周先貴 蔣艷 韓梅 鄭杰 覃松

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1急診科，2心外科，4重癥醫(yī)學(xué)科（貴州遵義 563000）；3遵義醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（貴州遵義 563006）

長(zhǎng)時(shí)間吸入> 60%濃度的氧氣或氧分壓>450 mmHg 會(huì)導(dǎo)致高氧性急性肺損傷（hyperoxia-induced acute lung injury，HALI），可增加危重患者死亡率，與不良預(yù)后密切相關(guān)［1］。有研究［2］表明，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）促進(jìn)了HALI的發(fā)生發(fā)展。ROS 蓄積可破壞氧化還原平衡損傷肺組織細(xì)胞，并促進(jìn)炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）等在肺組織中大量募集，造成肺組織細(xì)胞凋亡壞死，最終導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）的發(fā)生［3］。轉(zhuǎn)錄激活蛋白STAT3在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的作用不可或缺［4］。部分研究證實(shí)，ROS 與STAT3 磷酸化的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定極其重要［5］。此外，STAT3 的過(guò)度活化可能造成組織細(xì)胞損傷，抑制STAT3 的過(guò)度活化可改善血管內(nèi)皮通透性減輕脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷［6-7］。微小RNA21-5p（miR21-5p）參與多種肺部疾病的產(chǎn)生和發(fā)展，并被確定為生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)［8］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，抑制STAT3 過(guò)度活化可減輕HALI，同時(shí)miR21-5p 與STAT3 呈負(fù)相關(guān)［9］。通過(guò)檢索miRbase 數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，miR21-5p 可與STAT3 的三處結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。目前研究表明，STAT3 可促進(jìn)miR21-5p表達(dá)，同時(shí)miR21-5p可負(fù)反饋調(diào)節(jié)STAT3表達(dá)水平［10-11］。但是關(guān)于miR21-5p 與STAT3 在HALI 中的調(diào)控作用尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)構(gòu)建HALI 動(dòng)物模型驗(yàn)證miR21-5p 是否負(fù)向調(diào)控STAT3 活化抑制凋亡以減輕HALI，以期闡明miR21-5p 與STAT3 在HALI 中的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選用8 周齡C57BL/6J 小鼠40 只，雌雄各半，體質(zhì)量（21～25）g，采購(gòu)于遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：（SYXK（黔）2021-0004）。各組小鼠分籠飼養(yǎng)于環(huán)境溫度（20 ± 2）℃、相對(duì)濕度（55 ± 5）%的環(huán)境中，通風(fēng)換氣12 ～ 18 次/h，晝夜循環(huán)照明，給予標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料并自由飲用酸化水（pH：2.5～3.0）適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)遵義醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：ZMU21-2202-098），相關(guān)操作符合美國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和試用手冊(cè)》第八版要求。

1.2 主要藥物、試劑及儀器 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、RIPA 裂解液及BCA 蛋白濃度定量試劑盒，DCFH-DA 活性氧ROS 熒光探針和蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；TNF-α、IL-1β 及IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assays，ELISA）檢測(cè)試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；STAT3、p-STAT3、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）和GAPDH 一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；Trizol 試劑、miRNA 第一鏈cDNA合成試劑盒、miRNA 熒光定量PCR 試劑盒及miR21-5p 和U6 PCR 引物設(shè)計(jì)合成（上海生工生物工程股份有限公司）；miR21-5p 腺相關(guān)病毒-6（AAV-6）過(guò)表達(dá)載體及空載體（漢恒生物科技有限公司）。

1.3 動(dòng)物分組、給藥及HALI 模型的建立 40 只C57BL/6J 隨機(jī)分為常氧組、高氧組、高氧+miR21-5p 組及高氧+空載體組。常氧組飼養(yǎng)于正?？諝庵校哐?miR21-5p組和高氧+空載體組分別經(jīng)氣管導(dǎo)管滴入50 μL滴度為（1×1012TU/mL）的miR21-5p-AAV6 或空載體，每組分籠飼養(yǎng)3 周后，參照劉國(guó)躍［12］的方法建立HALI 模型：將實(shí)驗(yàn)用C57BL/6J小鼠飼養(yǎng)于55 cm×40 cm×35 cm 的密閉有機(jī)玻璃容器自制高氧箱中，右側(cè)開(kāi)孔接單向閥控制的氧氣接頭；左側(cè)開(kāi)孔接氧濃度和二氧化碳濃度檢測(cè)儀。箱底放置鈉石灰吸收CO2，維持其CO2濃度< 0.5%；每天持續(xù)給氧23.5 h，維持氧濃度90%以上。定時(shí)開(kāi)艙0.5 h 以添加食物、水并更換小鼠墊料。建模48 h，2%戊巴比妥納以45 mg/kg 腹腔注射麻醉小鼠后處死小鼠取肺組織行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，取肺組織行RT-PCR 檢測(cè)miR21-5p 表達(dá)水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將含有miR21-5p 結(jié)合位點(diǎn)的野生型（WT）或含有miR1-5p 結(jié)合位點(diǎn)突變序列的突變型（MUT）的3'UTR-STAT3 分別插入psiCHECK2 載體。利用Lipofectamine 2000 試劑將WT/MUT-STAT3 分別與miR21-5p mimics 或miRNC 轉(zhuǎn)染到HEK293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h 使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)HEK293T 細(xì)胞熒光素酶活性（以海腎熒光素酶活性與螢光蟲(chóng)熒光素酶活性的比值表示）。

1.5 炎癥因子及氧化還原標(biāo)記物檢測(cè) 取小鼠肺組織稱(chēng)重50 mg，剪碎后研磨成勻漿，4 ℃4 000 r/min離心10 min，吸取上清液，按照各試劑盒試劑盒說(shuō)明書(shū)操作手冊(cè)檢測(cè)肺組織炎癥因子和氧化還原標(biāo)志物。采用雙抗夾心法檢測(cè)炎癥因子：TNF-α、IL-1β 及IL-6。氧化還原標(biāo)志物包括MDA、SOD 和ROS。使用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD 含量，硫代巴比妥酸反應(yīng)法測(cè)定MDA 含量，熒光探針DCFH-DA法檢測(cè)ROS 水平。

1.6 肺水含量測(cè)定 取小鼠肺組織用濾紙吸干水分后稱(chēng)重，記為肺組織濕質(zhì)量（W 濕），經(jīng)過(guò)60 ℃烤箱烘烤60 h 后稱(chēng)重，記為肺組織干質(zhì)量（D 干），肺組織含水量=（W濕-D干）/W 濕×100%。

1.7 肺組織病理學(xué)觀察及肺損傷病理評(píng)分 取小鼠肺組織使用10%福爾馬林溶液固定24 h，按照HE 染色試劑盒操作水明書(shū)進(jìn)行HE 染色后，在倒置顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變并拍照，并在400倍視野下隨機(jī)選取至少20個(gè)視野，采用Matute-Bello［13］的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化肺損傷病理評(píng)分。

1.8 Tunel 法檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡 取小鼠肺組織10%福爾馬林溶液固定24 h 制作石蠟切片，60 ℃烘箱烘烤15 min 脫蠟；二甲苯脫蠟2×5 min，乙醇（依次100% 2 × 2 min、95% 2 × 1 min、85%1 ×1 min、75% 1 × 1 min）、蒸餾水2 min 水化；加入蛋白酶K 溶液100 μL，37 ℃通透30 min；PBS 洗3 ×5 min；滴加配置好的Tunel 染液100 μL，含DAPI抗熒光淬滅劑封片，拍照。

1.9 小鼠肺組織miR21-5p表達(dá)檢測(cè) 取小鼠肺組織，加入Trizol 裂解液，使用組織細(xì)胞破碎儀裂解組織，提取RNA，酶標(biāo)儀測(cè)定總RNA 濃度及純度。使用miRNA 第一鏈cDNA 合成試劑盒（加尾法）將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行定量PCR 擴(kuò)增。采用SYBR GreenI 染料法對(duì)microRNA 進(jìn)行熒光定量檢測(cè)：反應(yīng)體系為20 μL：2×miRNA qPCR master mix 10 μL；前后引物各1 μL；Template DNA（miR21-5p）2 μL；ROX Referense Dye（L）/（H），1 μL；加入RNase-free water 至20 μL。PCR 反應(yīng)條件為：預(yù)變性：95 ℃30 s；變性：95 ℃5 s；退火/延伸：60 ℃30 s；共40 個(gè)循環(huán)。引物序列為：miR21-5p，正向5'-CCGGCTAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3'和反向5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6，正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'和反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；采用相對(duì)定量法檢測(cè)RNA擴(kuò)增，以U6 作內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR21-5p 表達(dá)量。

1.10 Western blot 肺組織STAT3、p-STAT3、Bax及Bcl-2 蛋白表達(dá)取小鼠肺組織稱(chēng)重，加入RIPA裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制劑，使用組織細(xì)胞破碎儀裂解組織，4 ℃12 000 r/min 離心15 min，取上清液使用BCA 法進(jìn)行蛋白定量后分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｓ?0%或12%SDS-PAGE 凝膠分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入STAT3、p-STAT3、Bax、Bcl-2及GAPDH 一抗，4 ℃孵育16 h；PBST 溶液洗膜3 次（5 min/次），加入IgG-HRP 后室溫避光孵育1 h，PBST 洗膜溶液3 次（5 min/次），加入ECL 發(fā)光液后使用Gel DocTMEZ 全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)曝光、拍照。使用Image J 軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。以GAPDH 為內(nèi)參照，計(jì)算目標(biāo)蛋白STAT3、p-STAT3、Bax 及Bcl-2 的相對(duì)表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR21-5p 靶向STAT3 通過(guò)在線(xiàn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站Starbase（http：//starbase.sysu.edu.cn）預(yù)測(cè)到miR21-5p 與STAT3 之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)（圖1）。與miR-NC 組相比，miR21-5p 組WT-STAT3 的293T 細(xì)胞熒光活性顯著降低，與anti-miR-NC 組相比，antimiR21-5p 組DEFA3 WT 的293T 細(xì)胞熒光活性顯著升高，見(jiàn)表1。

圖1 miR21-5p 直接調(diào)控STAT3 表達(dá)Fig.1 miR21-5p directly regulates expression of STAT3

表1 miR21-5p 結(jié)合STAT3Tab.1 miR21-5p binding to STAT3±s

表1 miR21-5p 結(jié)合STAT3Tab.1 miR21-5p binding to STAT3±s

組別miR-NC miR21-5p anti-miR-NC anti-miR21-5p F 值P 值熒光活性STAT3 WT 1.06±0.07 0.42±0.06①0.98±0.07 1.87±0.04②615.1<0.001 STAT3 MUT 1.04±0.06 1.00±0.06 0.97±0.07 0.98±0.08 1.179 0.342 8

2.2 miR21-5p對(duì)HALI小鼠肺組織形態(tài)學(xué)、肺組織W濕/D干重比值及肺損傷病理評(píng)分的影響 如圖2 和表2 所示：常氧組HE 染色見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁光滑，偶有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；高氧暴露48 h可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、間隔增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，透明膜形成及肺泡萎陷，與常氧組比較，高氧組肺損傷病理評(píng)分及肺組織W濕/D干重比值升高（P<0.05）；miR21-5p 過(guò)表達(dá)預(yù)處理后，HE 染色可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂不明顯，肺間質(zhì)增厚及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度較高氧組明顯減輕，與高氧組比較，高氧+miR21-5p組肺損傷病理評(píng)分及肺組織W濕/D干重比值下降（P<0.05）。

圖2 各組小鼠肺組織HE 染色情況（×400）Fig.2 HE staining of lung tissue of mice in each group（×400）

表2 各組小鼠肺組織W 濕/D 干重比值、肺損傷病理評(píng)分和miR21-5p 表達(dá)的比較Tab.2 Comparison of Wwet/Ddry weight ratio，lung injury pathological score and miR21-5p expression in lung tissue of mice in each group ±s

表2 各組小鼠肺組織W 濕/D 干重比值、肺損傷病理評(píng)分和miR21-5p 表達(dá)的比較Tab.2 Comparison of Wwet/Ddry weight ratio，lung injury pathological score and miR21-5p expression in lung tissue of mice in each group ±s

注：①與常氧組比較，P<0.05；②與高氧組比較，P<0.05；③與高氧+miR21-5p 組比較，P<0.05

組別常氧組高氧組高氧+miR21-5p 組高氧+空載體組F 值P 值肺W 濕/D 干重比值3.57±0.60 5.65±0.35①4.56±0.33①②5.66±0.33①③34.67<0.001肺損傷病理評(píng)分（分）0.10±0.03 0.84±0.04①0.44±0.04①②0.84±0.03①③654.8<0.001 miR21-5p（2-△△Ct）1.00±0.09 0.35±0.04①3.13±0.26①②0.34±0.04①③548.5<0.001

2.3 miR21-5p 對(duì)HALI 小鼠肺組織SOD、MDA 及ROS 的影響 如表3 所示，高氧暴露48 h 后各組小鼠肺組織SOD、MDA 及ROS 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與常氧組比較，高氧組、高氧+miR21-5p 組及高氧+空載體組MDA 及ROS水平升高（P< 0.05），SOD 水平降低（P< 0.05）；與高氧組比較，高氧+miR21-5p 組ROS 及MDA 水平降低（P<0.05），SOD 水平升高（P<0.05）；與高氧+miR21-5p 組比較，高氧+空載體組ROS 及MDA 水平較高氧+miR21-5p 組升高（P< 0.05），SOD 水平降低（P<0.05）。

表3 各組小鼠肺組織SOD、MDA 和ROS 表達(dá)的比較Tab.3 Comparison of SOD，MDA and ROS expression in lung tissue of mice in each group ±s

表3 各組小鼠肺組織SOD、MDA 和ROS 表達(dá)的比較Tab.3 Comparison of SOD，MDA and ROS expression in lung tissue of mice in each group ±s

注：①與常氧組比較，P < 0.05；②與高氧組比較，P < 0.05；③與高氧+miR21-5p 組比較，P<0.05

組別常氧組高氧組高氧+miR21-5p組高氧+空載體組F值P值SOD（U/mg）61.51±4.71 17.69±3.66①42.74±3.97①②18.28±6.00①③183.4<0.001 MDA（nmol/mg）8.34±0.66 49.62±3.55①27.59±4.86①②51.52±3.85①③194.7<0.001 ROS（U/mg）49.48±4.68 205.56±6.99①124.12±5.12①②207.50±6.66①③966.5<0.001

2.4 miR21-5p 對(duì)HALI 小鼠肺組織TNF-α、IL-6及IL-1β 的影響 如表4 所示，高氧暴露48 h 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與常氧組比較，高氧組、高氧+miR21-5p 組和高氧+空載體組TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高（P<0.05）；與高氧組比較，高氧+miR21-5p 組TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平降低（P<0.05）；與高氧+miR21-5p 組比較，高氧+空載體組TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平較升高（P<0.05）。

表4 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)的比較Tab.4 Comparison of expression of TNF-α，IL-6 and IL-1β in lung tissue of mice in each group ±s

表4 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)的比較Tab.4 Comparison of expression of TNF-α，IL-6 and IL-1β in lung tissue of mice in each group ±s

注：①與常氧組比較，P < 0.05；②與高氧組比較，P < 0.05；③與高氧+miR21-5p 組比較，P<0.05

組別常氧組高氧組高氧+miR21-5p 組高氧+空載體組F 值P 值TNF-α（ng/mL）18.97±3.46 344.55±5.11①145.84±6.05①②343.73±4.43①③6499<0.001 IL-6（pg/mL）31.43±3.65 200.67±8.98①120.60±3.87①②201.31±8.43①③870.3<0.001 IL-1β（ng/mL）35.36±5.18 144.50±4.48 87.01±6.19 145.43±5.14 599<0.001

2.5 Tunel 法檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡 如圖3 表5 所示：與常氧組比較，高氧組、高氧+miR21-5p 組及高氧+空載體組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；miR21-5p 預(yù)處理可減輕高氧暴露所致細(xì)胞凋亡，與高氧組比較，高氧+miR21-5p 組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05）。

圖3 Tunel 法檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡情況（×200）Fig.3 The Tunel method detects apoptosis of lung histocytes（×200）

2.6 miR21-5p 對(duì)HALI 小鼠 肺 組織STAT3、p-STAT3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 如表5、圖3所示，各組小鼠高氧暴露48 h 后肺組織STAT3、p-STAT3、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與常氧組比較氧組肺組織STAT3、p-STAT3和Bax蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P< 0.05）；與高氧組比較，高氧+miR21-5p 組小鼠肺組織STAT3、p-STAT3 和Bax 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（P< 0.05）；與高氧+miR21-5p 組比較，高氧+空載體組肺組織STAT3、p-STAT3 和Bax 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。

表5 各組小鼠肺組織STAT3、p-STAT3、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的比較Tab.5 Comparison of STAT3，p-STAT3，Bcl-2 and Bax protein expression in lung tissue of mice in each group ±s

表5 各組小鼠肺組織STAT3、p-STAT3、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的比較Tab.5 Comparison of STAT3，p-STAT3，Bcl-2 and Bax protein expression in lung tissue of mice in each group ±s

注：①與常氧組比較，P<0.05；②與高氧組比較，P<0.05；③與高氧+miR21-5p 組比較，P<0.05

組別常氧組高氧組高氧+miR21-5p 組高氧+空載體組F 值P 值STAT3 0.63±0.07 0.86±0.04①0.39±0.08①②0.89±0.05①③58.14<0.001 P-STAT3 0.61±0.05 0.84±0.04①0.37±0.05①②0.89±0.05①③66.94<0.001 Bax 0.66±0.06 1.03±0.08①0.81±0.06①②1.05±0.08①③21.87<0.001 Bcl-2 1.06±0.08 0.57±0.06①0.81±0.07①②0.61±0.06①③33.75<0.001凋亡率（%）0.36±0.09 5.98±0.91①3.21±0.65①②5.79±0.98①③37.78<0.001

3 討論

HALI 的特征是ROS 蓄積和肺部炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)［14］。一方面，ROS 可通過(guò)脂質(zhì)與蛋白質(zhì)過(guò)氧化、DNA 損傷等機(jī)制造成組織細(xì)胞損傷促進(jìn)炎癥進(jìn)展；另一方面，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步促進(jìn)ROS 產(chǎn)生，引起肺毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮細(xì)胞凋亡壞死，導(dǎo)致其通透性增加，加重肺水腫和（或）肺不張，促進(jìn)ARDS 的發(fā)生發(fā)展［4，15］。而抑制ROS 的超負(fù)荷蓄積可阻止肺泡上皮細(xì)胞凋亡顯著減輕HALI［14］。在本實(shí)驗(yàn)中，高氧暴露48 h 后，可見(jiàn)肺組織大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、間隔增厚、透明膜形成和肺泡萎陷；同時(shí)肺損傷病理評(píng)分、肺水含量及炎癥因子升高；說(shuō)明模型構(gòu)建成功。而通過(guò)miR21-5p 預(yù)處理，可減輕肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度及間隔厚度，且肺泡萎陷顯著減少，同時(shí)肺損傷病理評(píng)分、肺水含量及炎癥因子表降低，并且STAT3 及p-STAT3 蛋白表達(dá)下降，說(shuō)明miR21-5p 可能通過(guò)調(diào)控STAT3 活化減輕HALI。

圖4 miR21-5p 對(duì)HALI 小鼠肺組織STAT3、p-STAT3、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of miR21-5p on the expression of STAT3，p-STAT3，Bcl-2 and Bax proteins in the lung tissues of HALI mice

轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族成員STAT3 在氧化還原平衡、凋亡及炎癥反應(yīng)的作用已成為研究的熱點(diǎn)［4］。目前研究認(rèn)為，適當(dāng)?shù)腞OS 水平可促進(jìn)STAT3 活化，活化的STAT3 可正向和（或）負(fù)向調(diào)控ROS 水平，ROS/STAT3 之間的動(dòng)態(tài)平衡在細(xì)胞促存活方面發(fā)揮重要作用［5］。然而，STAT3 的過(guò)度活化可能破壞氧化還原平衡、血管內(nèi)皮通透和促進(jìn)細(xì)胞凋亡加劇ARDS 的進(jìn)展，而抑制STAT3 的過(guò)度活化可通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮完整性、氧化還原平衡、炎癥反應(yīng)和凋亡減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷［7，16］。本實(shí)驗(yàn)中，高氧暴露48 h 后，可見(jiàn)p-STAT3 水平顯著表達(dá)，同時(shí)MDA、ROS及炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）顯著升高，而SOD 降低，說(shuō)明高氧暴露可破壞氧化還原平衡、促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，而miR21-5p 預(yù)處理后，炎癥因子及MDA、ROS 水平下降，SOD 水平升高，說(shuō)明，miR21-5p 可能通過(guò)STAT3 調(diào)控氧化還原平衡減輕HALI。

microRNAs 是一類(lèi)進(jìn)化上高度保守長(zhǎng)度約19～25 核苷酸的核苷酸RNA，其通過(guò)與靶基因3'非編碼區(qū)（3'-UTR 區(qū)）結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)［17］。其通過(guò)調(diào)控氧化還原平衡、凋亡及炎癥反應(yīng)等病理生理過(guò)程在肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中極為重要［18］。而miR21-5p 已被確認(rèn)為相關(guān)肺部疾病的生物標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)及預(yù)后指標(biāo)的候選者指標(biāo)［10］。部分研究表明，miR21-5p 過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制TNF-α、IL-6 及IL-1β 的表達(dá)和STAT3 活化減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷［10，19-20］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)miRbase 數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)STAT3 是miR21-5p 靶基因，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)及RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR21-5p 可靶向負(fù)調(diào)控STAT3。miR21-5p 過(guò)表達(dá)預(yù)處理后，p-STAT3 水平下降，抗凋亡蛋白Bcl-2 升高，促凋亡蛋白Bax 下降，肺組織細(xì)胞凋亡率顯著下降。表明，miR21-5p 可通過(guò)調(diào)控STAT3 過(guò)度活化抑制組織細(xì)胞凋亡。

綜上，miR21-5p 對(duì)HALI 具有保護(hù)作用，可能通過(guò)調(diào)控氧化還原平衡、抑制炎癥反應(yīng)并減輕細(xì)胞凋亡，并且與轉(zhuǎn)錄激活蛋白STAT3 密切相關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)僅通過(guò)Western blot 及Tunel 法檢測(cè)肺組織凋亡，未在細(xì)胞分子水平檢測(cè)如巨噬細(xì)胞、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡水平；故本實(shí)驗(yàn)還存在不足之處。課題組下一步將通過(guò)沉默STAT3 或使用STAT3 基因敲除鼠進(jìn)一步在細(xì)胞層面探討miR21-5p 靶向STAT3 在HALI 中的分子機(jī)制，以期為臨床防治HALI 提供可靠的科學(xué)依據(jù)。