由笑穎, 楊海亮, 劉軒赫, 鄭海玲, 周 旸,

(1.浙江理工大學(xué) 紡織科學(xué)與工程學(xué)院(國際絲綢學(xué)院),杭州 310018; 2.中國絲綢博物館,杭州 310002)

皮革是皮質(zhì)文物的主要部分。皮革是經(jīng)脫毛和鞣制等物理、化學(xué)加工工序所得到的不易腐爛的動物皮[1]。人類早在遠(yuǎn)古時期就開始對皮革進(jìn)行開發(fā)利用,皮革制品廣泛應(yīng)用于人類生活、生產(chǎn)中。皮革的使用在中國有著悠久的歷史,主要應(yīng)用于生產(chǎn)生活、軍事文化和宗教祭祀等方面[2]。中國各地考古發(fā)掘工作出土的皮質(zhì)文物種類繁多,諸如帳篷、皮服、皮鞋、皮手套、皮囊、皮甲胄、皮盾牌等,極具地方特色[3]。早在春秋時期,齊國一部官書——《考工記》就記述了齊國關(guān)于手工業(yè)各個工種的設(shè)計規(guī)范和制造工藝[4]。早年湖北隨縣擂鼓墩一號墓出土的大量戰(zhàn)國初年的皮甲胄,是研究當(dāng)時最新科技成果及最高工藝水平的典型代表[5]。而國外皮質(zhì)文物主要包括羊皮紙、羊皮書和羊皮卷等,羊皮紙曾一度成為希臘和拉丁國家及整個近東和中東地區(qū)的首選書寫材料,直到公元13世紀(jì),羊皮紙仍然是歐洲拜占庭和斯拉夫地區(qū)的優(yōu)秀寫作材料[6-7]。這些珍貴的皮質(zhì)文物是人類在認(rèn)識和改造自然過程中留下的寶貴財富,記載著人類歷史的發(fā)展,見證了社會文明的進(jìn)步,它們對于研究古代皮革制作工藝、歷史自然環(huán)境、文化發(fā)展水平有著重要意義。

由于皮革是一種天然高分子材料,出土文物往往會受到埋藏環(huán)境的影響,膠原蛋白分解形成不同程度的糟朽降解,使得一些常規(guī)檢測分析方法如表面分析、光譜分析、波譜分析、色譜分析、熱分析等難以進(jìn)行物種鑒別,或者檢測鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確[8]。如文物皮革由于內(nèi)部水分和脂質(zhì)大量流失,膠原纖維嚴(yán)重變形,顆粒層毛孔消失,難以使用表面顯微鏡觀察進(jìn)行鑒別;紅外光譜表征缺乏特異性,難以可靠鑒定同類型材質(zhì)[9],且對于皮質(zhì)文物來說,只能表征皮革一級構(gòu)象,材質(zhì)如果老化嚴(yán)重,紅外吸收的強(qiáng)度會大幅減弱,導(dǎo)致影響檢測結(jié)果。也有其他技術(shù)方法應(yīng)用于蛋白類文物的物種鑒別,如使用DNA分析方法鑒別紡織品中的動物毛纖維物種來源[10],但由于皮質(zhì)文物經(jīng)歷降解老化后DNA極度脆弱,可提取的內(nèi)源性DNA降低到檢測水平以下,導(dǎo)致此法難以實行。相比較而言,皮質(zhì)文物中的膠原蛋白降解比DNA緩慢得多,膠原蛋白的主要結(jié)構(gòu)保存得更為穩(wěn)定,而蛋白質(zhì)組學(xué)分析作為一種新興檢測方法,具有靈敏度高,特異性強(qiáng)的特點(diǎn),能更加精準(zhǔn)有效地對皮質(zhì)文物進(jìn)行檢測鑒別[11-12]。本文從蛋白質(zhì)組學(xué)理論基礎(chǔ)出發(fā),對古代皮質(zhì)文物的物種鑒別方面的方法做總結(jié),以期為同行提供參考。

1 皮質(zhì)文物的結(jié)構(gòu)組成

皮質(zhì)文物的主要部分是皮革,皮革是由生皮經(jīng)過不同的鞣制方法加工而成[13]。生皮由毛層和皮層組成,皮層包括表皮層、真皮層和皮下組織。在制革過程中,由于表皮層和皮下組織會阻礙處理劑向真皮層滲透,通常在加工前將表皮層和皮下組織去除。因此,真皮層是皮革的主體。

真皮層的主要結(jié)構(gòu)是膠原纖維,膠原纖維的成分是膠原蛋白,動物皮中的膠原蛋白以Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白為主,組成這些膠原蛋白的元素有C、H、O、N、S。微觀上,構(gòu)成膠原蛋白的多肽鏈以“Gly-X-Y”結(jié)構(gòu)形式的重復(fù)排列為特征,其中甘氨酸含量最高,幾乎占了整個膠原蛋白氨基酸含量的1/3,且通常X為脯氨酸(Pro),Y為羥脯氨酸(Hyp),這兩種氨基酸是膠原蛋白的特征氨基酸[14-15]。如圖1所示,膠原蛋白由2條α1鏈和1條α2鏈組成三股螺旋結(jié)構(gòu)[16],肽鏈之間形成氫鍵,氫鍵是維持膠原分子三股螺旋結(jié)構(gòu)的主要作用力[17],這樣的結(jié)構(gòu)使得膠原蛋白具有很強(qiáng)的拉伸性能[18]。而后單根膠原纖維側(cè)向聚集形成纖維束,纖維束縱橫交織,形成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),使皮革具有優(yōu)良的強(qiáng)度和延展性。

圖1 膠原纖維結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of collagen fibers

但是,古代皮質(zhì)文物存放至今,包括經(jīng)由鞣制處理的皮革和未經(jīng)鞣制的羊皮紙等,由于受到不穩(wěn)定的儲存環(huán)境的影響,皮質(zhì)早已發(fā)生劣化,如圖2所示。皮革中的水分和脂質(zhì)流失,膠原蛋白發(fā)生氧化和水解,分子鏈間的氫鍵受到破壞,分子的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞,膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)變,膠原纖維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)難以維持,表現(xiàn)在外觀上則是表面顏色發(fā)黑,手感變硬,皮革也變得易脆易裂易損壞。正是這些微觀、宏觀上的變化,導(dǎo)致使用傳統(tǒng)方法對古代皮質(zhì)文物進(jìn)行物種鑒別變得十分困難,而事實上,在21世紀(jì)初蛋白質(zhì)組學(xué)就首次應(yīng)用于考古動物纖維,自從將蛋白質(zhì)組學(xué)引入考古和文化遺產(chǎn)研究以來,蛋白質(zhì)組學(xué)分析對越來越多的古代基質(zhì)和材料進(jìn)行了更好的表征[19],特別是在鑒定其起源物種方面。

圖2 劣化的皮質(zhì)文物Fig.2 Deteriorated cortical cultural relics

2 皮質(zhì)文物蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

正如DNA一樣,蛋白質(zhì)具有龐大的信息庫,攜帶著生命活動的重要信息。1995年Wasinger等首次提出“蛋白質(zhì)組”的概念,蛋白質(zhì)組是指由一個基因組,或一個細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)是一門研究蛋白質(zhì)的科學(xué),包括蛋白質(zhì)的識別、量化和蛋白質(zhì)的修飾研究[20],蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容主要包括兩個方面,即蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和蛋白質(zhì)的功能模式[21]。蛋白質(zhì)表達(dá)模式研究是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)內(nèi)容,包括蛋白質(zhì)氨基酸序列分析、空間結(jié)構(gòu)的解析及特定條件下某一材料細(xì)胞或組織中所有蛋白質(zhì)的表征問題。近年來,針對古代蛋白質(zhì)檢測提出了“古蛋白質(zhì)組學(xué)(Pale-proteomics)”的概念[22],與其他蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域相比,古蛋白質(zhì)組學(xué)面臨著樣品珍貴量少、樣品劣化分解等挑戰(zhàn)。同時蛋白質(zhì)組學(xué)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn),在古代皮質(zhì)文物物種來源鑒別上十分有優(yōu)勢。蛋白質(zhì)組學(xué)主要的檢測過程分為三部分:蛋白質(zhì)組的提取和分離、生物質(zhì)譜檢測及蛋白數(shù)據(jù)庫對比與分析。

2.1 皮質(zhì)文物蛋白質(zhì)組的微量提取方法

蛋白質(zhì)本身具有高度的生物特征性,不同生物、組織所具有的蛋白質(zhì)組具有明顯差異,皮質(zhì)文物中的膠原蛋白即便是經(jīng)過數(shù)千年的埋藏、糟朽,其降解后的肽鏈片段、小分子仍具有特異性,是作為生物物種檢測鑒定的重要依據(jù)。從試驗待測樣品中提取蛋白質(zhì)是進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析的先決條件,膠原蛋白提取的效率與純度會對后續(xù)的檢測鑒定產(chǎn)生重大影響。因此,使用蛋白質(zhì)組學(xué)對皮質(zhì)文物進(jìn)行物種鑒定,首先的步驟就是從皮質(zhì)文物中進(jìn)行膠原蛋白的提取。目前常見的膠原蛋白提取方法包括酸提取法[23]、堿提取法[24]、鹽提取法[25]、酶提取法[26]和復(fù)合提取法[27],都是針對現(xiàn)代皮革廢料再利用及明膠工業(yè)生產(chǎn),并不適合珍貴稀少的古代樣品。從皮質(zhì)文物中提取膠原蛋白需要開發(fā)一種小樣本量的分析方法,目前,一些國外的研究已經(jīng)研發(fā)了微損甚至無損地從古代文物中獲取蛋白質(zhì)的方式,表1對主要方法進(jìn)行了總結(jié)歸納。

表1 微損/無損的膠原蛋白提取方法Tab.1 Micro/non-destructive collagen extraction methods

2.1.1 微損研磨法

微損研磨法相對而言操作比較簡便,是對皮革文物損傷較小的膠原蛋白提取方法,Kumazawa等[28]將傳統(tǒng)堿提取法與研磨法對比,使用銼刀從鱷魚皮表帶邊緣削銼100 μg粉末使用0.5 μg胰蛋白酶水解,提取的蛋白質(zhì)成功進(jìn)行了表征,這說明樣品的微量提取對試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性并沒有產(chǎn)生影響。其實早前Caroline等[29]就研發(fā)了一種較為成熟的專用于微量提取樣品中蛋白質(zhì)的商業(yè)試劑盒,使用一次性合成樹脂充分研磨樣品的1%三氟乙酸酸化水溶液,再輔助使用超聲裝置來提取蛋白質(zhì),這種合成樹脂十分精細(xì),可將樣品損失降到最低。這種通過研磨從皮質(zhì)文物中獲得蛋白質(zhì)的方法,適合對各類皮革文物進(jìn)行膠原蛋白的提取。

2.1.2 功能化薄膜黏附法

功能化薄膜黏附法指的是一種使用功能化薄膜無損地從樣品表面吸附蛋白質(zhì)的方法,該方法以乙酸乙酯(EVA)作為AG501混合強(qiáng)陽離子/陰離子交換樹脂和C8樹脂混合顆粒的黏合劑,而后將熔融態(tài)的EVA、樹脂混合物以薄膜形式擠出,使用超純水對薄膜進(jìn)行潤濕后便可接觸樣品表面進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。D’Amato等[30]使用這種方法從包括羊皮紙在內(nèi)的多種材質(zhì)的書籍表面吸附提取蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析。Barberis等[31]也使用這種方法從巴黎制造廠(公元14世紀(jì)初)的稀有涂漆皮革棺材樣品和托斯卡納木制圣物箱中成功識別出黏合劑。這種方法對皮質(zhì)文物的損傷幾不可查,但由于它依靠從皮革表面黏附蛋白質(zhì),一般較為適合保存較為完好的羊皮紙、皮革制品或者繪畫涂層下的動物膠黏合劑。

2.1.3 靜電摩擦吸附法

靜電摩擦吸附法原理是利用PVC橡皮擦在皮革表面摩擦產(chǎn)生的靜電對皮革表層蛋白質(zhì)可產(chǎn)生靜電吸附,從而完成從基材表面吸附提取蛋白質(zhì)。用固相PVC聚合物上的靜電分子萃取,蛋白質(zhì)在室溫下即可保存在PVC聚合物廢料上,無需進(jìn)一步儲存。該方法對皮革文物是無損傷的,且取樣方便、成本低,不需要專業(yè)設(shè)備或存儲、無需人工制品即可采集樣本。Fiddyment等[32]首次使用這種方法對72本袖珍圣經(jīng)的羊皮紙進(jìn)行取樣檢測分析。但這種方法主要可以吸附的是皮革文物表面上的蛋白質(zhì),因此比較適用于羊皮紙類的文物進(jìn)行取樣。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)物種鑒定檢測方法

目前,蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定方法主要包括基于質(zhì)譜的肽質(zhì)量指紋圖譜分析和串聯(lián)質(zhì)譜肽測序[33],檢測流程如圖3所示。

圖3 質(zhì)譜檢測流程示意Fig.3 Schematic diagram of mass spectrometry detection process

2.2.1 肽質(zhì)量指紋圖譜分析

肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting,PMF)是一種簡單、快速且相對有效的鑒定蛋白質(zhì)組成的方法?；谫|(zhì)譜的動物考古學(xué)ZooMS(Zooarchaeology by Mass Spectrometry)作為PMF的一種重要形式,目前已廣泛用于膠原蛋白材料(皮革、羊皮紙、象牙等)的識別鑒定[34]。將從復(fù)雜樣品中提取出的膠原蛋白質(zhì)組使用胰蛋白酶水解消化,使之水解成一系列肽段,這些肽段具有唯一性,再利用質(zhì)譜測定所有肽段的質(zhì)量,產(chǎn)生的質(zhì)譜圖是離子相對豐度隨m/z值變化的曲線圖,收集數(shù)據(jù)形成膠原蛋白質(zhì)組的肽質(zhì)量指紋[35]。當(dāng)使用肽質(zhì)量指紋圖譜進(jìn)行皮革文物物種鑒定的時候,需要將未知樣品的圖譜與肽質(zhì)量圖譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比匹配,標(biāo)定特異性序列從而完成鑒別。

Buckley等[36]利用膠原蛋白-肽質(zhì)量指紋圖譜方法,通過使用胰蛋白酶提取骨骼、牙齒等部位的膠原蛋白進(jìn)行分析檢測,對土耳其東南部多穆茲特佩新石器時代遺址的111個動物遺骸成功進(jìn)行了分類鑒定,這為從皮質(zhì)文物中提取膠原蛋白進(jìn)行物種鑒別提供了方法。他們在此之前通過與標(biāo)準(zhǔn)樣品制備C18柱的相互作用,曾成功重復(fù)分離出能對綿羊和山羊膠原蛋白進(jìn)行區(qū)分的單個膠原蛋白肽[37]。而在此次試驗中,他們采用了一種更為簡單的替代方法,使用固相萃取(SPE)C18移液管尖端分離肽,分離程度雖然低于之前使用的方法,但可以產(chǎn)生更多分類群的肽標(biāo)記物,從而做到不僅可以區(qū)分綿羊和山羊,還可以區(qū)分包括人類在內(nèi)的許多其他分類群。Yuki等[38]利用蛋白質(zhì)組學(xué),通過LC-MS法在多反應(yīng)監(jiān)測模式下監(jiān)測6種I型膠原胰肽段,以是否存在標(biāo)記肽的模式對6種動物(牛、馬、豬、羊、山羊和鹿)皮革成功進(jìn)行了動物源識別。

2.2.2 串聯(lián)質(zhì)譜肽測序

相對于肽質(zhì)量指紋圖譜這種簡便快速的鑒別方法而言,膠原蛋白的識別取決于對分離出的肽相對分子質(zhì)量的準(zhǔn)確測量,而實際上有的肽段本身或在質(zhì)譜儀的測量過程中有可能是殘缺的、碎片化的?；诖?lián)質(zhì)譜的肽測序方法除了可以對肽段的確切氨基酸序列進(jìn)行定性,還可以通過對樣品中肽段碎片化產(chǎn)生的片段離子進(jìn)行進(jìn)一步修飾而獲得氨基酸序列[39]。與PMF制備樣品的過程相似,MS/MS只是在分析工作流程上有所不同。

作為對蛋白質(zhì)類文物物種準(zhǔn)確鑒別的補(bǔ)充手段,Chambery等[40]開發(fā)了一種基于LC-ESI/Q-q-TOF串聯(lián)質(zhì)譜法的改進(jìn)程序,用于鑒定蛋白質(zhì)黏合劑的生物學(xué)來源。使用TPCK處理的胰蛋白酶溶液對還原和烷基化的混合物進(jìn)行酶水解,然后將混合物在37 ℃下孵育過夜消化。使用配備電噴霧電離源的四極桿飛行時間(ESI-Q-q-TOF)質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析,在Q-TOF質(zhì)譜儀上獲取電噴霧質(zhì)譜和串聯(lián)MS/MS數(shù)據(jù)。對MS/MS試驗進(jìn)行數(shù)據(jù)導(dǎo)向分析,并對照Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫搜索處理的MS/MS光譜以進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。試驗識別出3種蛋清蛋白,此外,在樣品中還鑒定出了α S1和β酪蛋白肽,且串聯(lián)質(zhì)譜法能夠很好地區(qū)分綿羊和山羊α酪蛋白。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在皮質(zhì)文物上的應(yīng)用

3.1 羊皮紙

兩千多年以來,羊皮紙一直是西方常用的書寫材料。羊皮紙是由一些常見的動物皮(綿羊皮、山羊皮和牛皮)不經(jīng)鞣制只進(jìn)行物理機(jī)械加工制得的。過去對于這些羊皮紙的材質(zhì)鑒別依賴于利用觀察觸摸及參考當(dāng)時當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)動物的方法進(jìn)行判斷,而使用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法從根本上解決了這一問題。

Toniolo等[41]使用蛋白質(zhì)組學(xué)檢測了一本拉丁語圣經(jīng)副本書頁的物種來源,這本圣經(jīng)有“馬可波羅的圣經(jīng)”之稱,它是歷史上唯一一本經(jīng)絲綢之路輾轉(zhuǎn)在中國停留400余年,最終安全返回歐洲的圣經(jīng)。由于圣經(jīng)的紙張非常薄,每張厚度僅有80 μm,因此當(dāng)時中世紀(jì)歷史文學(xué)家聲稱,這本圣經(jīng)使用的羊皮紙是由小羔羊皮制作而成的。而實驗室利用nLC/ESI/LTQ MS/MS檢測紙張邊緣獲得的胰蛋白酶消化肽,在NCBInr數(shù)據(jù)庫中搜索,分析得出其中產(chǎn)生的8種特征蛋白均屬于黃牛屬種,雖然片段中未能找到最為關(guān)鍵的可直接斷定種屬的PEGQESTTDQETT(綿羊)、PEGQESPTDQETT(牛)的特異性肽序列,但也足以說明這本圣經(jīng)的羊皮紙實際是從小牛身上獲得的。

袖珍圣經(jīng)是公元13世紀(jì)《巴黎圣經(jīng)》中最重要的子群之一,因其體積足夠小,便于運(yùn)輸廣受歡迎,超細(xì)的羊皮紙是這種圣經(jīng)最常用的制作材料。Fiddyment等[32]使用無損肽質(zhì)量指紋方法分析了72本袖珍圣經(jīng)的皮質(zhì)來源,共分析了220對開本。在這些對開本中,68%羊皮紙來源是小牛,26%是山羊,6%是綿羊。這項研究首次報告了利用摩擦電無損提取蛋白質(zhì),且從PVC取樣中獲得的蛋白質(zhì)與使用實際羊皮紙碎片中的相同。Doherty等[42]對公元16—20世紀(jì)645個由羊皮紙制成的法律契約書進(jìn)行物種鑒定,通過ZooMS確定其中622個羊皮紙物種來源為綿羊,剩下23個樣本由于缺乏診斷肽無法確定究竟來源于綿羊或山羊,結(jié)合當(dāng)?shù)貧v史文獻(xiàn)可基本認(rèn)為當(dāng)時絕大多數(shù)法律契約書的羊皮紙由綿羊皮制成。Kirby等[43]使用PMF識別文物材料中的膠原蛋白。他們借鑒Buckley通過肽標(biāo)記物鑒別膠原蛋白的方法,以此為基礎(chǔ),從阿拉斯加歷史皮劃艇和《古蘭經(jīng)》羊皮紙的樣本中分離出肽標(biāo)記物,并結(jié)合光譜分析,對文物軟組織中的膠原蛋白進(jìn)行識別。蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定證實超細(xì)羊皮紙不一定像以前假設(shè)的那樣由新生或薄皮動物(兔子、松鼠)制得,它們可以通過從幾個不同物種的成熟動物皮中獲得。

3.2 皮革服飾

公元19世紀(jì)以來,人們一直嘗試鑒別所發(fā)現(xiàn)的古代皮革服飾的物種來源,確認(rèn)皮革的物種來源,對于研究古代畜牧業(yè)的起源發(fā)展及相關(guān)制造行業(yè)有重大意義。但古代皮革服飾受惡劣埋藏環(huán)境的影響往往難以妥善保存,且經(jīng)過鞣制的皮革更加難以辨認(rèn)物種,有時其物種的識別還依賴于對皮革上毛發(fā)的形態(tài)學(xué)特征鑒別,但是這些毛發(fā)發(fā)生降解后,形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使得鑒別難以施行[44]。目前,使用基于高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)方法對皮革服飾進(jìn)行物種鑒定成為一種可靠的方式。

對皮革衣飾的研究可以揭示有關(guān)人類歷史的重要特征。1991年在阿爾卑斯山的冰層中發(fā)現(xiàn)了一具新石器時代的木乃伊Oetzi,由于溫度極低,他的身體和衣服都保存得十分完好。Hollemeyer等[45]使用PMF的方法對Oetzi的外套,褲子和鞋進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。收集來自古代樣本和參考物種的PMF,參考物種主要選自阿爾卑斯山周圍,可以相互比較避免誤差。經(jīng)檢測得出,Oetzi的綁腿中來自犬科動物物種,鞋面皮革來自馬鹿,綁腿是由山羊皮制成,鞋底和箭袋的閉合襟翼由牛皮制成,外套則是由綿羊皮和羚羊皮制成。

丹麥在泥炭沼澤中發(fā)現(xiàn)了一批保存完好的公元前920年至公元前775年的古代皮革服裝,Brandt等[46]使用基于質(zhì)譜(MS)的肽測序方法將12個考古皮革樣品進(jìn)行分析匹配,與肽質(zhì)量指紋圖譜的方法不同,肽測序方法旨在識別完整提取的古代蛋白質(zhì)組,無需提前選擇特定的參比對照物。得到的質(zhì)譜圖在nrNCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索,所有的匹配結(jié)果再根據(jù)皮革的特性,如地理來源等進(jìn)行物種最終確定。由于山羊和綿羊的蛋白質(zhì)組十分相近,以往的檢測難以精確區(qū)別這兩個物種,此次試驗還檢測到了文獻(xiàn)中提及的稀有的用于區(qū)別山羊和綿羊的特異性肽,如圖4[46]所示。最終結(jié)果顯示,有兩個皮革樣本來源為牛,六個樣本來源為綿羊,三個來源為山羊。同時,試驗還將基于MS的肽測序方法與顯微鏡觀察法進(jìn)行比較,更加說明了蛋白質(zhì)組學(xué)的可靠性。

圖4 Ⅰ型膠原α2(COL1A2)綿羊/山羊診斷肽的串聯(lián)MS譜Fig.4 Tandem MS spectra of identification of the type Ⅰ alpha-2 collagen (COL1A2) sheep/goat diagnostic peptide

3.3 動物膠黏合劑

天然黏合劑早在舊石器時代就已經(jīng)開始使用,隨著社會生產(chǎn)力的發(fā)展,黏合劑的使用解決了生產(chǎn)由不同材料組成物體的問題,克服了單一組分生產(chǎn)的技術(shù)限制,是生產(chǎn)制造水平的一個重要突破[47]。古代常用的黏合劑主要包括動物膠、蛋清蛋黃、酪蛋白、樹膠樹脂、瀝青、焦油、淀粉等。其中動物膠黏合劑是古時常用的黏合劑,主要通過煮沸動物皮或魚皮獲得,膠原蛋白高溫水解轉(zhuǎn)化為明膠[48]。最常見的分析黏合劑的方法是與質(zhì)譜儀聯(lián)用的色譜法[49],但是這種方法對于鑒定蛋白質(zhì)類黏合劑仍然較為困難,而基于高分辨率的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定方法具有高靈敏度和高準(zhǔn)確性,利用較少的樣品量便可以確定黏合劑的物種來源。

2009年,在瑞士新石器時代(約公元前4 000年)遺址發(fā)現(xiàn)了一把表面裝飾有樹皮條的弓,這把弓包裹在形成厭氧條件的沉積物中,得以保存完好。為了確定樹皮條的固定材料是獸膠還是魚膠,Bleicher等[50]利用基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的古代蛋白質(zhì)組學(xué)測序方法檢測可能殘留的蛋白痕跡,他們將采集的樹皮條下的小木片作為試驗樣品,清洗去除雜質(zhì)后用HCl溫和水解提取蛋白質(zhì),再使用測序級胰蛋白酶將蛋白質(zhì)水解成肽片段,將獲得的胰蛋白酶肽固定在C18級尖端上,最后通過在線納米流反相C18液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析肽混合物。根據(jù)所得的MS/MS圖譜確定氨基酸序列為SGETGASGPGFVGEK,從而確定此序列物種來源為牛。最終結(jié)果表明,有4/5的序列檢測為膠原蛋白,且主要為Ⅲ型膠原蛋白,最有可能的來源物種為牛和當(dāng)?shù)匚锓NOvicaprids。同時,古代蛋白質(zhì)測序表明,早在公元前4 000年,當(dāng)?shù)厝司涂梢允褂煤唵蔚幕瘜W(xué)方法提取生產(chǎn)動物皮黏合劑,這是第一次利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法溯源史前環(huán)境中的生產(chǎn)活動。

小河墓地位于中國西北部塔克拉瑪干沙漠孔雀河以南約60 km處,該地區(qū)氣候干燥,為蛋白質(zhì)類有機(jī)物的保存提供了有利條件。該墓地出土了許多木杖,木杖頂部的正面開了兩個槽,用于鑲嵌兩個骨雕塑,背面粘貼羽毛[51]。由于骨雕脫落露出了木杖上的淡黃色黏合劑,Rao等[52]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)確定黏合劑的物種來源。取10 mg的黏合劑樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)提取,將上清液加載到凝膠上進(jìn)行凝膠電泳,使用胰蛋白酶進(jìn)行凝膠內(nèi)消化水解,將提取的溶液真空干燥并冷凍保存,以便通過LC-MS/MS進(jìn)一步鑒定。在NCBInr數(shù)據(jù)庫搜索對比,結(jié)果如表2所示,黏合劑的主要蛋白質(zhì)為牛膠原α1(Ⅰ)鏈前體和α2(Ⅰ)鏈前體,且所識別的Ⅰ型膠原α1中的GPPGSAGSPGKGLNGLPGPIGPPGPR(位置1141-1167)和α2中的IGQPGAVGPAGIR(位置1066-1078)序列為牛的特異性肽,證實了此黏合劑為動物膠,物種來源為牛。這是迄今為止在中國發(fā)現(xiàn)的最古老的動物膠黏合劑。

表2 小河墓地出土黏合劑中鑒定出的牛特異性肽Tab.2 Bovine specific peptides identified from adhesives in Xiaohe Cemetery

3.4 膜金屬線

在中世紀(jì)時期,膜金屬線是歐洲紡織品中使用最多的裝飾金屬線。大多數(shù)膜金屬線以動物皮革或者膜組織作為基底,然后鍍以金屬或使用黏合劑黏附上金屬制得。它們因靈活輕便且價格低廉,一度成為西亞紡織品上最常見的金屬線[53]。識別金屬線中的膜基底對中世紀(jì)膜金屬線的起源、生產(chǎn)技術(shù)和使用價值有重大意義,但紡織品經(jīng)年劣化對金屬線基底的物種鑒別帶來困難,形態(tài)學(xué)方法幾乎無法鑒別,DNA擴(kuò)增技術(shù)由于數(shù)據(jù)庫的局限只能識別少數(shù)的物種[54]。相比較而言,蛋白質(zhì)組學(xué)在金屬線基底物種鑒別方面有無可比擬的優(yōu)越性。

Popowich等[55]使用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對公元14世紀(jì)意大利紡織品上的膜金屬線進(jìn)行基底的物種鑒別。為了測試蛋白質(zhì)組學(xué)對古代樣品的適用性,維也納應(yīng)用藝術(shù)大學(xué)(奧地利)還從豬腹膜和牛腸中制備了兩個系列參比標(biāo)準(zhǔn)品,分別提取蛋白質(zhì),并使用納米LC-Orbitrap-MS/MS法進(jìn)行分析,檢測到Ⅰ型膠原α1(COL1A1)、Ⅰ型膠原α2(COL1A2)豐度最高,其次是Ⅲ型膠原α1(COL3A1)。對古代樣品進(jìn)行檢測,與公開序列的UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配,分離鑒定出特異性膠原肽,其中檢測出的來自牛的COL1A1、COL1A2和COL3A1肽數(shù)量最多(分別為45、42和38個肽),最終確定線是由牛的腸或胃膜制成。同樣的,Cheung等[56]通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法測試了20世紀(jì)初6頂中國傳統(tǒng)兒童帽的11個金屬線樣品,鑒定顯示金屬線基底為綿羊皮或山羊皮,同時還檢測出將金屬黏到羊皮基底上的動物膠為魚皮膠。

4 結(jié) 論

利用蛋白質(zhì)組學(xué)對國內(nèi)外皮質(zhì)文物進(jìn)行檢測鑒定主要分為三個流程:從皮質(zhì)文物中提取膠原蛋白,利用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對膠原蛋白進(jìn)行定性或定量檢測分析,將獲得的肽在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行對比匹配以獲得肽段序列等相關(guān)信息。目前,已經(jīng)有一些較為成熟的從皮質(zhì)文物中無損或微損地提取膠原蛋白的方法,如研磨法、功能化薄膜黏附法、靜電摩擦法,能在確保試驗結(jié)果準(zhǔn)確的前提下,盡可能地降低對皮質(zhì)文物的損壞。基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組檢測方法主要有肽質(zhì)量指紋圖譜法和串聯(lián)質(zhì)譜肽測序法,兩者各有長短,前者更為簡便,后者更為精確。皮質(zhì)文物按照常見的用途分為四大類,分別是羊皮紙、皮革服飾、動物膠黏合劑和以皮革為基底的膜金屬線,這些皮質(zhì)文物難以使用傳統(tǒng)的觀察法進(jìn)行物種的準(zhǔn)確鑒別。而蛋白質(zhì)組學(xué)分析作為一種新興檢測方法,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),只需極少的樣品,便能準(zhǔn)確地對文物的物種來源進(jìn)行鑒別,有效解決物種鑒別困難這一難題,同時蛋白質(zhì)組學(xué)基于皮質(zhì)文物的精細(xì)鑒別,對溯源古代畜牧業(yè)及手工制造業(yè)的生產(chǎn)活動也有重大意義。

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