肖雪，王金浩，邵俊花，范江平，葛長(zhǎng)榮，肖智超*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南華衡檢測(cè)技術(shù)有限公司，云南 昆明 650201；4.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；5.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201）

根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國(guó)家統(tǒng)計(jì)局和中國(guó)畜牧業(yè)協(xié)會(huì)公布的數(shù)據(jù)，2020年我國(guó)的雞肉產(chǎn)量為1.65×107t，位居世界雞肉產(chǎn)量第二位[1]。雞肉味道鮮美，含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，包括蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)和維生素[2-3]。但目前一些雞肉，尤其是淘汰蛋雞肉存在價(jià)值不高、利用途徑少及產(chǎn)品價(jià)值較低等問(wèn)題。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，給畜禽產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展帶來(lái)了新的機(jī)遇，因而，雞肉加工產(chǎn)業(yè)的原料利用率和產(chǎn)品附加值得到提高。研究表明，采用酶水解法對(duì)雞肉進(jìn)行深加工，能大幅增加產(chǎn)品中小分子肽類和游離氨基酸等物質(zhì)的含量，這些物質(zhì)不僅具有多種功能特性，同時(shí)也改善了原料肉的風(fēng)味[4-5]。因此，利用生物酶解技術(shù)水解雞肉蛋白，對(duì)提高雞肉產(chǎn)品的風(fēng)味、附加價(jià)值和利用率有重要意義。

超聲波具有能量和波動(dòng)的雙重性質(zhì)，其機(jī)械和空化效應(yīng)可使細(xì)胞破裂，提高反應(yīng)效率，縮短反應(yīng)時(shí)間[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)超聲預(yù)處理，可以改變底物蛋白質(zhì)構(gòu)象，減少底物粒徑大小，使其比表面積增大，更易與蛋白酶發(fā)生酶促反應(yīng)，從而提高蛋白質(zhì)水解度[8]。鐘群[9]對(duì)超聲功率320 W條件下預(yù)處理后的烏骨雞肉蛋白進(jìn)行酶解，酶解液中小分子量肽的含量達(dá)44.64 mg/mL，酶解效果明顯優(yōu)于對(duì)照組。De Carvalho Silvello等[10]評(píng)估了超聲波處理對(duì)甘蔗渣酶解效果的影響，在最佳條件下，還原糖的濃度比對(duì)照組高89.37%。Lan等[11]利用超聲波技術(shù)輔助酶解豬皮蛋白，經(jīng)過(guò)工藝優(yōu)化，超聲輔助酶解豬皮蛋白的水解度提高了50%，水解時(shí)間縮短了3 h。

超聲波在反應(yīng)過(guò)程中可以產(chǎn)生較強(qiáng)的剪切力，對(duì)液體介質(zhì)中的大分子產(chǎn)生機(jī)械性斷鍵作用，從而促使更多親水基團(tuán)的暴露，有利于底物與酶的結(jié)合，提高蛋白質(zhì)的水解程度。目前，很少有研究將超聲波應(yīng)用于雞肉蛋白的酶促反應(yīng)中。因此本研究選用雞肉為研究對(duì)象，探究雞肉蛋白的最佳酶解工藝。采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，以水解度（degree of hydrolysis，DH）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，將超聲波技術(shù)應(yīng)用于酶解雞肉蛋白，探討不同超聲功率、蛋白酶的種類及不同工藝條件對(duì)雞肉蛋白酶解效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶花雞雞胸肉（150日齡母雞）：云南省昆明云嶺廣大種禽飼料有限公司。

復(fù)合蛋白酶（7×104U/g）、風(fēng)味蛋白酶（1×104U/g）、動(dòng)物蛋白水解專用酶（簡(jiǎn)稱動(dòng)物蛋白酶）（1×104U/g）、木瓜蛋白酶（2×104U/g）：河南圣斯德實(shí)業(yè)有限公司，以上蛋白酶均為食品級(jí)。

甘氨酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；D-果糖：上海源葉生物科技有限公司；水合茚三酮：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二水合磷酸氫二鈉、無(wú)水乙醇：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀：廣東光華科技股份有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；BS224S型電子天平：奧豪斯儀（常州）有限公司；XMTD-7000型數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；T-6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；H2-16KR型離心機(jī)：湖南可成儀器設(shè)備有限公司；WH-2微型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；SCQ-9201B型數(shù)控加熱超聲提取儀：上海聲彥超聲波儀器有限公司；KDN-04微量凱氏定氮儀：上海纖檢儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雞肉酶解液的制備工藝

雞肉去除結(jié)締組織和脂肪→攪碎成肉糜→勻漿→按一定比例加入去離子水超聲預(yù)處理（600 W，20 min）→加入蛋白酶酶解4 h→滅酶（100℃，10 min）→離心（4℃，7 000 r/min，15 min）→過(guò)濾取上清液（酶解液）備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 復(fù)配蛋白酶種類及超聲輔助酶法對(duì)雞肉蛋白水解度的影響

由于蛋白酶的作用位點(diǎn)不同，因此不同蛋白酶水解雞肉蛋白的產(chǎn)物和水解度有所差異[12]。本文結(jié)合前人研究及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將復(fù)合蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶4種單酶按質(zhì)量比1:1進(jìn)行兩兩復(fù)配，考察復(fù)配酶種類對(duì)水解度的影響?；A(chǔ)酶解工藝：雞肉樣品10.00 g，自然pH值，固液比1:3（g/mL），總加酶量0.20%，酶解溫度55℃、酶解時(shí)間4 h，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

在復(fù)配酶篩選的基礎(chǔ)上，先將雞肉樣品加入去離子水，并于600 W條件下超聲預(yù)處理20 min，再加入相應(yīng)的蛋白酶并置于55℃水浴鍋中酶解4 h，考察超聲輔助酶解對(duì)雞肉蛋白水解度的影響。

1.3.2.2 酶解條件對(duì)雞肉蛋白水解度的影響

參照肖作兵等[13]的單因素設(shè)計(jì)方法，在自然pH值條件下，以蛋白質(zhì)水解度為試驗(yàn)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)，探討超聲功率、加酶量、固液比、酶解時(shí)間、酶解溫度5個(gè)因素對(duì)雞肉蛋白質(zhì)水解效果的影響。酶解試驗(yàn)設(shè)以下水平：固定總加酶量0.20%，固液比1:3（g/mL），酶解溫度55℃、酶解時(shí)間4 h，考察不同超聲功率（200、400、600、800、1 000 W）對(duì)水解度的影響；固定超聲功率為600 W，固液比1:3（g/mL），酶解溫度55℃，酶解時(shí)間4 h，考察不同總加酶量（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）對(duì)水解度的影響；固定超聲功率為600 W，總加酶量0.20%，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間4h，考察不同固液比[1:1、1:2、1:3、1:4、1:5（g/mL）]對(duì)水解度的影響；固定超聲功率為600W，總加酶量0.20%，固液比 1:3（g/mL），酶解時(shí)間 4h，考察不同酶解溫度（45、50、55、60、65℃）對(duì)水解度的影響；固定超聲功率為600 W，總加酶量0.20%，固液比1:3（g/mL），酶解溫度55℃，考察不同酶解時(shí)間（2、3、4、5、6 h）對(duì)水解度的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert 6.0.8軟件，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，以固液比（A）、總加酶量（B）、酶解時(shí)間（C）及酶解溫度（D）4個(gè)因素的3個(gè)水平為變量，以水解度（Y）為響應(yīng)值，優(yōu)化雞肉蛋白酶解工藝[14]。因素水平如表1所示。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

1.3.4 雞肉蛋白水解度的測(cè)定方法

參考楊文博等[15]的方法，采用茚三酮顯色法測(cè)定雞肉蛋白的水解度。

1.3.4.1 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取0.10 g甘氨酸，定容到100 mL的容量瓶?jī)?nèi)，再?gòu)闹腥〕?.00 mL稀釋至100 mL，此時(shí)溶液的濃度為 20 μg/mL。 然后分別取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL于比色管中，加入茚三酮顯色劑，并在沸水浴中加熱15 min，快速冷卻后加入5.00 mL 40%的乙醇溶液并混合均勻，靜置15 min后，以零管為參比，在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以甘氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，結(jié)果得線性回歸方程Y=0.267 9X-0.001 1，R2=0.999 0。

1.3.4.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[16]對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4.3 水解度

由雞肉樣品溶液中甘氨酸的濃度折算成蛋白質(zhì)的DH，計(jì)算方法如下。

式中：A為雞肉酶解液樣品的吸光值；C為甘氨酸濃度，μg/mL；V為濾液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均做3組重復(fù)，采用Excel 2016、SPSS 19.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理及圖表制作。采用Design Expert 6.0.8進(jìn)行二次回歸方程模擬及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)配蛋白酶種類及超聲輔助酶法對(duì)雞肉蛋白水解度的影響

將復(fù)合蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶4種單酶按質(zhì)量比1:1進(jìn)行兩兩復(fù)配，考察復(fù)配酶種類對(duì)水解度的影響。同時(shí)，利用超聲輔助復(fù)配酶進(jìn)行酶解，探究超聲輔助酶法對(duì)水解度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)配酶及超聲輔助復(fù)配酶法對(duì)雞肉蛋白水解度的影響Fig.1 The effect of compound enzyme and ultrasonic-assisted compound enzyme method on the hydrolysis degree of chicken protein

如圖1所示，在相同酶解條件下，風(fēng)味-動(dòng)物復(fù)配酶效果最好，水解度可達(dá)31.15%，其余復(fù)配酶按水解度高低依次是風(fēng)味-復(fù)合復(fù)配酶30.32%、動(dòng)物-復(fù)合復(fù)配酶28.85%、木瓜-動(dòng)物復(fù)配酶27.20%、木瓜-風(fēng)味復(fù)配酶26.81%、木瓜-復(fù)合復(fù)配酶25.54%。

在相同酶解條件下，雞肉蛋白經(jīng)超聲預(yù)處理后，幾種復(fù)配酶的水解度均顯著提高，其中木瓜-復(fù)合復(fù)配酶及風(fēng)味-動(dòng)物復(fù)配酶的水解度提升最為顯著，這與蔡路昀等的研究結(jié)果相符[17]。這可能是因?yàn)槌曉谝欢ǔ潭壬细淖兞说孜锏鞍踪|(zhì)的分子構(gòu)象，促使更多親水基團(tuán)的暴露，有利于底物與酶的結(jié)合，從而提高蛋白質(zhì)的水解程度[18-19]。比較超聲預(yù)處理前后，幾種復(fù)配酶水解雞肉蛋白的效果，經(jīng)超聲預(yù)處理后，風(fēng)味蛋白酶與動(dòng)物蛋白酶復(fù)配時(shí)雞肉蛋白的水解度最大，高于其他試驗(yàn)組。綜合試驗(yàn)數(shù)據(jù)并分析，超聲輔助酶解具有提高水解效果的特點(diǎn)。因此，本研究采用超聲輔助酶法水解雞肉蛋白，最佳酶種類為風(fēng)味蛋白酶與動(dòng)物蛋白酶復(fù)配（質(zhì)量比1:1）。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 超聲功率對(duì)雞肉蛋白水解度的影響

超聲功率對(duì)雞肉蛋白水解度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲功率對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of ultrasound power on the hydrolysis degree of chicken protein

如圖2所示，雞肉蛋白的水解度在200 W～600 W時(shí)存在顯著上升趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率為600 W時(shí)，水解度達(dá)到峰值，后隨著超聲功率的增加，水解度開始下降。研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)某暪β十a(chǎn)生的超聲波可以增強(qiáng)分子運(yùn)動(dòng)性，提高底物和酶的接觸概率，從而提高酶促反應(yīng)效率[18-19]。當(dāng)超聲功率增大到一定值后出現(xiàn)過(guò)飽和現(xiàn)象，形成音障，從而減弱了超聲作用[20]。同時(shí)，蛋白分子的活性部位也會(huì)被損傷，從而導(dǎo)致水解度下降[21]。因此，最佳超聲功率設(shè)定為600 W。

2.2.2 總加酶量對(duì)雞肉蛋白水解度的影響

總加酶量對(duì)雞肉蛋白水解度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 總加酶量對(duì)雞肉蛋白的水解度的影響Fig.3 The effect of total enzyme addition on the hydrolysis degree of chicken protein

由圖3可知，在0.10%～0.30%的總加酶量時(shí)，水解度呈先增加后逐漸平穩(wěn)的趨勢(shì)?？偧用噶吭?.10%～0.20%時(shí)，水解度增長(zhǎng)較快（P＜0.05），總加酶量在0.20%時(shí)水解度達(dá)到最大，之后隨著總加酶量的不斷增加，水解度變化不顯著（P＞0.05）。主要原因可能是隨著蛋白酶濃度的提高，增加了酶與底物的接觸率，使水解度快速增長(zhǎng)；當(dāng)總加酶量增加到一定程度后，酶解產(chǎn)物的增加及底物的減少，可能對(duì)酶促反應(yīng)產(chǎn)生反饋抑制作用[22]。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)雞肉蛋白水解度的影響

酶解時(shí)間對(duì)雞肉蛋白水解度的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)雞肉蛋白的水解度的影響Fig.4 The effect of enzymatic hydrolysis time on the hydrolysis degree of chicken protein

隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，底物逐漸被酶解。由圖4可知，酶解初始的 2h～4h水解度增加顯著（P＜0.05），4h左右水解度達(dá)到37.06%，隨后水解度無(wú)顯著的變化趨勢(shì)?？赡苁请S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物不斷積累，酶的熱穩(wěn)定性逐步降低，從而使酶活力降低，影響酶解效果[23-24]。

2.2.4 酶解溫度對(duì)雞肉蛋白水解度的影響

酶解溫度對(duì)雞肉蛋白水解度的影響見(jiàn)圖5。

圖5 酶解溫度對(duì)雞肉蛋白的水解度的影響Fig.5 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the hydrolysis degree of chicken protein

由圖5可知，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的水解度呈先快速增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為55℃時(shí)，水解度最大。由于酶促反應(yīng)受溫度影響顯著，在適宜的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶的催化活性也不斷增強(qiáng)，因而水解度不斷升高；當(dāng)溫度超過(guò)復(fù)配酶的最適溫度后，部分酶開始失活，酶解效率不斷降低[25-26]。因此，復(fù)配蛋白酶的最適酶解溫度為55℃。

2.2.5 固液比對(duì)雞肉蛋白水解度的影響

固液比對(duì)雞肉蛋白水解度的影響見(jiàn)圖6。

由圖6可知，固液比1:3（g/mL）時(shí)，水解度高于其他組，達(dá)到36.64%。固液比的變化影響底物濃度，當(dāng)?shù)孜锉壤^大時(shí)，反應(yīng)體系缺乏流動(dòng)性，底物不能與酶進(jìn)行充分的接觸，從而使水解不充分、不完全；隨著底物濃度的降低，體系的流動(dòng)性比較好，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行[27]。當(dāng)固液比增大到一定程度，酶與底物接觸的幾率較小，酶促反應(yīng)受到限制，此時(shí)水解度較低[22，28]。因此，確定最適固液比為1:3（g/mL）。

圖6 固液比對(duì)雞肉蛋白水解度的影響Fig.6 The effect of solid-liquid ratio on the hydrolysis degree of chicken protein

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)29組試驗(yàn)，以水解度為響應(yīng)值，考察反應(yīng)體系中固液比（A）、總加酶量（B）、酶解時(shí)間（C）及酶解溫度（D）對(duì)雞肉蛋白水解度的影響。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.3.2 回歸方程擬合與方差分析

采用Design-Expert 6.0.8設(shè)計(jì)軟件得到回歸方程為Y=34.25+0.29A-0.024B-0.29C-1.80D+0.10AB+0.33AC-0.70AD+1.31BC-0.55BD-0.065CD-1.02A2-1.13B2-1.07C2-1.85D2，方程擬合系數(shù) R2=0.968 0，表明回歸方程擬合程度良好。

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面二次回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA results of the response surface quadratic regression model

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.056 9＞0.05），表明模型正確。決定系數(shù)為0.935 9大于0.9，信噪比為16.927＞4，說(shuō)明試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c真實(shí)數(shù)據(jù)擬合程度良好。各因素對(duì)水解度影響的大小順序?yàn)槊附鉁囟龋―）＞酶解時(shí)間（C）＞固液比（A）＞總加酶量（B）。其中，因素A、C及BD對(duì)雞肉蛋白水解度影響顯著（P＜0.05），因素 D、AD、BC 及 A2、B2、C2、D2對(duì)水解度影響極顯著（P＜0.01）。

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析

圖7是根據(jù)回歸方程繪制得到的響應(yīng)面圖，可用于研究各因素的交互作用對(duì)水解度的影響。響應(yīng)面曲面坡度越陡，表示兩因素交互作用越顯著[29]。

由圖7可知，固液比-酶解溫度（AD）、總加酶量-酶解時(shí)間（BC）、總加酶量-酶解溫度（BD）交互作用較為顯著。固液比-酶解溫度（AD）和總加酶量-酶解時(shí)間（BC）交互作用引起響應(yīng)曲面較大幅度變化，表明AD、BC彼此交互作用極為顯著（P＜0.01）。

圖7 各因素交互作用對(duì)水解度影響的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface diagram of the influence of the interaction of various factors on hydrolysis degree

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design Expert 6.0.8軟件預(yù)測(cè)出超聲輔助雞肉蛋白酶解的最佳工藝條件為固液比1:4.34（g/mL）、復(fù)配蛋白酶添加量0.21%、酶解時(shí)間3.92 h、酶解溫度52.75℃，預(yù)測(cè)值36.67%?？紤]實(shí)際操作方便，將工藝參數(shù)設(shè)置為固液比1:4（g/mL）、復(fù)配蛋白酶添加量0.21%、酶解時(shí)間4 h、酶解溫度53℃。通過(guò)3組平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，雞肉蛋白的水解度為37.48%。

3 結(jié)論

本研究以雞肉為試驗(yàn)原料，以蛋白質(zhì)水解度為試驗(yàn)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過(guò)四因素三水平的響應(yīng)面分析法對(duì)雞肉酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化，建立了雞肉酶解的回歸模型，確定了雞肉蛋白酶解的最佳工藝條件。在超聲功率為600 W，超聲輔助酶解20 min的條件下，風(fēng)味蛋白酶與動(dòng)物蛋白酶復(fù)配質(zhì)量比1:1、固液比1:4（g/mL）、總加酶量0.21%、酶解時(shí)間4 h、酶解溫度53℃時(shí)，雞肉的蛋白水解度可達(dá)37.48%。結(jié)果證明，超聲輔助酶法可顯著提高雞肉蛋白水解度，同時(shí)，響應(yīng)面法可有效的優(yōu)化雞肉蛋白的酶解工藝，對(duì)進(jìn)一步研究雞肉蛋白酶解物及風(fēng)味基料的開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。