PSⅠ中的PsaN是真核綠藻和植物PSⅠ所特有，也是PSⅠ唯一位于類囊體腔側(cè)的膜外在亞基。PsaD對(duì)于PSⅠ-LHCⅠ復(fù)合物的正確組裝非常必要，如擬南芥中PsaD含量降低會(huì)導(dǎo)致PSⅠ復(fù)合物成比例的下降[25]。鐵氧還蛋白系統(tǒng)是葉綠體光驅(qū)動(dòng)電子傳輸、將還原力輸出到細(xì)胞質(zhì)和NADP+生成的調(diào)節(jié)器[26]。葉綠體類囊體膜上的F型ATP合酶在質(zhì)子電化學(xué)梯度的作用下，利用底物ADP和Pi合成ATP。在本研究中，PSⅠ相關(guān)蛋白基因PsaN和PsaD、鐵氧還蛋白基因petF以及F型ATP合酶基因ATPδ、ATPγ和ATPε在高濃度NaCl脅迫下均下調(diào)表達(dá)，但在低濃度NaCl脅迫下表達(dá)無(wú)顯著差異。這表明高濃度NaCl脅迫可顯著影響PSⅠ相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，降低了PSⅠ電子傳遞效率，而低濃度NaCl脅迫對(duì)PSⅠ相關(guān)蛋白基因的影響不明顯。

3.3 NaCl脅迫對(duì)寧夏枸杞卡爾文循環(huán)相關(guān)基因差異表達(dá)的影響

葉綠體中依賴NADP的蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)能夠平衡葉綠體中ATP/NADPH比例的穩(wěn)定[27]。葉綠體型果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)是卡爾文循環(huán)中的關(guān)鍵酶之一，參與CO2接受體再生的反應(yīng)，催化果糖-1,6-二磷酸生成果糖-6-磷酸，并且也參與葉綠體中淀粉的合成[28]。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)活性水平與卡爾文循環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)速率有關(guān)[29]，寧夏枸杞葉片中GAPDH的活性也隨著NaCl脅迫程度的增加而顯著下降[30]。Rubisco是卡爾文循環(huán)中最重要的限速酶，可催化植物光合作用中CO2的固定，逆境脅迫引起的Rubisco活性下降會(huì)使1,5-二磷酸核酮糖和3-磷酸甘油的含量下降并抑制無(wú)機(jī)磷的再生，進(jìn)而影響光合作用[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫可誘導(dǎo)寧夏枸杞MDH、FBP、rbcS和GAPDH下調(diào)表達(dá)，而且Rubisco活性和葉片凈光合速率逐漸下降。由于高濃度NaCl脅迫破壞了寧夏枸杞葉綠體結(jié)構(gòu)[19]，可能通過(guò)影響光合色素平衡和光反應(yīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定，誘導(dǎo)卡爾文循環(huán)相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)，相關(guān)蛋白(酶)表達(dá)量下降，卡爾文循環(huán)代謝活性降低，進(jìn)而影響光合作用。

綜上所述，NaCl脅迫條件下，寧夏枸杞葉片中的葉綠素含量下降，凈光合速率和Rubisco活性亦下降，大部分光合作用相關(guān)差異基因下調(diào)表達(dá)。寧夏枸杞通過(guò)光合作用相關(guān)基因的差異表達(dá)，參與調(diào)控光合活性以響應(yīng)NaCl脅迫(圖7)。

圖7 寧夏枸杞響應(yīng)NaCl脅迫的光合作用相關(guān)基因差異表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Regulatory network of photosynthesis-related differential genes in L. barbarum under NaCl stress