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外周血單核細(xì)胞DNMT1及血清IL-6在糖尿病腎臟病中的表達(dá)及意義

2023-02-10 07:09:00許莉敏謝燕
天津醫(yī)藥 2023年2期
關(guān)鍵詞:甲基化腎小球炎癥

許莉敏,謝燕

糖尿病腎?。―KD)是由糖尿病引起的微血管并發(fā)癥,以持續(xù)白蛋白尿和腎小球?yàn)V過(guò)率降低為主要特征[1-2]。DKD是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的重要病因之一,約占所有病因的30%,在發(fā)達(dá)國(guó)家中,DKD已經(jīng)成為尿毒癥發(fā)生的主要影響因素[3]。腎小球?yàn)V過(guò)率估計(jì)值(eGFR)及24 h尿白蛋白排泄率(24 h UAER)是臨床評(píng)估DKD患者腎功能及病程分期的常用指標(biāo),但2個(gè)指標(biāo)對(duì)DKD疾病早期診斷價(jià)值有限。既往研究顯示,DNA甲基化與DKD有關(guān),而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)是DNA甲基化的主要催化酶,能夠?qū)⒓谆D(zhuǎn)移到基因組DNA胞嘧啶核苷酸,負(fù)責(zé)DNA復(fù)制后的甲基化修飾,與人類(lèi)發(fā)育異常、腫瘤及糖尿病等有關(guān)[4]。白細(xì)胞介素(IL)-6是重要的促炎細(xì)胞因子,可通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面的IL-6受體α,促進(jìn)組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生。研究表明,DNMT1能夠促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子如IL-6和IL-8的表達(dá),從而激活組織炎癥反應(yīng),加速DKD的疾病進(jìn)展[5]。本研究旨在探討不同疾病嚴(yán)重程度的DKD患者DNMT1和IL-6的水平差異及其在DKD診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月—2021年4月于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的DKD患者150例(DKD組),DKD診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中國(guó)糖尿病腎臟疾病防治臨床指南》[6]。納入標(biāo)準(zhǔn):心、腎、肺等重要臟器功能良好;溝通能力良好,可獨(dú)立完成研究;配合醫(yī)師治療。排除標(biāo)準(zhǔn):1型糖尿病、肝源性糖尿病、應(yīng)激性糖尿病、胰源性糖尿病及生長(zhǎng)抑素瘤、醛固酮瘤等導(dǎo)致的糖尿??;合并血液性系統(tǒng)疾病;合并精神疾??;妊娠期;長(zhǎng)期酗酒;臨床資料不完整致分組復(fù)雜性增加的患者;本研究期間正在接受其他研究的患者。另選取同期健康體檢者50例為對(duì)照組,2組研究對(duì)象的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、性別、文化程度和吸煙史(目前正在吸煙或持續(xù)吸煙史≥6個(gè)月且≥1支/d)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。本研究嚴(yán)格按照《赫爾辛基宣言》中的醫(yī)學(xué)研究倫理原則(倫理批號(hào):TJ?IRB20191222)。

1.2 研究方法

1.2.1 觀察指標(biāo) 收集DKD患者入院后及對(duì)照組健康查體時(shí)的總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血肌酐、空腹血糖等實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)。應(yīng)用改良的MDRD公式計(jì)算eGFR=186×(血肌酐/88.4)-1.154×年齡-0.203×0.742(女性)。放射免疫法檢測(cè)24 h UAER。微柱層析法測(cè)定糖化血紅蛋白。

Tab.1 Comparison of baseline data between the two groups表1 2組基線資料比較

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-6水平 清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血4 mL并置于無(wú)菌真空促凝管中,常溫放置20 min,3 000 r/min離心15 min,離心半徑11 cm,上清液置于-80℃冰箱保存。ELISA法檢測(cè)血清IL-6水平,試劑盒購(gòu)自武漢基因美科技有限公司。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)DNMT1表達(dá) 清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血4 mL后加入3.8%的枸櫞酸鈉抗凝,通過(guò)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,置于-80℃保存待用。采用Trizol試劑提取的外周血單個(gè)核細(xì)胞中總RNA,將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR總反應(yīng)體系(20μL):cDNA 2μL,上、下游引物各1μL和SYBR Premix 10μL,雙蒸水6μL。引物合成由上海賽百盛公司完成。DNMT1引物:上 游 5′-TCAGTCGCAAGATGAAGCGT-3′,下 游 5′-CCCCAGTCAAACTACCCACC-3′;內(nèi)參β-actin:上游5′-GT?GGGGCGCCCAGGCACCT-3′,下游5′-CTTCCTTAATGTCAC?GCACGATTG-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算DNMT1的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料用表示,2組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析。多因素Logistic回歸分析影響DKD發(fā)生的危險(xiǎn)因素并建立24 h UAER、IL-6、DNMT1聯(lián)合診斷評(píng)估模型。受試者工作特征(ROC)曲線分析24 h UAER、IL-6、DNMT1及三者聯(lián)合檢測(cè)在DKD中的診斷價(jià)值,利用R軟件包3.6.3版本比較各指標(biāo)曲線下面積(AUC),比較采用DeLong′s test檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較,DKD組空腹血糖、IL-6、DNMT1、血肌酐、24 h UAER、LDLC、糖化血紅蛋白水平升高,而eGFR、HDL-C水平降低(均P<0.05),2組的總膽固醇、三酰甘油差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of laboratory indexes between the DKD group and the control group表2 DKD組和對(duì)照組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

Tab.2 Comparison of laboratory indexes between the DKD group and the control group表2 DKD組和對(duì)照組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

**P<0.01;eGFR單位為mL/(min·1.73 m2)。

組別對(duì)照組DKD組t n 50 150空腹血糖(mmol/L)4.91±0.52 10.80±2.30 17.928**IL-6(μg/L)52.23±3.17 70.05±4.01 28.571**DNMT1 0.07±0.02 0.13±0.03 13.188**血肌酐(μmol/L)62.14±10.55 91.74±22.98 8.793**eGFR 104.89±14.62 80.17±10.82 12.749**24 h UAER(mg)5.12±1.62 604.29±107.63 39.297**總膽固醇(mmol/L)4.68±0.82 4.42±0.93 1.761三酰甘油(mmol/L)1.83±0.62 2.01±0.83 1.407 HDL-C(mmol/L)1.42±0.24 1.19±0.23 6.057**LDL-C(mmol/L)2.41±0.75 3.61±0.86 8.180**糖化血紅蛋白(%)0.67±0.08 9.08±1.12 52.963**

2.2 DKD患者IL-6、DNMT1與其他臨床指標(biāo)的相關(guān)性 DKD組患者IL-6與DNMT1呈正相關(guān)(r=0.560,P<0.05)。IL-6、DNMT1與24 h UAER呈正相關(guān)(均P<0.05),與空腹血糖、糖化血紅蛋白、血肌酐、eGFR、HDL-C、LDL-C均無(wú)相關(guān)性(均P>0.05),見(jiàn)表3。

Tab.3 Correlation of IL-6,DNMT1 and clinical indicators in DKD patients表3 DKD患者IL-6、DNMT1與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

2.3 DKD影響因素分析 以是否發(fā)生DKD為因變量(是=1,否=0),以eGFR、24 h UAER、IL-6及DNMT1為自變量,Logistic回歸分析結(jié)果顯示,較高水平的24 h UAER、IL-6、DNMT1是影響DKD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表4。

Tab.4 Analysis of influencing factors of DKD表4 DKD影響因素分析

2.4 24 h UAER、IL-6、DNMT1對(duì)DKD的診斷價(jià)值 24 h UAER、IL-6、DNMT1聯(lián)合檢測(cè)診斷DKD的 方 程 為:Log[P/(1-P)]=-1.867+0.258×(24 h UAER)+0.298×(IL-6)+0.776×(DNMT1)。聯(lián)合檢測(cè)診斷DKD的AUC高于24 h UAER、IL-6、DNMT1單一指標(biāo)檢測(cè)(Z分別為4.429、4.327、1.879,均P<0.01),見(jiàn)表5、圖1。

Tab.5 Diagnostic value of 24 h UAER,IL-6 and DNMT1 in diagnosing DKD表5 24 h UAER、IL-6、DNMT1對(duì)診斷DKD的診斷價(jià)值

Fig.1 ROC curve analysis of 24 h UAER,IL-6,DNMT1 and combined detection in the diagnosis of DKD圖1 24 h UAER、IL-6、DNMT1及聯(lián)合檢測(cè)診斷DKD的ROC曲線分析

3 討論

DKD是終末期腎病最常見(jiàn)的原因,易合并心力衰竭、腦卒中等心腦血管疾病,甚至導(dǎo)致患者死亡,嚴(yán)重威脅患者生命健康[7-8]。DKD的病因及發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,多認(rèn)為與高血糖引起的氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)有關(guān),活性氧及晚期糖基化產(chǎn)物能夠激活系膜細(xì)胞中炎癥反應(yīng),導(dǎo)致腎小球系膜增生和腎小球間質(zhì)的纖維化,最終導(dǎo)致DKD的發(fā)生[9]。目前,臨床上DKD的診斷主要依賴24 h UAER,但24 h UAER的測(cè)定受到感染、發(fā)熱及心力衰竭等多種因素的影響,在DKD診斷和預(yù)測(cè)DKD疾病進(jìn)展上仍存在一定的局限性。因此,尋找能夠有效診斷DKD的血清標(biāo)志物,對(duì)于延緩終末期腎病的發(fā)生具有重要的臨床意義。

IL-6為白細(xì)胞介素家族中的促炎細(xì)胞因子,大多由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌,成纖維細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞也可分泌少量IL-6。本研究中,DKD患者血清IL-6水平明顯升高,提示IL-6可能參與DKD的發(fā)病過(guò)程。有研究顯示,腎足細(xì)胞表達(dá)IL-6受體gp130,當(dāng)腎足細(xì)胞受脂多糖、高血糖損傷刺激時(shí),能夠促進(jìn)IL-6的分泌[10]。24 h UAER是臨床常用的診斷DKD的指標(biāo),24 h UAER升高通常能夠增加DKD患者心血管事件和死亡風(fēng)險(xiǎn)。本研究中DKD患者IL-6的表達(dá)與24 h UAER呈正相關(guān),證實(shí)了IL-6的表達(dá)升高可能參與DKD的發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn),IL-6能夠通過(guò)促進(jìn)腎足細(xì)胞中Jacus相關(guān)激酶2結(jié)合gp130并發(fā)生自身磷酸化,進(jìn)而誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3的磷酸化激活,促進(jìn)足細(xì)胞肥大及凋亡,促進(jìn)DKD的進(jìn)展[11]。本研究中,多因素Logistic回歸分析結(jié)果證實(shí),IL-6升高是影響DKD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示IL-6升高是參與DKD疾病發(fā)生、發(fā)展的重要血清標(biāo)志物。推測(cè)其機(jī)制,IL-6作為一種促炎細(xì)胞因子,可以招募并激活中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞,促進(jìn)腫瘤壞死因子α等促炎細(xì)胞因子的大量釋放,導(dǎo)致單核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞對(duì)腎小球基底膜組織的浸潤(rùn),進(jìn)而使機(jī)體的炎癥損傷加重,氧化應(yīng)激代謝發(fā)生異常,加重了腎小球基底膜損傷[12]。

表觀遺傳學(xué)是核苷酸序列的甲基化、乙?;刃揎椧鸹虮磉_(dá)的變化,從而參與機(jī)體炎癥、代謝等生理及病理學(xué)過(guò)程的調(diào)控,與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[13]。岳銳等[14]研究認(rèn)為,DNA甲基化可以通過(guò)影響細(xì)胞凋亡與代謝過(guò)程,從而對(duì)腎病患者的腎功能以及腎臟纖維化產(chǎn)生不利影響。DNMT1是負(fù)責(zé)維持DNA復(fù)制后甲基化模式的主要酶,可將甲基轉(zhuǎn)移到基因組DNA的胞嘧啶核苷酸上,該基因的表達(dá)失常與小腦共濟(jì)失調(diào)、腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4]。本研究結(jié)果顯示,DKD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中DNMT1表達(dá)明顯升高,并且其表達(dá)水平與24 h UAER呈正相關(guān),提示DNMT1表達(dá)升高參與DKD的疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。Zhang等[15]研究顯示,DKD小鼠模型腎小球足細(xì)胞的DNMT1蛋白呈高表達(dá),表明DNMT1促進(jìn)了糖尿病腎病足細(xì)胞的炎癥性損傷,而在使用DNA甲基化抑制劑5-Aza后蛋白尿的水平明顯降低,足細(xì)胞損傷程度也有所減輕。本研究進(jìn)一步證實(shí),DNMT1升高是影響DKD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn),糖尿病患者外周血單核細(xì)胞中DNMT1的上調(diào)能夠誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白啟動(dòng)子區(qū)域胞嘧啶異常甲基化,引起哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白通路的過(guò)度激活,進(jìn)而加重糖尿病腎臟組織的過(guò)度炎癥。本研究中DNMT1與IL-6表達(dá)呈顯著正相關(guān),提示DNMT1與IL-6的表達(dá)可能存在相互作用的關(guān)系。分析其機(jī)制,一方面,IL-6能夠直接激活DNMT1的表達(dá),進(jìn)而抑制下游E-鈣黏蛋白的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)化,加重腎臟纖維化[17];另一方面,DNMT1的表達(dá)升高能夠抑制IL-6的甲基化水平,促進(jìn)IL-6的表達(dá),參與DKD疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[18]。本研究通過(guò)ROC分析發(fā)現(xiàn),24 h UAER、DNMT1與IL-6聯(lián)合檢測(cè)診斷DKD的AUC顯著高于各單一指標(biāo)檢測(cè),提示三者聯(lián)合檢測(cè)是診斷DKD的良好指標(biāo),可作為后續(xù)臨床診斷的可行參考。

綜上所述,IL-6、DNMT1在DKD患者中表達(dá)上調(diào),與DKD患者的病情發(fā)展情況密切相關(guān)。較高水平的24 h UAER、IL-6、DNMT1是影響DKD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,24 h UAER、DNMT1、IL-6聯(lián)合檢測(cè)可作為DKD臨床診斷的預(yù)測(cè)指標(biāo)。然而,本研究納入的樣本量相對(duì)較少,未對(duì)可能參與DKD患者病情發(fā)展的其他炎癥因子如腫瘤壞死因子α、IL-1β等進(jìn)行研究,有待今后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,并對(duì)其他可能參與DKD疾病發(fā)生、發(fā)展的其他炎癥因子進(jìn)行探索。

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