張慶昕，張玉霞，2，陳衛(wèi)東，劉庭玉，王顯國(guó)，王東儒

(1 內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028041；2 內(nèi)蒙古自治區(qū)飼用作物工程中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100193；4 呼和浩特市農(nóng)牧技術(shù)推廣中心 種業(yè)發(fā)展科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是豆科(Leguminosae)苜蓿屬多年生草本植物[1]，因其生產(chǎn)性能高、適口性好，且兼具高蛋白、低纖維的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)，在全球廣泛種植[2]。紫花苜?？购暂^強(qiáng)，在中原一帶、甘肅地區(qū)甚至有積雪覆蓋的黑龍江地區(qū)均可安全穩(wěn)定越冬，但在內(nèi)蒙古科爾沁沙地，因冬季少雪，冬春土壤溫濕度變化劇烈，因此紫花苜蓿面臨著嚴(yán)重的低溫冷凍和倒春寒問題[3-5]，凍害是限制內(nèi)蒙古科爾沁沙地苜蓿持續(xù)穩(wěn)定生產(chǎn)的關(guān)鍵問題。安全越冬是我國(guó)北方干旱地區(qū)實(shí)現(xiàn)苜蓿穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的基礎(chǔ)[6]，秋季末次刈割時(shí)間是決定苜蓿安全越冬的關(guān)鍵栽培技術(shù)之一[7]。王偉東等[8]研究表明，2年生紫花苜蓿在8月23日進(jìn)行末次刈割處理，其越冬率最高，最有利于越冬。武瑞鑫等[9]研究表明，北京平原區(qū)紫花苜蓿秋季末次刈割的最佳時(shí)期大致為10月29日-11月5日。Bertrand等[10]研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿越冬前根內(nèi)可溶性糖含量積累與苜蓿安全越冬和春季返青有著密切聯(lián)系。張玉霞等[11]和朱愛民等[12]研究表明，淀粉與可溶性糖在根頸中的互相轉(zhuǎn)化對(duì)紫花苜蓿越冬和翌年春季返青具有重要作用，且不同苜蓿品種表現(xiàn)不同。陳衛(wèi)東等[13]研究表明，蔗糖、果糖等可溶性糖可以提高苜蓿的抗寒性。然而，有關(guān)秋季末次刈割時(shí)間對(duì)苜蓿越冬抗寒影響的研究尚少[14-15]。目前關(guān)于科爾沁沙地生境下不同末次刈割時(shí)間處理苜蓿的抗寒性是否存在差異，以及刈割時(shí)間對(duì)低溫脅迫下苜蓿糖類物質(zhì)含量的影響尚不清楚。因此，本研究通過大田試驗(yàn)，于秋末對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行不同刈割時(shí)間處理，越冬前期挖取不同刈割時(shí)間處理紫花苜蓿的根頸，進(jìn)行低溫冷藏(4 ℃)和低溫冷凍(-10，-15，-20，-25，-30 ℃)處理，研究紫花苜蓿根頸糖類物質(zhì)含量的變化，分析紫花苜蓿在不同刈割時(shí)間處理下適應(yīng)低溫冷凍的抗寒保護(hù)機(jī)制，確定科爾沁沙地紫花苜蓿秋季是否刈割或刈割最佳時(shí)間，以期為提高科爾沁沙地紫花苜蓿安全越冬提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古通遼市開魯縣東風(fēng)鎮(zhèn)林輝草業(yè)公司(43°37′ N， 121°34′ E)，年平均氣溫6.2 ℃，≥10 ℃年活動(dòng)積溫3 137 ℃，年平均日照時(shí)數(shù)3 000 h，無霜期135～145 d，年平均降水量376.1 mm，蒸發(fā)量是降水量的4.8倍，年平均風(fēng)速3.1～4.3 m/s，為典型的溫帶大陸性季風(fēng)氣候。試驗(yàn)田為新開墾沙化草地，土壤為沙土，0～20 cm土層土壤理化性質(zhì)為：pH 8.2，有機(jī)質(zhì)6.3 g/kg，全氮0.37 g/kg，堿解氮36.17 mg/kg，速效鉀76.78 mg/kg，速效磷3.68 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)材料

供試公農(nóng)1號(hào)紫花苜蓿種子，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原所提供。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

公農(nóng)1號(hào)紫花苜蓿種子于2019年7月30日播種，播種方式為條播，播種量為22.5 kg/hm2，行距15 cm，小區(qū)試驗(yàn)面積16 m2(4 m×4 m)，3次重復(fù)，共設(shè)27個(gè)小區(qū)，小區(qū)之間設(shè)0.5 m過道。施肥量為75 kg/hm2K2O，100 kg/hm2P2O5;翌年再次施入150 kg/hm2K2O、200 kg/hm2P2O5，K2O均分為2次施入，分別為4月3日和6月3日，P2O5于4月3日一次性施入。分別于2020年5月1日和7月3日對(duì)所有小區(qū)進(jìn)行第一茬與第二茬刈割。紫花苜蓿生長(zhǎng)過程中進(jìn)行適時(shí)噴灌、除草、防治病蟲害等田間管理。

采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，于2020年8月25日-11月5日，每處理間隔10 d，分別為8月25日、9月5日、9月15日、9月25日、10月5日、10月15日、10月25日和11月5日，共設(shè)置8個(gè)刈割時(shí)間處理，以未刈割為對(duì)照。于封凍前期(11月15日)挖取紫花苜蓿越冬材料(苜蓿根系)，每個(gè)小區(qū)挖取90株粗細(xì)均勻一致的根系，平均分成6份。將其中1份放在4 ℃冰箱進(jìn)行低溫冷藏處理，剩余5份于可程式恒溫恒濕試驗(yàn)箱模擬低溫冷凍處理，處理時(shí)先將根系用脫脂棉包裹，加水適量，再用錫紙包裹，注明編號(hào)，處理溫度分別為 -10，-15，-20，-25，-30 ℃，以0 ℃為起點(diǎn)，4 ℃/h的速率降溫，到達(dá)預(yù)設(shè)溫度后保持6 h；再以4 ℃/h的速率升溫至0 ℃，取出置于4 ℃下保持12 h。分別切取根頸及根頸下主根1 cm，測(cè)定其相對(duì)電導(dǎo)率及糖類物質(zhì)含量。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

參考鄒琦[16]的方法測(cè)定生理指標(biāo)，其中相對(duì)電導(dǎo)率采用DDS-302電導(dǎo)率儀測(cè)定，可溶性糖和淀粉含量采用蒽酮比色法測(cè)定，蔗糖和果糖含量采用間苯二酚法測(cè)定，相關(guān)性分析數(shù)據(jù)選擇半致死溫度與不同溫度處理下所有刈割處理的均值進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行處理、繪圖和制作表格，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，各低溫處理下的相對(duì)電導(dǎo)率數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件擬合logistic回歸方程[17-18]y=k/(1+ae-bx)，其中y為相對(duì)電導(dǎo)率，x為處理溫度，k為x趨于無窮大時(shí)的值，a、b為方程參數(shù)。相對(duì)電導(dǎo)率極大值與極小值的中位數(shù)對(duì)應(yīng)的溫度為低溫半致死溫度(LT50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同末次刈割時(shí)間對(duì)苜蓿根頸半致死溫度(LT50)的影響

由表1可知，不同末次刈割時(shí)間苜蓿受不同低溫脅迫后，用其根頸相對(duì)電導(dǎo)率擬合的logistic回歸方程不同，差異顯著水平均小于0.05。

表1 不同末次刈割時(shí)間處理苜蓿根頸相對(duì)電導(dǎo)率擬合的logistic回歸方程及LT50

由表1還可知，在未刈割和8月25日、9月5日、9月15日、9月25日、10月5日、10月15日、10月25日、11月5日進(jìn)行末次刈割時(shí)，苜蓿根頸的半致死溫度分別為-18.03，-17.61，-17.03，-16.59，-15.80，-15.82，-16.83，-16.34，-17.12 ℃。表明苜蓿在不同末次刈割時(shí)間的抗寒能力強(qiáng)弱依次為：未刈割>8月25日末次刈割>11月5日末次刈割>9月5日末次刈割>10月15日末次刈割>9月15日末次刈割>10月25日末次刈割>10月5日末次刈割>9月25日末次刈割。

2.2 不同末次刈割時(shí)間苜蓿根頸在低溫處理下的可溶性糖含量

由表2可知，在同一末次刈割時(shí)間下，隨著處理溫度的降低，苜蓿根頸可溶性糖含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在-20 ℃下苜蓿根頸的可溶性糖含量最高，且均與其他溫度處理差異顯著(P<0.05)，說明在低溫脅迫下，苜蓿根頸受到傷害，通過提高可溶性糖的含量來保護(hù)細(xì)胞的穩(wěn)定性。

由表2還可知，在-10，-20和-30 ℃下，9月25日末次刈割時(shí)間處理苜蓿根頸的可溶性糖含量最低，其中在-10 ℃下苜蓿根頸可溶性糖含量顯著低于未刈割、8月25日刈割和11月5日刈割處理(P<0.05)，-20 ℃處理顯著低于除10月5日刈割處理外的其他刈割處理(P<0.05)，-30 ℃處理則顯著低于8月25日刈割處理(P<0.05)。說明不同刈割時(shí)間處理苜蓿根頸的可溶性糖含量在低溫冷凍脅迫下存在明顯差異，9月25日和10月5日末次刈割處理苜蓿根頸的可溶性糖含量相對(duì)較低；未刈割及8月25日、9月5日、10月15日、11月5日末次刈割處理則相對(duì)較高。進(jìn)一步說明，9月25日和10月5日刈割苜蓿的抗寒性較弱，與其在低溫冷凍脅迫下的可溶性糖含量較低有關(guān)，反之抗寒性較強(qiáng)的未刈割處理、8月25日和11月5日末次刈割處理也與其在低溫冷凍脅迫下可溶性糖含量較高密切相關(guān)。

2.3 不同末次刈割時(shí)間苜蓿根頸在低溫處理下的蔗糖含量

由表3可知，隨著處理溫度的降低，在8月25日、9月5日、10月5日、10月15日以及10月25日末次刈割時(shí)間處理下，苜蓿根頸的蔗糖含量呈增加-降低-增加-降低的雙峰型變化趨勢(shì)，其中在-25 ℃下蔗糖含量達(dá)到最高，且與對(duì)照(4 ℃)、-15及-30 ℃處理差異顯著(P<0.05)，說明苜蓿根頸在低溫脅迫下，通過增加蔗糖含量來保護(hù)細(xì)胞的穩(wěn)定性，且在-25 ℃下，蔗糖在細(xì)胞中的調(diào)節(jié)能力最強(qiáng)，表明蔗糖亦是苜蓿抵御低溫冷凍脅迫的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一。

由表3還可知，在-15和-20 ℃下，未刈割處理苜蓿根頸的蔗糖含量最高，其中在-15 ℃下，未刈割處理苜蓿根頸的蔗糖含量顯著高于9月5日、9月25日、10月5日、10月15日末次刈割處理(P<0.05)；-20 ℃下未刈割處理苜蓿根頸的蔗糖含量均顯著高于其他刈割處理(8月25日末次刈割處理除外)(P<0.05)。說明不同末次刈割時(shí)間處理下苜蓿根頸的蔗糖含量在低溫冷凍脅迫下存在明顯差異，9月25日和10月5日末次刈割處理苜蓿根頸的蔗糖含量相對(duì)較低，未刈割、8月25日、9月5日、10月15日、11月5日末次刈割處理則相對(duì)較高。進(jìn)一步說明9月25日和10月5日末次刈割處理的苜?？购暂^弱，這與其在低溫冷凍脅迫下蔗糖含量較低有關(guān)，反之抗寒性較強(qiáng)的未刈割處理和8月25日、11月5日末次刈割處理與其在低溫冷凍脅迫下蔗糖含量較高密切相關(guān)。

表3 不同末次刈割時(shí)間苜蓿根頸在低溫處理下的蔗糖含量

2.4 不同末次刈割時(shí)間苜蓿根頸在低溫處理下的果糖含量

由表4可知，隨著處理溫度的降低，苜蓿根頸的果糖含量呈增加-降低-增加的雙峰型趨勢(shì)，其中在-15 ℃下果糖含量達(dá)到最高，且與其他溫度處理差異較大，說明在低溫脅迫下，苜蓿通過增加根頸果糖含量來保護(hù)細(xì)胞的穩(wěn)定性，且以-15 ℃下果糖在細(xì)胞中的調(diào)節(jié)能力最強(qiáng)，表明果糖亦是苜蓿抵御低溫冷凍脅迫的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一。

表4 不同末次刈割時(shí)間苜蓿根頸在低溫處理下的果糖含量

由表4還可知，在-15和-20 ℃下，9月25日末次刈割處理苜蓿根頸的果糖含量最低，其中在-15 ℃下，9月25日末次刈割處理苜蓿根頸的果糖含量顯著低于未刈割和8月25日、9月5日、10月25日、11月5日末次刈割處理(P<0.05)；在-20 ℃下，9月25日末次刈割處理苜蓿根頸的果糖含量均顯著低于除9月5日和10月25日刈割處理外的其他處理(P<0.05)。說明不同末次刈割時(shí)間處理苜蓿根頸的果糖含量在低溫冷凍脅迫下存在明顯差異，9月25日末次刈割處理苜蓿根頸的果糖含量相對(duì)較低，未刈割和8月25日、11月5日末次刈割苜蓿根頸的果糖含量則相對(duì)較高。由此進(jìn)一步說明，9月25日刈割苜蓿的抗寒性較弱，與其在低溫冷凍脅迫下果糖含量較低有關(guān)；反之抗寒性較強(qiáng)的未刈割處理和8月25日、11月5日末次刈割處理與其在低溫冷凍脅迫下果糖含量較高密切相關(guān)。

2.5 不同末次刈割時(shí)間苜蓿根頸在低溫處理下的淀粉含量

由表5可知，隨著處理溫度的降低，苜蓿根頸的淀粉含量呈逐漸降低趨勢(shì)，其中在-30 ℃下淀粉含量達(dá)到最低，且與其他溫度處理差異較大，說明在低溫脅迫下，苜蓿根頸通過促進(jìn)淀粉向糖的轉(zhuǎn)化，從而保護(hù)細(xì)胞的穩(wěn)定性。

由表5還可知，在-15和-20 ℃下，未刈割處理苜蓿根頸的淀粉含量最低，其中在-15 ℃下，未刈割處理苜蓿根頸的淀粉含量顯著低于其他處理(除8月25日刈割處理外)(P<0.05)，-20 ℃下，未刈割處理苜蓿根頸的淀粉含量顯著低于9月25日刈割處理(P<0.05)。表明不同末次刈割時(shí)間處理下苜蓿根頸的淀粉含量在低溫冷凍脅迫下存在明顯差異，9月25日刈割處理苜蓿根頸的淀粉轉(zhuǎn)化相對(duì)較弱，未刈割、8月25日刈割處理苜蓿根頸的淀粉轉(zhuǎn)化則相對(duì)較強(qiáng)。進(jìn)一步說明，9月25日末次刈割苜蓿的抗寒性較弱，與其在低溫冷凍脅迫下淀粉轉(zhuǎn)化成可溶性糖的能力較弱有關(guān)，反之抗寒性較強(qiáng)的未刈割處理、8月25日刈割處理，與其低溫冷凍脅迫下淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖的能力較強(qiáng)密切相關(guān)。

表5 不同末次刈割時(shí)間苜蓿根頸在低溫處理下的淀粉含量

2.6 苜蓿根頸的半致死溫度與其糖類物質(zhì)含量的相關(guān)性

由表6可知，在不同低溫冷凍脅迫下，紫花苜蓿根頸的半致死溫度均與淀粉含量呈正相關(guān)，且在-15，-20 ℃下呈極顯著正相關(guān)；與可溶性糖、蔗糖和果糖含量呈負(fù)相關(guān)(除4 ℃的蔗糖含量外)；紫花苜蓿根頸的LT50與-10，-20，-30 ℃下的可溶性糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；與-15，-20 ℃下的蔗糖含量呈顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)，與-15 ℃下的果糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

表6 苜蓿根頸的半致死溫度與其糖類物質(zhì)含量的相關(guān)性

3 討論與結(jié)論

3.1 末次刈割時(shí)間對(duì)苜蓿抗寒性的影響

在冬季寒冷的北方地區(qū)，末次刈割時(shí)間的選擇對(duì)于苜蓿的抗寒性至關(guān)重要[19]，LT50為苜?？购缘脑u(píng)價(jià)指標(biāo)[20]。本研究通過對(duì)不同末次刈割時(shí)間處理苜蓿根頸在不同低溫脅迫下的相對(duì)電導(dǎo)率進(jìn)行測(cè)定，協(xié)同logistic方程計(jì)算苜蓿LT50，發(fā)現(xiàn)未刈割至9月25日刈割處理，苜蓿的抗寒性逐漸降低；9月25日末次刈割處理后苜?？购杂兴鰪?qiáng)，說明在初霜期(9月25日左右)來臨之前對(duì)苜蓿進(jìn)行末次刈割，苜蓿抗寒性較低，而在初霜期之后進(jìn)行末次刈割，則對(duì)苜蓿越冬無顯著影響。這可能是因?yàn)檐俎Ｘ赘詈?，即開始利用根系根頸中貯藏的物質(zhì)進(jìn)行再生，此時(shí)根系營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為新生莖葉提供了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致根系營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少；而早期(9月5日前)刈割后，苜蓿仍有很長(zhǎng)的生長(zhǎng)時(shí)間，新生的莖葉到了一定階段就開始進(jìn)行光合積累，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)又開始返還地下，所以早期刈割的苜蓿根系營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更豐富，有助于越冬；隨著刈割時(shí)間的推遲，苜蓿地上部分生長(zhǎng)時(shí)間越來越短，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)返還較少甚至還未來得及返還就已經(jīng)進(jìn)入休眠狀態(tài)；因此10月25日末次刈割處理苜蓿的抗寒性有所下降。但11月5日刈割苜蓿的抗寒性反而增強(qiáng)，主要是由苜蓿的生理特性決定的，因?yàn)檐俎５搅撕鋾r(shí)期，就會(huì)停止地上部分的生長(zhǎng)而將養(yǎng)分轉(zhuǎn)移至地下根系，用作越冬儲(chǔ)備。

3.2 末次刈割時(shí)間對(duì)苜蓿糖類物質(zhì)含量的影響

Haagenson等[21]研究表明，秋末刈割冬季苜蓿根頸的淀粉含量明顯減少，但可溶性糖含量提高，同時(shí)抗寒性減弱。在逆境脅迫下，植物體內(nèi)可溶性糖大量積累，一方面作為能量?jī)?chǔ)存，另一方面作為植物體內(nèi)的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，用于緩解逆境對(duì)植物造成的傷害[8，22-23]。果糖、蔗糖和葡萄糖總稱為可溶性糖，郝培彤等[24]和孫明雪等[25]的研究結(jié)果表明，可溶性糖中的蔗糖和果糖含量與苜?？购杂嘘P(guān)。本研究結(jié)果表明，末次刈割時(shí)間處理苜蓿的半致死溫度與其蔗糖、果糖等可溶性糖含量呈負(fù)相關(guān)，且在一定低溫冷凍脅迫處理下達(dá)到極顯著水平，進(jìn)一步說明苜蓿根頸的蔗糖、果糖等可溶性糖含量是苜蓿安全越冬的關(guān)鍵所在。王偉東等[8]研究了末次刈割時(shí)間對(duì)苜?？购缘挠绊懀l(fā)現(xiàn)隨著末次刈割時(shí)間的推遲，苜蓿根頸中淀粉含量呈下降趨勢(shì)，苜蓿的越冬存活率也隨之下降，因此，越冬前苜蓿根頸積累的淀粉越多，其越冬存活率越高。表明淀粉雖然未直接發(fā)揮越冬期苜蓿的抗寒保護(hù)作用，但淀粉是植物體內(nèi)果糖和蔗糖等可溶性糖的來源。本研究中，不同末次刈割時(shí)間處理抗寒性強(qiáng)的苜蓿淀粉含量明顯低于抗寒性弱的處理，表明在低溫處理下淀粉轉(zhuǎn)化為蔗糖、果糖等可溶性糖，從而提高了苜蓿根頸對(duì)低溫冷凍傷害的抵御能力。

4 結(jié) 論

在不同低溫冷凍脅迫處理下，不同末次刈割時(shí)間的苜?？购芰?qiáng)弱依次為：未刈割>8月25日末次刈割>11月5日末次刈割>9月5日末次刈割>10月15日末次刈割>9月15日末次刈割>10月25日末次刈割>10月5日末次刈割>9月25日末次刈割。低溫冷凍脅迫下，不同末次刈割時(shí)間對(duì)苜蓿根頸的可溶性糖、蔗糖、果糖、淀粉含量均有明顯影響，在相同低溫脅迫處理下，抗寒性強(qiáng)的末次刈割處理苜蓿根頸的蔗糖、果糖等可溶性糖含量明顯提高，淀粉含量降低，因此，建議在科爾沁沙地應(yīng)于9月5日之前或11月5日之后進(jìn)行苜蓿末次刈割，以提高苜蓿的安全越冬率。