林少輝 賈 迪 趙煒明 趙正林 高 涵 師 巖

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見、最具侵襲性的惡性腫瘤[1]，患者的中位生存期約為14個(gè)月，5年生存率不足5%[2]。目前GBM的治療主要采用手術(shù)切除，術(shù)后輔以放療及替莫唑胺（temozolomide，TMZ）化療的綜合治療方式[3]，然而其療效仍不滿意[4]。因此，尋找新型、高效、穩(wěn)定的GBM治療藥物具有重要意義。多金屬氧酸鹽（polyoxometalates，POMs），簡稱多酸，是一類含有前過渡金屬元素的陰離子氧簇化合物[5]，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特、溶解度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等特性[6-7]，是潛在的抗癌候選藥物[8]。

本課題組前期成功合成多酸化合物{BiW8O30}，并研究發(fā)現(xiàn)其在肉瘤治療中具有顯著抗腫瘤作用[9]。目前，尚未有研究者將{BiW8O30}應(yīng)用于GBM中，故本研究以U251細(xì)胞為研究對象，探討{BiW8O30}對GBM細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，為GBM治療藥物的研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人 膠 質(zhì) 母 細(xì) 胞 瘤U251、U87細(xì) 胞（貨 號iCell-h219、iCell-h224）購自賽百慷（上海）生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)液（貨號KGM12800N）購自美國Sigma公司；胎牛血清（貨號BI-C04001）購自美國BI公司；CCK-8試劑盒（貨號SC119-02）購自北京賽文創(chuàng)新有限公司；Matrigel基質(zhì)膠（貨號BD356234）購自美國Corning公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（貨號BA00101）購自北京四正柏生物科技有限公司；替莫唑胺（貨號HY-17364）購自美國MCE公司；多酸化合物{BiW8O30}，分子式：Na6H4[Bi2W20Co2O70（H2O）6]·34H2O，由宮麗閣課題組（哈爾濱理工大學(xué)）提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

U251、U87細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 {BiW8O30}藥液配制

配 制{BiW8O30}母 液（100 μmol/L），稱 取{BiW8O30}化合物6.20 mg，溶于10 ml DMEM完全培養(yǎng)基，并用0.22 μm濾膜過濾為無菌母液，稀釋至不同濃度。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)

將U251、U87細(xì)胞接種在96孔板中孵育過夜，加入{BiW8O30}藥液（濃度分別為0、25、50、100 μmol/L）和替莫唑胺（濃度分別為0、200、400、800、1600 μmol/L），培養(yǎng)24、48 h，于450 nm處測定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將U251細(xì)胞接種在6孔板中，貼壁后加入{BiW8O30}藥液，培養(yǎng)1～2周后，進(jìn)行染色、拍照和計(jì)數(shù)。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將U251細(xì)胞接種在6孔板孵育過夜，用1000 μl槍頭進(jìn)行劃痕，PBS清洗，加入{BiW8O30}無血清藥液，分別于0、24、48 h拍照。

1.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將基質(zhì)膠鋪至小室上室中，U251細(xì)胞接種至上室，下室加入10% FBS培養(yǎng)基，培養(yǎng)24、48 h后進(jìn)行固定、染色和計(jì)數(shù)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)

將U251接種在6孔板中孵育過夜，加入{BiW8O30}藥液，培養(yǎng)24 h后消化收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入AnnexinVFITC、PI混勻，用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 {BiW8O30}、替莫唑胺抑制U251與U87細(xì)胞的存活率

CCK-8結(jié)果顯示，{BiW8O30}對U251、U87細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分 別 為（85.57±1.30）、（162.50±3.65）μmol/L。

替莫唑胺對U251、U87細(xì)胞IC50分別為（444.83±4.38）、（808.73±5.96）μmol/L。見 圖1。{BiW8O30}對U251細(xì)胞抑制效果更強(qiáng)，故選用U251細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 {BiW8O30}、替莫唑胺對U251、U87細(xì)胞存活率的影響

2.2 {BiW8O30}對U251細(xì)胞存活率的影響

25、50、100 μmol/L濃度組的細(xì)胞存活率顯著低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001）。見表1。表明{BiW8O30}能抑制U251細(xì)胞增殖并呈濃度依賴性。

表1 {BiW8O30}對U251細(xì)胞存活率的影響（%，±s）

表1 {BiW8O30}對U251細(xì)胞存活率的影響（%，±s）

注 與空白對照組比較，***P ＜ 0.001

濃度（μmol/L） 24 h 48 h 0 100.00±2.04 100.00±1.94 25 83.37±2.07*** 80.32±3.06***50 68.25±2.52*** 56.16±2.64***100 44.37±0.15*** 36.14±1.59***F值 451.900 412.700 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 {BiW8O30}抑制U251細(xì)胞的克隆形成能力

25、50、100 μmol/L濃度組的細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001）。見表2、圖2。表明{BiW8O30}能抑制U251細(xì)胞的克隆形成能力并呈濃度依賴性。

圖2 {BiW8O30}對U251細(xì)胞克隆形成能力的影響

表2 {BiW8O30}對U251細(xì)胞克隆形成數(shù)的影響（個(gè)，±s）

表2 {BiW8O30}對U251細(xì)胞克隆形成數(shù)的影響（個(gè)，±s）

注 與空白對照組比較，***P ＜ 0.001

濃度（μmol/L） 克隆形成數(shù)0 127.33±7.77 25 90.33±6.81***50 47.67±5.69***100 20.00±3.00***F值 180.900 P值 ＜0.001

2.4 {BiW8O30}抑制U251細(xì)胞的遷移能力

{BiW8O30}處理U251細(xì)胞24、48 h后，25、50、100 μmol/L濃度組的劃痕愈合率顯著低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。見表3、圖3。表明{BiW8O30}能抑制U251細(xì)胞的遷移能力并呈濃度依賴性。

圖3 {BiW8O30}對U251細(xì)胞遷移能力的影響

表3 {BiW8O30}對U251細(xì)胞劃痕愈合率的影響（%，±s）

表3 {BiW8O30}對U251細(xì)胞劃痕愈合率的影響（%，±s）

注 與空白對照組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001

濃度（μmol/L） 24 h 48 h 0 41.04±2.83 63.13±1.96 25 29.95±2.94** 43.95±3.91***50 19.94±1.34*** 32.18±2.55***100 8.03±1.67*** 11.63±0.98***F值 112.100 210.200 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.5 {BiW8O30}抑制U251細(xì)胞的侵襲能力

{BiW8O30}處理U251細(xì)胞24、48 h后，25、50、100 μmol/L濃度組的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001）。見表4、圖4。表明{BiW8O30}能抑制U251細(xì)胞的侵襲能力并呈濃度依賴性。

圖4 {BiW8O30}對U251細(xì)胞侵襲能力的影響

表4 {BiW8O30}對U251細(xì)胞侵襲數(shù)的影響（個(gè)，±s）

表4 {BiW8O30}對U251細(xì)胞侵襲數(shù)的影響（個(gè)，±s）

注 與空白對照組比較， ***P ＜ 0.001

濃度（μmol/L） 24 h 48 h 0 289.67±9.07 380.00 ±15.52 25 222.00±8.54*** 284.33±12.66***50 186.00±6.56*** 201.33±8.51***100 59.67±4.51*** 93.67±6.11***F值 511.400 348.100 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.6 {BiW8O30}促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡

50、100 μmol/L濃度組的細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。見表5、圖5。表明{BiW8O30}能促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡并呈濃度依賴性。

圖5 {BiW8O30}對U251細(xì)胞凋亡的影響

表5 {BiW8O30}對U251細(xì)胞凋亡率的影響（%，±s）

表5 {BiW8O30}對U251細(xì)胞凋亡率的影響（%，±s）

注 與空白對照組比較，**P ＜ 0.01

濃度（μmol/L） 凋亡率0 10.05±2.43 25 14.17±0.49 50 17.59±1.57**100 34.07±2.66**F值 84.570 P值 ＜0.001

3 討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是成人中最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。近年來，隨著手術(shù)切除、放化療和免疫治療等治療方法的發(fā)展，GBM患者的生存和生活質(zhì)量得到了提高[10-11]。然而由于GBM長期浸潤生長在正常腦組織周圍，手術(shù)無法徹底切除腫瘤病灶，且術(shù)后易原位復(fù)發(fā)是其治療失敗的主要原因[12]。因此，尋找更有效的GBM治療藥物是目前的研究重點(diǎn)之一。近年來，POMs藥物的抗腫瘤作用已成為研究熱點(diǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)，POMs藥物在乳腺癌、肝癌等腫瘤中發(fā)揮抗癌作用[13-14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn){BiW8O30}在肉瘤治療中具有顯著抑制作用，為探究{BiW8O30}是否適用于其他腫瘤，本研究首次將{BiW8O30}應(yīng)用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

本研究通過CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn){BiW8O30}對U251細(xì)胞有明顯的抑制作用，并呈濃度依賴性抑制U251細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。本研究發(fā)現(xiàn){BiW8O30}作用U251細(xì)胞的IC50為（85.57±1.30）μmol/L，而臨床標(biāo)準(zhǔn)化療藥物TMZ作用于U251細(xì)胞的IC50為（444.83±4.38）μmol/L，是{BiW8O30}的5.2倍，結(jié)果表明{BiW8O30}在GBM的治療中相對于TMZ表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用，具有較大潛力。細(xì)胞劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，{BiW8O30}呈濃度依賴性抑制U251細(xì)胞的遷移和侵襲能力。鑒于GBM在腦中的特殊位置，其發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲密切相關(guān)[15]，抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能抑制其進(jìn)一步擴(kuò)散，是影響GBM治療效果的關(guān)鍵因素。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是化療藥物發(fā)揮治療作用的重要方式，研究結(jié)果顯示，{BiW8O30}能濃度依賴性地促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡，但其誘導(dǎo)凋亡的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了新型多酸化合物{BiW8O30}能夠顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力并促進(jìn)其凋亡，本研究為臨床將{BiW8O30}開發(fā)為新型藥物治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤提供了新的思路，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。