胡學(xué)義，沈 豐，武 倫，蘇才武，魏 澗

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院普外科，湖北 十堰 442000)

甲狀腺癌(thyroid cancer，TC)是全球范圍最常見的惡性內(nèi)分泌腫瘤，1990—2019年，甲狀腺癌的發(fā)病率顯著上升，增速在所有的惡性腫瘤中位居第一，甲狀腺癌分為多種類型，其中甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)占比約為85%，是甲狀腺最常見的病理類型[1-4]。脊椎蛋白2(spondin 2，SPON2)又稱為M-spondin 或者DIL-1，該蛋白分泌至細(xì)胞外基質(zhì)，在先天性免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。近年來相關(guān)研究表明，SPON2 蛋白在前列腺癌、直腸癌、卵巢癌等腫瘤組織中均高表達(dá)[5]。目前未見SPON2與甲狀腺癌預(yù)后關(guān)系的報(bào)道。本研究以PTC為例研究SPON2 在甲狀腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，利用相關(guān)的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，分析SPON2與甲狀腺癌臨床分期、預(yù)后及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系，以期尋找SPON2作為甲狀腺癌潛在治療靶點(diǎn)的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2020-07-04—2020-11-24 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院PTC 及其癌旁組織新鮮手術(shù)標(biāo)本7例，立即凍存于-80 ℃冰箱備用。并收集2019-01-01—2020-12-17該院病理科存檔PTC手術(shù)切除石蠟標(biāo)本68 例以及所對(duì)應(yīng)的PTC 癌旁標(biāo)本(距腫瘤邊緣至少2 cm)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理明確診斷為PTC；②此前未接受手術(shù)、放化療、靶向藥物治療等抗腫瘤相關(guān)治療；③臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤；②合并其他類型甲狀腺癌。68例入組病例中男性病例19 例，女性49 例。該研究獲湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批編號(hào)LW-2022-005)。

1.2 主要試劑及儀器

SPON2 抗體購(gòu)自 Protein Tech 公 司 ， HRP 標(biāo) 記 的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Gene Tex公司，總RNA提取試劑盒和一步法-反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)試劑盒均購(gòu)自TIANGEN公司。

1.3 PTC組織SPON2 mRNA表達(dá)的檢測(cè)

取凍存于-80 ℃冰箱中的新鮮PTC 癌及癌旁組織標(biāo)本，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)量總RNA 的濃度及純度。然后用一步法qPCR 試劑盒檢測(cè)PTC 癌及癌旁組織中SPON2 的mRNA 表達(dá)水平。引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物 序 列 為 5′-GATTGTAGACAGCGCCTCAGTTCC-3′，下游引物為5′-GACGCACTCAGCCTCTTCTTCG-3′；內(nèi)參 基 因β-actin的 上 游 引 物 為 5′-ACTATCGGCAAT GAGCGGTTCC-3′，下游引物為 5′-CTGTGTTGGCAT AGAGGTCTTTACG-3′。qPCR 反應(yīng)條件為：50 ℃、30 min(逆轉(zhuǎn)錄)，95 ℃、3 min(預(yù)變性)，95 ℃、15 s、60 ℃、30 s(40個(gè)循環(huán))。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均CT值作為該樣本的最終CT值。以2-ΔΔCT表示組織SPON2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 PTC組織中SPON2蛋白表達(dá)的檢測(cè)

取PTC 及其癌旁石蠟標(biāo)本，切片后放置于60 ℃烤箱中烤片3 h，二甲苯脫蠟后放入檸檬酸抗原修復(fù)液中進(jìn)行熱修復(fù)，使用H2O2室溫靜置孵育10 min，滴加SPON2 兔多克隆抗體(1∶500 稀釋)于4 ℃冰箱孵育過夜；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶500 稀釋)，室溫孵育30 min；室溫下用顯色劑(DAB)顯色8 min后用自來水沖洗1 min；蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，封片。用PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照，人前列腺增生組織作為陽性對(duì)照。結(jié)合文獻(xiàn)[5]，使用顯微鏡(×400)隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分。陽性細(xì)胞比例≤0%記 1 分，10%~50%(含)記 2 分，50%~75%(含)記 3分，>75%以上記4 分；觀察染色強(qiáng)度，不著色記1分，弱染色記2分，中等強(qiáng)度染色記3分，強(qiáng)染色記4分。綜合兩者結(jié)果，以細(xì)胞陽性比例與染色強(qiáng)度乘積得分判斷結(jié)果：積分≤4 分為陰性，乘積>4 分則為陽性。

1.5 Kaplan Meier-Plotter 分析 SPON2 mRNA 表達(dá)與甲狀腺癌臨床預(yù)后的關(guān)系

使用Kaplan Meier-Plotter(http://kmplot.com/analysis/)數(shù)據(jù)庫(kù)[6]分析SPON2 mRNA 表達(dá)水平與甲狀腺癌患者的預(yù)后關(guān)系。在平臺(tái)中選擇“start KM Plotter for pan-cancer”，檢索“SPON2”基因，腫瘤類型選擇“thyroid carcinoma”， 繪 制 甲 狀 腺 癌 “SPON2”mRNA 表達(dá)高低與預(yù)后相關(guān)的總生存率(overall survival，OS)曲線。

1.6 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析SPON2 mRNA 與甲狀腺癌臨床分期的關(guān)系

使用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù)[7]，檢索“SPON2”，選擇“Expression DIY”中的“Stage plot”，選擇腫瘤名稱為“THCA”，然后繪制圖形。

1.7 TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析SPON2 mRNA 在甲狀腺癌中的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

進(jìn)入TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/) 數(shù)據(jù)庫(kù)[8]，使用Gene 模塊及Correlation 模塊分析在甲狀腺癌中SPON2 mRNA 表達(dá)和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志物之間的關(guān)系。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)，GraphPad 8 軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖，Kaplan-Meier 法檢驗(yàn)比較組間生存率差異，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及連續(xù)校正卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTC中SPON2 mRNA表達(dá)水平

qPCR結(jié)果見圖1，顯示PTC組織中SPON2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平為1.705±0.724，明顯高于癌旁組織的0.929±0.278，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.698，P=0.036)。

圖1 SPON2 mRNA在PTC及其癌旁組織中表達(dá)的差異

2.2 PTC中SPON2蛋白的表達(dá)與定位

免疫組化檢測(cè)結(jié)果見圖2，SPON2 蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)。68例PTC癌組織中，SPON2陽性表達(dá)率為82.35%(56/68)；在配對(duì)的PTC 癌旁組織中，SPON2 陽 性 表 達(dá) 率 為 19.12%(13/68)。SPON2 蛋 白在PTC 組織中的表達(dá)顯著高于相應(yīng)癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 SPON2蛋白在PTC組織及其癌旁組織中的表達(dá)(×200)

2.3 SPON2與甲狀腺癌臨床病理特征的關(guān)系

免疫組化分析結(jié)果見表1，SPON2 蛋白表達(dá)水平與PTC患者年齡、腫瘤最大直徑、病灶數(shù)、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)(P>0.05)。但在GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中(圖3)，SPON2 mRNA 表達(dá)水平與甲狀腺臨床分期相關(guān)，III~IV 期SPON2 mRNA 表達(dá)水平明顯高于I~II 期，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。

圖3 SPON2 mRNA 在GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中不同甲狀腺癌臨床分期中的表達(dá)水平

表1 68例甲狀腺癌患者SPON2蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.4 SPON2 mRNA表達(dá)與甲狀腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan Meier-Plotter 在線平臺(tái)分析結(jié)果見圖4，在數(shù)據(jù)庫(kù)502個(gè)甲狀腺癌病例中，SPON2 mRNA 高表達(dá)患者較低表達(dá)患者的預(yù)后更差，OS更短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。

圖4 Kaplan Meier-Plotter 分析SPON2 mRNA差異表達(dá)與甲狀腺癌預(yù)后的關(guān)系

2.5 SPON2 mRNA表達(dá)與甲狀腺癌中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析在甲狀腺癌中SPON2 mRNA 表達(dá)與免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，結(jié)果見圖5，SPON2 mRNA 表達(dá)與腫瘤純度(tumor purity)無明顯相關(guān)性(P=0.135)，而與 B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)(均為P<0.01)；與 CD68、CD163、CD206 呈正相關(guān)(均為P<0.01)。

圖5 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中SPON2 mRNA與甲狀腺癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

3 討論

腫瘤的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移涉及諸多因素，其中腫瘤微環(huán)境發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤微環(huán)境中的重要構(gòu)成部分，通過細(xì)胞外基質(zhì)，腫瘤細(xì)胞可以加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，并能通過重構(gòu)后的細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[9]。

SPON2 作為一種細(xì)胞外基質(zhì)，參與先天免疫反應(yīng)[10]，SPON2 具有招募炎癥細(xì)胞、激活固有免疫應(yīng)答等多種功能[11-12]。近年來，SPON2 與腫瘤相關(guān)性研究逐漸增多。研究表明，SPON2 蛋白在肺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，有望成為癌癥新的治療靶點(diǎn)[13-15]。SPON2 能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[12]；沉默SPON2 能夠降低小鼠胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力，而過表達(dá)SPON2可加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力[16]；SPON2 在胃癌中高表達(dá)，是患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素[17]。敲除SPON2基因能夠抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[18]。上述這些研究提示SPON2可能與腫瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)。

本研究通過免疫組化和qPCR 方法檢測(cè)甲狀腺癌中最常見病理類型PTC癌組織及癌旁組織中SPON2的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPON2在PTC癌組織中表達(dá)顯著升高。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，SPON2 mRNA表達(dá)差異與甲狀腺臨床分期相關(guān)，分期越高其表達(dá)水平越高，表明SPON2在甲狀腺癌的進(jìn)展中可能扮演著重要的角色。利用Kaplan Meier-Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)502例甲狀腺癌樣本分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)SPON2 mRNA的甲狀腺癌患者預(yù)后差于低表達(dá)患者，SPON2 mRNA高表達(dá)是甲狀腺癌患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步通過TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析在甲狀腺癌中SPON2 mRNA 表達(dá)與免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，SPON2在甲狀腺癌中與B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)；與CD68、CD163、CD206 呈正相關(guān)。而 CD68 是巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD163、CD206則為M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)志物[19-21]。

腫瘤組織由癌細(xì)胞、血管、免疫細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及信號(hào)分子等成分組成[22-23]。免疫細(xì)胞中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，可分為M1 型和M2 型，M1 型巨噬細(xì)胞能抑制及殺滅癌細(xì)胞；而M2 型巨噬細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子，可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[24]。研究表明，SPON2 在結(jié)直腸癌中促進(jìn)M2 極化的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和癌癥進(jìn)展[25]。侯飛等[26]報(bào)道，M2巨噬細(xì)胞在甲狀腺癌的發(fā)生與發(fā)展中起促進(jìn)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，SPON2 在甲狀腺癌中與M2 巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物呈正相關(guān)，表明SPON2 可能通過M2 巨噬細(xì)胞促進(jìn)甲狀腺癌進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞可以降低自身抗原性，以逃避特異性T 細(xì)胞的清除，腫瘤細(xì)胞可下調(diào)腫瘤抗原的表達(dá)，從而逃脫免疫細(xì)胞的殺傷[27]。而腫瘤組織周圍浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞能釋放促炎性細(xì)胞因子及趨化因子，以加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力[28]。甲狀腺癌SPON2高表達(dá)患者腫瘤中除巨噬細(xì)胞外，其他免疫細(xì)胞也隨SPON2表達(dá)升高而增多，表明SPON2可能也通過除巨噬細(xì)胞外的其他免疫細(xì)胞在甲狀腺腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮了作用。而甲狀腺癌中SPON2與其他免疫浸潤(rùn)細(xì)胞之間的關(guān)系鮮見報(bào)道，有待進(jìn)一步深入研究探索。

綜上所述，SPON2 在PTC 癌組織中高表達(dá)，SPON2 蛋白可能成為臨床甲狀腺癌診斷新的標(biāo)志物，并對(duì)評(píng)判腫瘤臨床分期、預(yù)后具有重要意義，是一種甲狀腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。SPON2 在甲狀腺癌中與M2 巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物正相關(guān)，表明SPON2 可能通過M2 巨噬細(xì)胞促進(jìn)甲狀腺癌進(jìn)展。SPON2 還可能通過B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮作用，為SPON2在腫瘤中的研究提供了新的方向。