陳 龍， 董飛龍， 王 建， 查 干， 崔闊澍， 馬杰茹

(1.河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000； 2.內(nèi)蒙古磴口縣林業(yè)和草原有害生物防治檢疫站，內(nèi)蒙古巴彥高勒 015299；3.內(nèi)蒙古烏拉特前旗草原工作站，內(nèi)蒙古烏拉特前旗 014407； 4.內(nèi)蒙古巴彥淖爾市草原工作站，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000；5.四川省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，四川成都 610041)

海藻糖作為一種非還原性雙糖，是大部分昆蟲體內(nèi)的主要糖類物質(zhì)，它存在于除哺乳動(dòng)物之外的其他生物，如細(xì)菌、酵母、真菌、線蟲、植物、昆蟲和其他無脊椎動(dòng)物等[1-4]。海藻糖不僅可以作為儲(chǔ)存庫(kù)儲(chǔ)存碳水化合物，同時(shí)還可以保護(hù)蛋白質(zhì)以及細(xì)胞膜不受外界不利環(huán)境的刺激[5-8]。海藻糖的生產(chǎn)與利用還會(huì)受到極高或極低溫度、干燥、滲透/氧化應(yīng)激和靜水壓力變化以及營(yíng)養(yǎng)缺乏導(dǎo)致的細(xì)胞損傷的干擾[9]。此外，當(dāng)昆蟲處于饑餓環(huán)境中，海藻糖可作為能源物質(zhì)提供能量[8]。

海藻糖酶是調(diào)節(jié)昆蟲體內(nèi)海藻糖的關(guān)鍵酶，是唯一可以水解海藻糖的酶，遍布于昆蟲的各個(gè)組織，可將海藻糖分解為2分子的葡萄糖[7]。根據(jù)海藻糖酶是否存在跨膜結(jié)構(gòu)，可將昆蟲海藻糖酶分為可溶性海藻糖酶(soluble trehalase，TreS或 Tre1)和膜結(jié)合型海藻糖酶(membrane-bound trehalase，TreM 或 Tre2)[10]?？扇苄院Ｔ逄敲阜纸饧?xì)胞內(nèi)的海藻糖，而膜結(jié)合型海藻糖酶分解胞外(主要為食物中)的海藻糖[11]。昆蟲可溶性海藻糖酶基因和膜結(jié)合型海藻糖酶基因分別在黃粉蟲(Tenebriomolitor)[12]和家蠶(Bombyxmori)[13]中首次克隆獲得。此外，在西方蜜蜂(Apismellifera)，甜菜夜蛾(Beetarmyworm)和竹蠹螟(Omphisafuscidentalis)等其他昆蟲中也發(fā)現(xiàn)了這2種海藻糖酶基因[14-16]。海藻糖酶基因在昆蟲各個(gè)組織中均有分布，諸如肌肉相關(guān)組織、腸道和馬氏管等[17-21]。相關(guān)研究表明，海藻糖酶不僅能水解海藻糖為葡糖糖，為昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育提供能源，而且能調(diào)控幾丁質(zhì)代謝并控制蛻皮過程從而影響昆蟲發(fā)育[22-25]。然而，在短期饑餓期間體內(nèi)海藻糖酶基因的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚[19]。

春尺蠖(Apocheimacinerarius)隸屬于鱗翅目、尺蛾科雜食性昆蟲。該蟲在我國(guó)多個(gè)省(市)自治區(qū)危害牧草、林木和經(jīng)濟(jì)樹種[26，27]，在內(nèi)蒙古自治區(qū)主要危害檸條。近些年，春尺蠖的危害對(duì)象逐漸由楊樹、桑樹、柳樹、檸條以及經(jīng)濟(jì)類果樹等林木擴(kuò)散至玉米和小麥等大田作物，區(qū)域也由北部地區(qū)的內(nèi)蒙古及新疆向四川、云南等南部地區(qū)擴(kuò)散危害。幼蟲最早于4月上旬開始發(fā)生危害，4齡幼蟲在荒漠化草原中生存需要很強(qiáng)的耐饑餓能力，春尺蠖4齡幼蟲能在如此環(huán)境中生存下來且發(fā)生危害，與其極強(qiáng)的耐饑性密切相關(guān)。為了深入了解海藻糖酶基因在春尺蠖應(yīng)對(duì)饑餓脅迫中的作用，本研究利用已測(cè)春尺蠖4齡轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，基于測(cè)序所得基因序列信息，結(jié)合NCBI BlastP和RT-PCR技術(shù)克隆獲取2個(gè)海藻糖酶基因，分析其序列分子特征及氨基酸理化性質(zhì)，同時(shí)對(duì)其序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并分析其在不同時(shí)間饑餓脅迫下的表達(dá)譜，以期明確海藻糖酶基因在春尺蠖應(yīng)對(duì)饑餓脅迫中的作用，為進(jìn)一步揭示春尺蠖響應(yīng)饑餓脅迫的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx及樣品處理

將2021年春季于內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗檸條草場(chǎng)(108°45′23.63″E，40°46′4.19″N)采集的春尺蠖雌雄成蟲帶回實(shí)驗(yàn)室在室溫下雌雄配對(duì)，以檸條錦雞兒飼喂，待其產(chǎn)卵后放置于上海智城(ZXQP-R1700)人工氣候箱中孵化，孵化條件[溫度(22±1) ℃，光—暗周期18 h—6 h，相對(duì)濕度55%～59%]，孵化后的1齡幼蟲以幼嫩檸條芽苞飼喂，待幼蟲發(fā)育至4齡，選取4齡幼蟲(蛻皮后2 d)分別進(jìn)行不同時(shí)間的饑餓處理(0、6、24、72 h)，以 0 h 為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭，將處理后的昆蟲用液氮速凍，儲(chǔ)存于 -80 ℃ 冰箱備用。

1.2 主要試劑

供試?yán)ハx的RNA提取、反轉(zhuǎn)錄以及后續(xù)克隆PCR Master Mix、DNA膠回收試劑盒等均采購(gòu)于大連寶生物有限公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α則購(gòu)自于北京天根生化科技有限公司。

1.3 RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

將“1.1”節(jié)處理的供試樣品從-80 ℃超低溫冰箱中取出，放置于已滅菌且預(yù)冷的研缽中研磨，RNA提取步驟則參照寶生物公司的RNA提取試劑盒說明書，將提取后的RNA用Nano PhotometerTMP-Class超微量分光光度計(jì)檢驗(yàn)濃度，使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)檢測(cè)提取RNA的質(zhì)量，待濃度和質(zhì)量符合試驗(yàn)要求后反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈。

1.4 春尺蠖海藻糖酶基因的克隆

本研究基于本實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)序完成的春尺蠖4齡幼蟲不同饑餓時(shí)間的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組差異分析結(jié)果，篩選出2條具有完整CDS的海藻糖酶基因?；谛蛄行畔⑴cBlastP驗(yàn)證結(jié)果，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CDS區(qū)域。選擇上述處理中PCR擴(kuò)增條帶最亮的樣本為cDNA模板。AcinTre1A擴(kuò)增正向引物(F)：5′-C T C T C C G A T T G C A T G G T T C T A C T T A-3′；反向引物(R)：5′-A T T T A T C T T A T T T A T G A C G C A C G T A T A-3′。AcinTre1A-like擴(kuò)增正向引物(F)：5′-T G C T T G C T G T C T G C T A C C A T G T G A C-3′；反向引物(R)：5′-C G A T C G T C T C C C A T A C G T G C A G A T T-3′。目的基因克隆利用RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為 25 μL，其中包括目的基因擴(kuò)增模板1 μL，正向/反向引物各1 μL，PCR原料Master Mix 12.5 μL，其余體積用無酶水(RNase-free Water)補(bǔ)充至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃/68 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因的擴(kuò)增片段，而后切膠回收利用塔克拉的DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收，待檢測(cè)合格后，與克隆載體pMD-19T連接，隨后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中轉(zhuǎn)化，最后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選和菌液PCR擴(kuò)增，選取符合條件的菌落在液體培養(yǎng)基連夜培養(yǎng)12～16 h后送華大基因測(cè)序。

1.5 春尺蠖海藻糖酶基因的生物信息學(xué)分析

基于在線預(yù)測(cè)工具ORF Finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對(duì)春尺蠖海藻糖酶基因的蛋白編碼區(qū)進(jìn)行搜索。使用在線預(yù)測(cè)工具ExPASy-ProtParam tool(http：//web.expasy.org/protparam/)來預(yù)測(cè)春尺蠖海藻糖酶基因編碼氨基酸的基本理化性質(zhì)；使用DNAMAN 6.0軟件分析春尺蠖及其他鱗翅目昆蟲的海藻糖酶基因及其類似基因氨基酸的序列一致。利用SignalIP4.1(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-4.1)在線預(yù)測(cè)工具對(duì)春尺蠖海藻糖酶氨基酸N端信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)；蛋白跨膜區(qū)域則采用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行預(yù)測(cè)；磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)則分別選用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站NetPhos 3.1 Server (http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和DictyOGlyc1.1在線預(yù)測(cè)(http：//www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/)。系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建則選用MEGA 6.0，采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)、P距離(P-distance)，重復(fù)運(yùn)算1 000次。

1.6 春尺蠖海藻糖酶基因饑餓脅迫下的表達(dá)

為探究海藻糖酶基因在春尺蠖饑餓脅迫下的表達(dá)模式，本研究以前期測(cè)序獲取的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的FKPM(Fragment Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)值，對(duì)春尺蠖AcinTre1A和AcinTre1A-like基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

整理完成春尺蠖AcinTre1A和AcinTre1A-like基因表達(dá)數(shù)據(jù)后，利用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，具體方法為單因素方差分析中的Duncan’s多重比較來分析基因表達(dá)量。研究結(jié)果則利用GraphPad Prism 7.0繪制柱形圖，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，顯著水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 春尺蠖海藻糖酶基因的克隆與序列分析

基于春尺蠖4齡幼蟲轉(zhuǎn)錄組中春尺蠖海藻糖酶基因序列，設(shè)計(jì)目的基因擴(kuò)增引物后經(jīng)1.0%濃度的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在1 919、2 412 bp處各出現(xiàn)1條單一、特異性條亮帶，經(jīng)測(cè)序后與轉(zhuǎn)錄組中基因序列信息比對(duì)，序列信息完全一致(圖1、圖2)，分別對(duì)其命名為AcinTre1A(基因登錄號(hào)：OL512971)和AcinTre1A-like(基因登錄號(hào)：OL512972)。

春尺蠖AcinTre1A與AcinTre1A-like基因編碼蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，春尺蠖AcinTre1A與AcinTre1A-like基因序列CDS全長(zhǎng)分別為1 803、1 746 bp，分別編碼601、582個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子式分別為C3 122H4 716N806O934S16和C3 037H4 620N800O856S14，蛋白的預(yù)測(cè)分子量分別為68.99、66.48 ku，理論預(yù)測(cè)等電點(diǎn)分別為4.95、6.08；半衰期均為30 h，脂肪指數(shù)分別為79.71、84.81，負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)總電荷分別為93、71，正電荷殘基(Arg+Lys)總電荷分別為62、66；該蛋白的親水性系數(shù)分別為 -0.516、-0.359，均為親水性蛋白。N端氨基酸均為蛋氨酸(Met，M)，預(yù)測(cè)不穩(wěn)定系數(shù)值分別為41.51、37.56，由于AcinTre1A的不穩(wěn)定系數(shù)大于40，故其為不穩(wěn)定蛋白，而AcinTre1-like的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，所以該蛋白為穩(wěn)定蛋白。信號(hào)肽檢測(cè)結(jié)果均發(fā)現(xiàn)2基因均含信號(hào)肽，其中AcinTre1A在N端含1條25個(gè)氨基酸(M L K I R V P R F V P L Y P V L G L L G A C A Q A)的信號(hào)肽(圖3-A)，AcinTre1A則含1條18個(gè)氨基酸(M K H L L L V V L A A A A V V T D D)的信號(hào)肽，均未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)。此外，具有2個(gè)海藻糖酶超家族保守結(jié)構(gòu)域分別位于第27～551位和第27～562位氨基酸。磷酸位點(diǎn)檢測(cè)在AcinTre1A與AcinTre1A-like中分別發(fā)現(xiàn)絲氨酸26、22個(gè)，蘇氨酸16、11個(gè)，酪氨酸13、15個(gè)(圖4)；檢測(cè)各發(fā)現(xiàn)1個(gè)糖基化位點(diǎn)(圖5)。

2.3 春尺蠖海藻糖酶基因的同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

由圖6可見，春尺蠖AcinTre1A、AcinTre1A-like與其他鱗翅目昆蟲的氨基酸整體一致性為67.79%，其中AcinTre1A與AcinTre1A-like之間的一致性僅為46.08%。春尺蠖AcinTre1A與灰斑霜尺蠖Apocheimapilosaria的一致性最高，為88.54%，其次為尺蛾科的雙齒貢尺蛾Odontoperabidentata和天蛾科的煙草天蛾Manducasexta，分別為78.07%、62.96%；AcinTre1A-like與煙草天蛾、藝神袖蝶Heliconiuserato和大蠟螟Galleriamellonella也均保持較高的一致性，分別為79.21%、71.48%、68.10%。

從春尺蠖與其他鱗翅目昆蟲海藻糖基因及其類似物的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7)可以看出，總體來看，海藻糖酶基因與其類似基因分別聚在2個(gè)分支上，春尺蠖的2個(gè)基因也聚在各自的大分支中；春尺蠖AcinTre1A與同為尺蛾科的灰斑霜尺蠖Tre1A聚為一類，AcinTre1A-like與天蛾科的煙草天蛾聚為一類；斜紋夜蛾Spodopteralitura與草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda的Tre-like在系統(tǒng)進(jìn)化樹中與其他昆蟲的Tre更近，說明這2個(gè)類似基因與Tre基因序列更加相似，功能更為相近。

2.4 春尺蠖海藻糖酶基因饑餓脅迫下的表達(dá)分析

從圖8可知，春尺蠖AcinTre1A和AcinTre1A-like基因隨著饑餓處理時(shí)間的增加，表達(dá)量逐漸降低，AcinTre1A-like下降速度較緩，而AcinTre1A則下降較快；除處理6 h外，與對(duì)照相比，其余處理時(shí)間基因表達(dá)量均呈顯著差異(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

本研究從已有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出2條差異的海藻糖基因，通過BlastP的進(jìn)一步驗(yàn)證，基于驗(yàn)證序列信息與RT-PCR技術(shù)成功獲取上述基因的蛋白編碼區(qū)。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中均未發(fā)現(xiàn)有跨膜結(jié)構(gòu)，卻均含信號(hào)肽，符合可溶性海藻糖酶基因的特征[10]。此外，BlastP的比對(duì)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)多個(gè)可溶性海藻糖酶基因，同時(shí)序列比對(duì)中與其他昆蟲的海藻糖酶基因的一致性均分別在62.96%、68.10%以上，最高分別達(dá)88.54%、79.21%。綜上所述，將春尺蠖2個(gè)海藻糖酶基因鑒定為可溶性海藻糖酶基因，并命名為AcinTre1A、AcinTre1A-like。

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，AcinTre1A、AcinTre1A-like基因序列CDS全長(zhǎng)分別為1 803、1 746 bp，分別編碼601個(gè)和582個(gè)氨基酸，蛋白的預(yù)測(cè)分子量分別為68.99、66.48 ku，理論預(yù)測(cè)等電點(diǎn)分別為4.95、6.08，與大多數(shù)昆蟲的海藻糖酶基因及其類似基因相似。AcinTre1A與AcinTre1A-like基因均有1條信號(hào)肽，但無跨膜結(jié)構(gòu)，說明其可能是非膜相關(guān)蛋白[28]，符合海藻糖酶基因作為分泌蛋白需要游離至胞外發(fā)揮作用的特征。2個(gè)基因均含磷酸位點(diǎn)，推測(cè)其可能參與昆蟲體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[29]。從序列比對(duì)結(jié)果可以看出，AcinTre1A相較于AcinTre1A-like基因長(zhǎng)度略長(zhǎng)，這可能導(dǎo)致在系統(tǒng)進(jìn)化分析中聚類的原因之一。但發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾和草地貪夜蛾的Tre-like基因與Tre基因分支聚為一類，與Tre基因相比，其親緣關(guān)系較其他昆蟲的Tre-like更近，說明這2個(gè)類似基因在序列結(jié)構(gòu)和功能上與Tre基因更為相似。

相關(guān)研究表明，海藻糖酶基因在抵抗外界不利因素和能量調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[30-31]。如在外界處于干旱時(shí)，黑腹果蠅Drosophilamelanogaster體內(nèi)的海藻糖酶活性下降，升高的海藻糖可作為保護(hù)因子來幫助昆蟲清除由干旱產(chǎn)生的活性氧[32]。在異色瓢蟲Harmoniaaxyridis的研究中發(fā)現(xiàn)，HaTreh1-1是可調(diào)節(jié)能量代謝并提供葡萄糖的關(guān)鍵基因，而HaTreh1-2在該蟲饑餓期間可與HaTPS協(xié)同來調(diào)節(jié)海藻糖，使其處于平衡動(dòng)態(tài)狀態(tài)[19]，在步甲Merizodussoledadinus成蟲中也發(fā)現(xiàn)該蟲在食物匱乏期間顯著增加了糖和甘油三酯的水解，用以蟲體供能[33]。在本研究中，隨著饑餓處理時(shí)間的增加AcinTre1A和AcinTre1A-like基因的表達(dá)量逐漸降低。隨著饑餓時(shí)間的增加，體內(nèi)海藻糖酶下降以保留更多的海藻糖用來抵御外界不利環(huán)境，同時(shí)前期海藻糖酶分解了足夠多的物質(zhì)，所以能量足以滿足機(jī)體所需，所以海藻糖酶呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說明AcinTre1A和AcinTre1A-like可能在蟲體能量不足時(shí)的能量補(bǔ)給源，還可調(diào)節(jié)機(jī)體海藻糖含量用來抵御外界的不利環(huán)境。

本研究中已完成對(duì)AcinTre1A和AcinTre1A-like的克隆和鑒定以及蛋白理化性質(zhì)的分析等，此外還分別對(duì)基因的序列與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析，明確了其在饑餓脅迫的表達(dá)水平，但是還有相關(guān)問題待進(jìn)一步明確。(1)本研究雖然對(duì)春尺蠖海藻糖酶基因進(jìn)行在不同饑餓時(shí)間的表達(dá)譜分析，但是還缺乏組織表達(dá)分析，由于2種海藻糖酶在組織表達(dá)譜上也有區(qū)別，組織表達(dá)水平的研究可進(jìn)一步確認(rèn)基因類型，同時(shí)還可進(jìn)一步明確海藻糖酶發(fā)揮作用的精確位置，為后續(xù)的功能研究奠定一定的基礎(chǔ)。(2)不同饑餓處理的時(shí)間間隔略長(zhǎng)，無法觀測(cè)到海藻糖酶基因的漸變過程，后期應(yīng)細(xì)化饑餓處理時(shí)間間隔，以期全面把握基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，為后續(xù)相關(guān)研究的開展提供依據(jù)。(3)在春尺蠖轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了可溶性和膜結(jié)合型海藻糖酶2種類型，本研究只針對(duì)可溶性海藻糖酶基因進(jìn)行研究，后期研究膜結(jié)合型海藻糖酶，以期更加系統(tǒng)全面地明確春尺蠖在饑餓脅迫中海藻糖代謝及抵御饑餓脅迫的分子機(jī)制。此外，海藻糖的調(diào)控過程與海藻糖合成酶TPS密切相關(guān)，可平衡海藻糖在體內(nèi)的含量，二者協(xié)同作用有待于進(jìn)一步研究。

本研究克隆獲取了2條海藻糖酶基因，明確了其理化性質(zhì)、序列特征及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，同時(shí)分析了其在不同饑餓脅迫下的表達(dá)水平。研究結(jié)果表明，春尺蠖春尺蠖海藻糖酶基因AcinTre1A和AcinTre1A-like屬于可溶性海藻糖，春尺蠖在饑餓脅迫下AcinTre1A和AcinTre1A-like可被誘導(dǎo)表達(dá)，研究結(jié)果有助于為今后開展海藻糖酶基因在春尺蠖抵御饑餓脅迫的功能以及分子機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。