彭真奇，于曉慧，邢安琪，克軍宏，李陽(yáng)，蔣文明，劉朔，李金平，彭程，張富友，王桂軍，王靜靜，劉華雷

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽合肥 230036；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生物安全風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警及防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南方），山東青島 266032；4.寧夏大學(xué)，寧夏銀川 750021；5.塔里木大學(xué)，新疆阿拉爾 843300）

鴿新城疫俗稱鴿瘟，是由新城疫病毒（NDV）引起鴿的一種急性、高度接觸性傳染病。NDV 在鴿群和雞群引起相似的臨床癥狀，以腸炎、嚴(yán)重腹瀉等消化道癥狀和扭頭歪脖、癱瘓等神經(jīng)癥狀為主，傳播迅速，并引起較高的發(fā)病率及死亡率，對(duì)養(yǎng)鴿業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。鴿NDV，也被稱為鴿副黏病 毒I 型（pigeon paramyxovirus type I，PPMV-1），是NDV 的抗原變異株。NDV 在分離地位上屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）正禽腮腺炎病毒屬（Orthoavulavirus）正禽腮腺炎病毒1 型（Avian orthoavulavirus 1）[3]。NDV 基因組為單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA，包含6 個(gè)結(jié)構(gòu)基因，基因排列順序?yàn)?'-NP-P-M-F-HN-L-5'，分別編碼囊膜表面的融合蛋白（fusion，F(xiàn)）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidase，HN）以及與病毒聚合酶有關(guān)的核衣殼蛋白（nucleocapsidprotein，NP）、磷蛋白（phosphoprotein，P）、RNA 聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，L）和構(gòu)成病毒囊膜表面支撐物的基質(zhì)蛋白（matrix，M），此外P基因在轉(zhuǎn)錄時(shí)會(huì)產(chǎn)生2 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白——V 蛋白和W 蛋白[4-5]。NDV 毒力與F 蛋白的裂解位點(diǎn)密切相關(guān)[6]，但其毒力并不僅受F 蛋白裂解位點(diǎn)影響[7-8]，還與病毒復(fù)制復(fù)合物NP、P 和L 蛋白有一定關(guān)系[9-10]。NDV 雖然只有1 種血清型，但依據(jù)F基因編碼區(qū)序列差異將其分為I 類（Class I）和II 類（Class II）兩大類，其中I 類NDV 包含1個(gè)基因型3 個(gè)基因亞型，II 類NDV 至少分為21 個(gè)基因型（I—XXI），大部分基因型又可分為不同的基因亞型?；騐I 型NDV 可分為VI.1、VI.2.1、VI.2.1.2、VI.2.2.1、VI.2.2.2、VI.2.1.1.1、VI.2.1.1.2.1 以及VI.2.1.1.2.2 共8 個(gè)基因亞型[11]。

20 世紀(jì)70年代，Mars等[12]在德國(guó)首次報(bào)道了鴿群暴發(fā)新城疫。1985年，李德厚等[13]首次從我國(guó)鴿群中分離到基因VI 型NDV 強(qiáng)毒株。隨后該毒株在我國(guó)鴿群廣泛流行，目前已成為危害我國(guó)養(yǎng)鴿業(yè)主要病原之一。分子流行病學(xué)研究[14]表明，基因VI 型是在我國(guó)鴿群中流行的優(yōu)勢(shì)NDV基因型。受免疫選擇壓力以及RNA 病毒變異特性影響，NDV 變異速度加快，新亞型不斷出現(xiàn)，鴿NDV 已顯示出較明顯的遺傳多樣性。2015年印度在鴿群中新分離到基因VI.2.1.1.2.1 亞型毒株[15]。我國(guó)先后報(bào)道了VI.2.1.1.2.2 亞型病毒和基因XX型毒株在鴿群中的流行[16-17]。國(guó)家新城疫參考實(shí)驗(yàn)室的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，近年來(lái)我國(guó)鴿群的NDV檢出率呈明顯升高趨勢(shì)[14]。因此，需要加強(qiáng)對(duì)鴿NDV 的監(jiān)測(cè)和預(yù)警，深入分析流行毒株的分子特征，為研發(fā)基因VI 型新城疫疫苗提供依據(jù)。本研究對(duì)2021—2022年在國(guó)內(nèi)部分地區(qū)篩選出的8 株鴿NDV 代表株進(jìn)行全基因組測(cè)序和系統(tǒng)的基因組特征分析，以期進(jìn)一步了解我國(guó)鴿NDV 的遺傳進(jìn)化特征，為綜合防控鴿新城疫和疫苗研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株來(lái)源

從2021—2022年我國(guó)分離到的27株鴿NDV 中，篩選出8 株不同年份、不同地區(qū)代表株，分別為Pigeon/Anhui/2432/2021、Pigeon/Fujian/2168/2021、Pigeon/Fujian/1187/2021、Pigeon/Jiangxi/2027/2021、Pigeon/Yunnan/1078/2022、Pigeon/Ningxia/1111/2022、Pigeon/Guangxi/1228/2022 和Pigeon/Guangdong/2285/2022（表1）。8 株毒株由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室從活禽市場(chǎng)采集的鴿口咽/泄殖腔拭子中分離、鑒定并保存。

表1 鴿NDV 代表株信息

1.2 主要試劑及材料

RNA 提取試劑盒，購(gòu)自濟(jì)凡生物科技（常州）有限公司；RT-PCR 引物，由青島睿博興科生物技術(shù)有限公司合成；RT-PCR 試劑盒One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit，購(gòu)自TaKaRa公司；SPF 雞胚，購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司。

1.3 病毒繁殖和純化

將保存的鴿NDV 代表株，按照常規(guī)方法接種9～11 日齡SPF 雞胚，棄18 h 內(nèi)死亡雞胚，96 h 后通過(guò)血凝（HA）試驗(yàn)鑒定收獲的雞胚尿囊液，鑒定結(jié)果為HA 陽(yáng)性的尿囊液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

病毒純化使用有限稀釋法：用PBS 將病毒進(jìn)行10 倍倍比稀釋，病毒尿囊液的不同稀釋度分別接種3 枚SPF 雞胚，每枚胚接0.2 mL 病毒液。收取上述試驗(yàn)結(jié)果中HA 陽(yáng)性且最高稀釋度的病毒尿囊液進(jìn)行上述重復(fù)試驗(yàn)。純化5 次后，收取病毒尿囊液作為種毒，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 核酸提取及RT-PCR 擴(kuò)增

將上述收集保存的病毒尿囊液，參照濟(jì)凡生物科技（常州）有限公司FineQuick 快速病毒DNA/RNA 柱式提取試劑盒說(shuō)明書提取RNA；利用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit 試劑盒及特異性引物[14]，擴(kuò)增病毒基因組序列。RT-PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min 45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。利用SMARTer? RACE 5'/3' Kit（clontech）試劑盒測(cè)定基因組5' 和3' 末端序列[14]。測(cè)序工作由青島睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

1.5 基因組序列拼接與分析

使用Lasergene 軟件將所測(cè)序列參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的基因VI 型NDV 基因組全長(zhǎng)序列，進(jìn)行編輯拼接和分析；使用MEGA 6.0 軟件，依據(jù)NDV F 和HN 蛋白功能區(qū)序列[18]，對(duì)8 株代表株的F 和HN 蛋白氨基酸關(guān)鍵位點(diǎn)的變異情況進(jìn)行分析。

1.6 遺傳進(jìn)化分析

使用MEGA 6.0 軟件，針對(duì)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的參考序列和8 株鴿NDV 代表株的F基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，采用鄰位相連法（neighbor-joining）構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，bootstrap 設(shè)為1 000 次重復(fù)。

1.7 基因重組分析

使用RDP4軟件，通過(guò)GenConv、RDP、Chimaera、SiScan、LARD、MaxChi 等算法，對(duì)8株基因VI 型NDV 毒株全長(zhǎng)序列進(jìn)行重組分析。

2 結(jié)果

2.1 基因組序列分析

8 株鴿NDV 代表株的基因組長(zhǎng)度分析結(jié)果（表2）顯示：8 株病毒基因組長(zhǎng)度均為15 192 nt，按3'-NP-P-M-F-HN-L-5'的基因順序排列；分離株基因組3'和5'末端長(zhǎng)度分別為55 和 114 nt，各基因的5'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)（untranslated region，UTR）堿基數(shù)均高于3'UTR，除了F-HN 和HN-L 的基因間隔區(qū)（intergenic sequence，IGS）長(zhǎng)度分別為31 和47 nt，其他基因之間IGS 長(zhǎng)度均為1 nt；8 株代表株的NP、P、M 和L 蛋白的長(zhǎng)度分別為489、395、364 和2 204 aa，F(xiàn) 蛋白長(zhǎng)度均為553 aa，與基因VI 型NDVF基因長(zhǎng)度一致。

表2 鴿NDV 的基因組長(zhǎng)度特征

8 株代表毒株的F 和HN 蛋白功能區(qū)氨基酸變異分析結(jié)果（表3）顯示：F 蛋白裂解位點(diǎn)均為112RRQKR/F117，呈典型NDV 強(qiáng)毒特征；與其他NDV 分子特征類似，有6 個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)（N-X-S/T）位于F 蛋白；與100 株不同毒力毒株參考序列[18]的F 蛋白功能區(qū)對(duì)比，8 株毒株在F 蛋白融合肽（fusion peptide）、七肽重復(fù)區(qū)（heptad repeat region，HR）和跨膜區(qū)（transmembrane domain）均有多處氨基酸變異，其中GD2285/2022 株有8 個(gè)氨基酸變異，AH2432/2021株和FJ1187/2021 株各有7 個(gè)氨基酸變異，GX1228/2022 株有6 個(gè)氨基酸變異，F(xiàn)J2168/2021 株、YN1078/2022株和NX1111/2022株各有5 個(gè)氨基酸變異，JX2027/2021 株有4 個(gè)氨基酸變異。除GD2285/2022 毒株的HN 蛋白長(zhǎng)度為577 aa 外，其余病毒的HN 蛋白長(zhǎng)度均為571 aa；8 株代表株均具有5 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別為125（NNS）、347（NNT）、439（NKT）、487（NHT）、514（NIS），多個(gè)氨基酸變異存在于跨膜區(qū)。

表3 F 和HN 蛋白功能區(qū)氨基酸變異情況

HN 蛋白中和抗原表位氨基酸變異分析結(jié)果（表4）顯示：8 株代表毒株HN 蛋白中和抗原表位均存在包含R197I、N263K、E347G、D349E、I514V 在內(nèi)的至少5 個(gè)氨基酸變異，其中NX1111/2022 株和GX1228/2022 株共有6 個(gè)氨基酸變異，在5 個(gè)共同氨基酸變異的基礎(chǔ)上，增加 了D569E；AH2432/2021株和JX2027/2021 株共有7 個(gè)氨基酸變異，增加了I352V、D569G；FJ2285/2021 株共有7 個(gè)氨基酸變異，增加了K321R 和D569E；YN1078/2022 株共有7 個(gè)氨基酸變異，增加了R353Q 和D569E；FJ2168/2021 株共有8 個(gè)氨基酸變異，增加了I352V、D569G 和K321E；GD2285/2022 株有9 個(gè)氨基酸變異，增加了I352V、D569G、K/R333E 和K321E。

表4 HN 蛋白中和抗原表位氨基酸變異情況

2.2 遺傳進(jìn)化分析

使用MEGA 6 軟件對(duì)8 株代表株的F基因序列和GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的參考序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果（圖1）顯示：我國(guó)基因VI 型分離株具有遺傳多樣性，其中4 株病毒屬于基因VI.2.1.1.2.1 亞型，4 株病毒屬于基因VI.2.1.1.2.2亞型。經(jīng)MegAlign 軟件對(duì)比，8 株病毒全長(zhǎng)基因組的核苷酸同源性為91.9%～99.0%，其中NP基因核苷酸同源性為93.3%～98.8%，P基因?yàn)?0.4%～98.3%，M基因?yàn)?1.1%～99.2%，F(xiàn)基因?yàn)?2.0%～98.9%，HN基因?yàn)?1.5%～99.0%，L基因?yàn)?3.1%～99.5%。4 株基因VI.2.1.1.2.1 亞型毒株間F基因核苷酸同源性為97.8%～98.9%，編碼氨基酸同源性為97.8%～99.5%；4 株基因VI.2.1.1.2.2 亞型毒株間F基因核苷酸同源性為96.3%～98.2%，編碼氨基酸同源性為97.8%～98.9%。將8 株病毒F基因與近年來(lái)我國(guó)分離的基因VI 型毒株進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，4 株基因VI.2.1.1.2.2 亞型毒株F基因與Yu[14]等分離的18 株VI.2.1.1.2.2 亞型NDV 的核苷酸同源性為95.7%～99.6%，與Wang等[19]分離的5 株VI.2.1.1.2.2 亞型NDV 的同源性為96.3%～98.7%；4 株基因VI.2.1.1.2.1 亞型毒株F基因與Wang等[19]分離的1 株VI.2.1.1.2.1 亞型NDV 同源性為97.4%～98.9%。8 株鴿NDVF基因和HN基因與王靜靜等[20]從雞群分離的5 株基因VII 型NDV 的核苷酸同源性分別為85.7%～88.1%和83.9%～87.3%。使用RDP4 軟件對(duì)8 株鴿NDV基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)分析，并未發(fā)現(xiàn)基因重組（P＜0.05）。

圖1 鴿NDV 分離株F 基因遺傳進(jìn)化樹

3 討論

新城疫是一種急性、烈性、高度接觸性的傳染病，給家禽養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)收入帶來(lái)了沖擊。NDV傳播迅速，易感宿主廣，已在世界范圍內(nèi)流行。鴿NDV 也被稱為PPMV-1，是由傳播到鴿體內(nèi)的雞源NDV 產(chǎn)生的變異株。鴿NDV 于20 世紀(jì)70年代在德國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)，1977年傳播到中東，隨后迅速傳播至歐美等各國(guó)，并導(dǎo)致第三次新城疫全球大流行。1985年鴿新城疫首次傳入我國(guó)，隨后在各地相繼被報(bào)道，已嚴(yán)重阻礙了我國(guó)養(yǎng)鴿業(yè)的健康發(fā)展。2010—2012年Guo等[21]從我國(guó)4 個(gè)省份分離出的8 株鴿NDV，發(fā)現(xiàn)其均屬于VI.2.1.1.2.2亞型；2011—2013年Wang等[19]從我國(guó)6 個(gè)省份分離出6 株鴿NDV，發(fā)現(xiàn)其中5 株為VI.2.1.1.2.2亞型，1 株為VI.2.1.1.2.1 亞型；2014—2021年羅瑤瑤等[22]與Yu等[14]從國(guó)內(nèi)部分地區(qū)分離出28 株鴿NDV，發(fā)現(xiàn)其均屬于VI.2.1.1.2.2亞型。由此可見，在過(guò)去的十年間，基因VI.2.1.1.2.2 亞型NDV 為我國(guó)鴿群中主要流行毒株。本研究對(duì)2021—2022年從國(guó)內(nèi)部分地區(qū)鴿群分離到的8 株NDV 代表株進(jìn)行基因組測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)4 株屬于基因VI.2.1.1.2.1 亞型，4 株屬于基因VI.2.1.1.2.2 亞型。上述研究均表明，近期流行的鴿NDV 具有遺傳多樣性，且基因VI.2.2.1.2.1 亞型分離株數(shù)量和分布省份也在不斷增加，這可能與活禽跨省調(diào)運(yùn)、部分活禽市場(chǎng)消毒措施落實(shí)不到位以及鴿群遷移等因素有關(guān)。

鴿NDV F 蛋白裂解位點(diǎn)與病毒毒力密切相關(guān)[14]。本次分離出的8 株鴿NDV 的F 蛋白裂解位點(diǎn)均為112RRQKR/F117，為典型的NDV 強(qiáng)毒株分子特征。8 株鴿NDV 全長(zhǎng)基因組的核苷酸同源性較高，為91.9%～99.0%。與新城疫疫苗株La Sota等參考序列相比，8 株鴿NDV 在F 蛋白的七肽重復(fù)、區(qū)融合肽和跨膜區(qū)均有多處氨基酸變異，糖基化位點(diǎn)比較保守；HN 蛋白糖基化位點(diǎn)半胱氨酸殘基高度保守，其抗原中和表位中發(fā)生多個(gè)氨基酸變異。突變的產(chǎn)生可能是由于長(zhǎng)期的疫苗免疫壓力以及RNA 病毒的變異特性造成的，而抗原位點(diǎn)多處的氨基酸變異使其抗原性正逐漸發(fā)生變化，從而導(dǎo)致疫苗免疫失敗。國(guó)家新城疫參考實(shí)驗(yàn)室的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，近年來(lái)我國(guó)鴿NDV 流行率有升高的趨勢(shì)[14]。其主要原因可能在于傳統(tǒng)疫苗免疫效果不佳，且鴿新城疫尚缺乏抗原匹配性疫苗[23]。

鴿產(chǎn)業(yè)是我國(guó)第四大家禽產(chǎn)業(yè)，而影響?zhàn)B鴿業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一便是新城疫，因此要高度重視鴿新城疫防控，加強(qiáng)監(jiān)測(cè)預(yù)警以及抗原匹配性疫苗研發(fā)，提高生物安全水平等綜合性防控措施。

4 結(jié)論

我國(guó)安徽、福建等7 個(gè)省份鴿群中流行的NDV 具有強(qiáng)毒分子特征，其F 蛋白七肽重復(fù)區(qū)、蛋白融合肽和跨膜區(qū)以及HN 中和抗原表位、蛋白跨膜區(qū)等功能區(qū)域存在多處氨基酸變異，且分屬于2 個(gè)基因亞型，表明我國(guó)鴿NDV 具有遺傳多樣性。建議加強(qiáng)鴿NDV 監(jiān)測(cè)，加快鴿新城疫抗原匹配性疫苗研發(fā)，以有效防控鴿新城疫流行。