張敏，趙威

摘要：針對目前創(chuàng)面愈合材料抗菌性能差的問題，提出一種負(fù)載溶酶菌的聚氨酯（PU）材料的制備，并對抗菌材料性能進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，選擇相對濕度為25%的PU材料為基底，質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶酶菌制備的復(fù)合材料性能最佳，此時PU/DA-10%Ng的水接觸角為45°，溶菌酶前10 d的總釋放率為42%，對藥物具備滯留和緩釋特性，與細(xì)菌共同培養(yǎng)后，能有效抑制細(xì)菌的生長，表現(xiàn)出良好的抗菌性、藥物緩釋型和親水性。

關(guān)鍵詞：抗菌材料；抗菌性能；溶酶菌；聚氨酯材料

中圖分類號：TQ460文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1001-5922（2023）12-0088-04

Preparation and application effect of a polyurethane?material loaded with lysobacteria

ZHANG Min1，ZHAO Wei2

（1.Shangluo Vocational and Technical College，Shangluo 726000，Shaanxi China；2.Shangluo University，Shangluo 726000，Shaanxi China）

Abstract：In view of the poor antibacterial performance of wound healing materials，a polyurethane （PU） material loaded with lysozyme was proposed，and the properties of antibacterial materials were studied.The test results showed that the composite material prepared with PU material with humidity of 25% and lysozyme bacteria with concentration of 10mg/ml had the best performance.At this time，the water contact angle of PU/DA-10%Ng was 45°，and the total release rate of lysozyme in the first 10 days was 42%，which had the characteristics of drug retention and sustained release.After co-culture with bacteria，it effectively inhibited the growth of bacteria，and exhibited good antibacterial，sustained-release drug and hydrophilicity.

Key words：antibacterial materials; antibacterial properties;lysozyme;polyurethane material

治療糖尿病足傷口創(chuàng)面用的各類材料對抗菌性有很高的抗菌要求，傳統(tǒng)干敷料對傷口愈合沒有促進(jìn)作用，同時還可能受到細(xì)菌的感染，因此需要對傳統(tǒng)敷料進(jìn)行改性。對此，部分學(xué)者也進(jìn)行了很多研究，如以銀離子濕敷料為研究對象，對糖尿病足的情況進(jìn)行改善[1-2]。以敷料基底材料為研究對象，研究了雙層絲素制備的聚氨酯薄膜作為敷料基底的優(yōu)勢[3]。從抗菌性能出發(fā)，研究了增強(qiáng)敷料抗菌性的方法[4-5]。以上研究為糖尿病足敷料的研究提供了參考，但制備的材料綜合性能還有提升的空間?；诖耍囼?yàn)對以上研究進(jìn)行總結(jié)，采用文獻(xiàn)[6]的方法制備了一種綜合性能良好的抗菌材料，為糖尿病足治療材料的選擇提供參考。

1材料與方法

1.1材料與設(shè)備

主要材料：磷酸鹽緩沖液（PBS）磷酸鹽粉劑（分析純），躍騰生物技術(shù)；溶酶菌（生物純），萍聚生物科技；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl） （分析純），遠(yuǎn)達(dá)新材料；聚氨酯材料（標(biāo)準(zhǔn)品），泓潤環(huán)保科技。

主要設(shè)備：SK-R1807-S型翹板搖床（信鈺儀器）；YZG-600型真空干燥箱（升溢干燥設(shè)備）；JSM-IT800型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（思耐達(dá)精密儀器）；SDC-100型接觸角測量儀（華世通精密儀器）；YCS-50AF型水浴恒溫振蕩器（捷呈實(shí)驗(yàn)儀器）。

溶液的配制：PBS緩沖液，在1 000 mL蒸餾水中放入1袋PBS磷酸鹽粉劑，混勻后通過高壓蒸汽滅菌處理，然后4 ℃低溫儲存。

Tris-HCl溶液配制：在600 mL去離子水中倒入4 mL濃度為1.5 mol/L的Tris-HCl，搖勻后調(diào)節(jié)pH值至8.5，備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1PU/DA的制備

（1）在5 mL的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）溶液中溶入10 mg多巴胺（DA）；

（2）將經(jīng)過預(yù)處理，直徑為6 mm 和 15 mm 的圓片層結(jié)構(gòu)的PU材料放入制備的鹽酸多巴胺溶液中浸泡。在SK-R1807-S型翹板搖床的作用下?lián)u晃聚合，搖晃頻率和浸泡時間分別為15次/min和16 h，聚合反應(yīng)結(jié)束后得到PU/DA。

1.2.2PU/DA-LYS的制備

（1）分別配制質(zhì)量濃度為5、10 mg/mL的溶菌酶（以下簡稱Ng）溶液備用；

（2）取出PU/DA材料，用流動的去離子水對材料進(jìn)行沖洗，沖洗次數(shù)為3次。將洗凈的PU/DA材料分別浸入不同質(zhì)量濃度的溶酶菌溶液中，繼續(xù)置于翹板搖床中低速搖晃，搖晃頻率和時間分別為15次/min和18 h；

（3）反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水沖洗3次，然后置于YZG-600型真空干燥箱內(nèi)真空烘干，烘干溫度為37 ℃，根據(jù)溶酶菌質(zhì)量濃度分別編號為PU/DA-5%Ng和 PU/DA-10%Ng。

1.3性能測試

1.3.1吸水、保濕性能測試

將待測材料置于模擬傷口溶液中，使其進(jìn)行自然吸水至飽和。在吸水過程中，每隔一段時間取出材料進(jìn)行稱重，材料質(zhì)量不發(fā)生改變即可認(rèn)為材料已經(jīng)達(dá)到吸水飽和狀態(tài)。材料濕度表達(dá)式為[7] ：

材料濕度=（WX-W0）/WS×100％ （1）

式中：WS 、WX 、W0 為水飽和時、特定時間、材料原始質(zhì)量。

1.3.2親水性表征

通過S接觸角測量儀測定材料表面水接觸角，對材料的親水性能進(jìn)行表征。

1.3.3材料載藥量和藥物釋放量測試

載藥量和藥物釋放量表達(dá)式為[9]：

載藥量=（Wt-C1×V1）/Wm×100%? （2）

藥物釋放率=We/Wm×100%（3）

式中：Wt、Wm分別為溶解藥物、藥物載體總質(zhì)量；C1、V1分別為殘余藥物濃度和體積；We為溶菌酶的總釋放量。

1.4抗菌試驗(yàn)

1.4.1細(xì)菌培養(yǎng)

提前培養(yǎng)并將細(xì)菌溶液稀釋至OD600值約為0.07，然后在24孔板的孔洞中放入共計(jì)500 μL細(xì)菌懸浮液，然后將待測材料放入細(xì)菌懸浮液孔洞中浸泡，使得細(xì)菌懸濁液與待測材料充分接觸。在YCS-50AF型水浴恒溫振蕩器的作用下進(jìn)行振震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度、時間和轉(zhuǎn)速為37 ℃，1 d和50 r/min。利用酶標(biāo)儀測定 600 nm 處的溶液吸光度值[10-15]。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)

通過PBS緩沖液對細(xì)菌稀釋至105倍，然后在營養(yǎng)瓊脂板上均勻涂上25 μL稀釋后細(xì)菌溶液，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度和時間分別為37 ℃和18 h，通過菌落計(jì)數(shù)器對菌落數(shù)進(jìn)行評估。

2結(jié)果與討論

2.1PU材料特性

2.1.1保濕性試驗(yàn)結(jié)果

保濕性試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，PU材料具備一定的吸水性，在4 h內(nèi)即可的快速達(dá)到平衡保濕狀態(tài)。這是因?yàn)镻U的物理結(jié)構(gòu)為半透膜結(jié)構(gòu)，這種特殊結(jié)構(gòu)具備一定的平衡保濕性能，以該材料作為皮膚組織傷口處理材料的基底，能使傷口處理材料具備水分的吸收和蒸發(fā)的平衡能力。

2.1.2PU濕度優(yōu)化

通過對小鼠創(chuàng)面愈合情況進(jìn)行表征，驗(yàn)證PU材料濕度的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，不同濕度處理的小鼠創(chuàng)面，隨時間的變化均有不同程度的愈合。當(dāng)PU材料的初始濕度為25%時，對小鼠傷口的作用更優(yōu)，這說明此濕度為PU基底材料的較佳濕度，能有效促進(jìn)傷口愈合。在后續(xù)試驗(yàn)中，選擇PU濕度為25%。

2.2親水性測試

隨多巴胺和溶菌酶改性程度的增加，其親水性測試結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨多巴胺和溶菌酶改性程度的增加，材料的水接觸角下降的越明顯。其中 PU/DA-10%Ng的水接觸角最低，為45°，這說明經(jīng)過改性后，材料的親水性能明顯增加。

2.3載藥量和藥物釋放量

載藥量和藥物釋放量測試結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在1～10 d的試驗(yàn)過程中，溶菌酶持續(xù)釋放，這說明制備的PU/DA-LYS10材料具有持續(xù)藥物釋放的能力和一定的抗菌活力。同時，從溶菌酶藥物釋放規(guī)律可以發(fā)現(xiàn)，溶菌酶在第1 d時大量釋放，隨釋放時間的增加，單天釋放量逐漸降低。經(jīng)過計(jì)算后，溶菌酶前10 d的釋放率為42%，說明PU對藥物具有滯留和緩釋特性;這因?yàn)镻U物理結(jié)構(gòu)為3層不同尺寸的孔結(jié)構(gòu)，可根據(jù)孔大小對藥物的釋放進(jìn)行控制[13]。同時，這種特殊結(jié)構(gòu)對吸收和儲存滲出物有積極的作用。

2.4體外抗菌性能結(jié)果

體外抗菌性能測試結(jié)果如圖5所示;材料與細(xì)菌培養(yǎng)的定量分析結(jié)果如圖6所示。

由圖5可知，PU組和PU/DA組與細(xì)菌溶液一起孵育1 d后，吸光度值與對照組較為接近，這說明未負(fù)載溶酶菌的PU及其改性材料對細(xì)菌的生長幾乎沒有抑制作用。而PU/DA-Ng材料與細(xì)菌溶液共同孵育1 d后，吸光度值明顯下降，且隨PU/DA-Ng中溶酶菌負(fù)載量的增加，下降程度越大。這說明負(fù)載了溶酶菌的PU材料廣譜抗菌活性良好，且抗菌活性受溶酶菌質(zhì)量濃度的影響，溶酶菌質(zhì)量濃度越高，抗菌活性越好。但有文獻(xiàn)表明，溶酶菌濃度過高， 可能造成一些細(xì)胞毒性，對傷口的愈合反而會產(chǎn)生不利影響[14-15]。因此，溶酶菌適宜質(zhì)量濃度為10 mg/mL 。

由圖6可知，菌落定量分析結(jié)果與吸光度值結(jié)果基本一致，與PU/DA-Ng一起培養(yǎng)的細(xì)菌菌落數(shù)最低。這也說明PU/DA-Ng材料具備良好的抑菌性。對比圖6（a）、（b）可知，PU/DA-Ng材料對金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯優(yōu)于大腸桿菌，這說明PU/DA-Ng材料對革蘭染色陽性細(xì)菌的抑制效果更好。

2.5創(chuàng)面護(hù)理后的抗菌性評價

為進(jìn)一步表征材料的抗菌效果，經(jīng)護(hù)理后取3 d和7 d傷口的分泌物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，對照組檢測到有細(xì)菌量，但空白組細(xì)菌量為0，這說明成功建立細(xì)菌感染模型，且試驗(yàn)過程中保持良好的無菌原則。PU/DA-10%Ng材料與無菌空白對照組的細(xì)菌數(shù)量無顯著差別，這說明該材料具備良好的抗菌性能，且不與活體自身免疫發(fā)生沖突，這與體外抗菌試驗(yàn)的結(jié)果一致。

3結(jié)語

（1）PU材料具有很好的平衡保濕性能，可作為抗菌材料的基底材料使用，當(dāng)PU濕度為25%時，對傷口的促愈合性能較佳；

（2）隨PU表面堆積的溶酶菌粒子的增加，復(fù)合材料的親水性能隨之增加，PU/DA-10%Ng的水接觸角為45°；

（3）溶菌酶藥物釋放為第1 d大量釋放，然后單天釋放量逐漸降低。經(jīng)過計(jì)算后，溶菌酶前10 d的總釋放率為42%，對藥物具備滯留和緩釋特性；

（4）PU/DA-Ng材料具備良好的抗菌活性，能有效抑制細(xì)菌的生長；

（5）創(chuàng)面抗菌效果結(jié)果表明，制備的PU/DA-Ng材料表現(xiàn)出良好的抗菌性能。

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