高 燕,韋 田,紀(jì)曉雯,李廣瑩,肖桂然

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

鋅是第二大微量元素,參與多個(gè)細(xì)胞代謝過(guò)程,如基因表達(dá)、DNA合成、蛋白質(zhì)合成、免疫功能、傷口愈合和細(xì)胞分裂[1]。鋅還對(duì)孕期、兒童和青少年時(shí)期的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[2]。但人體沒(méi)有專門(mén)的鋅存儲(chǔ)系統(tǒng),因此需要每天攝入鋅維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡[1]。已有一些研究發(fā)現(xiàn)鋅與生殖密切相關(guān)。在雄性生殖系統(tǒng)中,睪丸、附睪、前列腺以及精液中鋅含量較多[3]。當(dāng)機(jī)體鋅離子水平較低時(shí),雄性機(jī)體會(huì)出現(xiàn)異常,如生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、性成熟推遲、免疫功能降低、精子活力降低等[3]。此外,研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體中鋅離子穩(wěn)態(tài)失衡也會(huì)影響雌性生殖系統(tǒng)的發(fā)育。當(dāng)鋅離子攝入不足時(shí)會(huì)影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量、卵母細(xì)胞分裂、排卵異常等[4-5],還會(huì)影響卵巢發(fā)育,甚至造成雌性難產(chǎn)、卵巢萎縮等嚴(yán)重影響[6],但具體的機(jī)制仍不清楚。

果蠅是遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)中重要的模式生物之一,具有體積小、生命周期短(約12 d)、繁殖力強(qiáng)、子代數(shù)量多等特點(diǎn)[7]。果蠅有2個(gè)卵巢,每個(gè)卵巢有15～20個(gè)卵巢管,在每個(gè)卵巢管前端有1個(gè)卵原區(qū)結(jié)構(gòu),在卵原區(qū)頂端有5～7個(gè)帽細(xì)胞,前端與端絲細(xì)胞相連,后端通過(guò)調(diào)控細(xì)胞黏附蛋白DE-Cadherin將生殖干細(xì)胞固定在卵原區(qū),這3種細(xì)胞共同構(gòu)成生殖干細(xì)胞微環(huán)境(niche)[8]。目前,果蠅卵巢已被用于niche形成、結(jié)構(gòu)維持、干細(xì)胞與niche之間作用機(jī)制的研究[9]。雌性動(dòng)物卵巢釋放卵子的過(guò)程稱為排卵,研究發(fā)現(xiàn)人類和果蠅等不同動(dòng)物的排卵方式基本相似,因此果蠅卵巢模型系統(tǒng)適于研究生殖調(diào)控機(jī)制[10]。

在動(dòng)物中有solute-linked carrier 39A(SLC39A,ZIP家族)和solute-linked carrier 30A(SLC30A,ZnT家族)[11]2種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鋅水平。ZIP家族蛋白負(fù)責(zé)鋅從細(xì)胞器或細(xì)胞外到細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸,ZnT家族介導(dǎo)鋅從細(xì)胞質(zhì)輸出到細(xì)胞器或細(xì)胞外[12]。生物信息學(xué)比對(duì)發(fā)現(xiàn),Catsup基因是哺乳動(dòng)物Zip7基因的同源物,屬于ZIP家族的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,定位于高爾基體,負(fù)責(zé)將高爾基體中的鋅運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)[11]。雖然文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道Catsup突變會(huì)導(dǎo)致卵子形成異常,果蠅生殖能力下降,但具體分子機(jī)制并不清楚,因此,本文利用Gal4/UAS系統(tǒng)[15]在果蠅卵巢niche中特異性敲低Catsup以研究對(duì)生殖發(fā)育的影響,并進(jìn)一步探索分子機(jī)制,旨在解析鋅對(duì)生殖調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 果蠅品系

果蠅飼養(yǎng)于25 ℃、60%濕度、12 h/12 h交替光照的培養(yǎng)箱中,本文所用果蠅品系及來(lái)源如下:W1118(來(lái)自Vienna Drosophila Research Center,編號(hào)60000)、CatsupRNAi(來(lái)自Vienna Drosophila Research Center,編號(hào)100095)、CatsupRNAi;dZnt7 RNAi(CatsupRNAi和dZnt7 RNAi重組果蠅,其中dZnt7 RNAi來(lái)自清華果蠅中心,編號(hào)THU5682)、CatsupRNAi;dZip1 OE(CatsupRNAi和dZip1 OE重組果蠅,其中dZip1 OE果蠅來(lái)自文獻(xiàn)[16])、CatsupRNAi;dZnt1 OE(CatsupRNAi和dZnt1 OE重組果蠅,其中dZnt1 OE果蠅來(lái)自文獻(xiàn)[17])、C587-Gal4;UAS-EGFP(來(lái)自Bloomington Drosophila Stock Center,編號(hào)67747)、C587-Gal4，Vkg-GFP/Cyo(來(lái)自文獻(xiàn)[18])。

1.1.2 果蠅標(biāo)準(zhǔn)玉米培養(yǎng)基

果蠅標(biāo)準(zhǔn)玉米培養(yǎng)基配方如下:玉米粉100 g、紅糖40 g、酵母25 g、白糖14.5 g、大豆粉10 g、瓊脂8 g,添加超純水至1 L。

1.1.3 果蠅加藥培養(yǎng)基

在標(biāo)準(zhǔn)玉米培養(yǎng)基中添加終濃度4 mmol/L ZnCl2或50 μmol/L TPEN(N,N,N,N-Tetrakis(2-pyridylmethyl)-ethylenediamine)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生殖能力測(cè)定

在25 ℃、60%相對(duì)濕度條件下飼養(yǎng)果蠅,將C587;UAS-EGFP處女蠅分別與不同品系的UAS雄蠅雜交,獲得子一代果蠅。收集1 d內(nèi)羽化的雌蠅,放入添加適量酵母的果蠅培養(yǎng)管,每管10只雌蠅和3只雄蠅。飼養(yǎng)約2 d,將雌蠅分別放入添加適量酵母的培養(yǎng)管,每管1只,每個(gè)基因型分裝10管進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。每隔24 h將雌蠅導(dǎo)入新管,連續(xù)7 d統(tǒng)計(jì)產(chǎn)蛋數(shù)量,每組產(chǎn)蛋量取平均值,即得每種品系果蠅1周內(nèi)生殖能力的變化。

“鳳舞九天·楚文化特展”以楚國(guó)的鳳崇拜為線索，展覽定位為文化、藝術(shù)展覽。宣傳文本分別發(fā)布于首都博物館的中英文官方網(wǎng)站。本文在官網(wǎng)譯文的基礎(chǔ)上，試圖探討如何通過(guò)發(fā)揮譯者主體性，從傳播和接受的角度得出更好的譯文。

1.2.2 卵巢niche結(jié)構(gòu)的觀察

本研究所用的C587-Gal4;UAS-EGFP果蠅是在卵巢niche表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白(cenhanced green fluorescent protein,EGFP),用于標(biāo)記niche部位,便于用熒光顯微鏡觀察niche形態(tài)。將C587-Gal4;UAS-EGFP處女蠅分別與不同品系的UAS雄蠅雜交,在25 ℃、60%相對(duì)濕度條件下飼養(yǎng),獲得子一代果蠅。收集1 d內(nèi)羽化的雌蠅放入添加適量酵母的果蠅培養(yǎng)管,飼養(yǎng)3 d,解剖果蠅卵巢,在熒光顯微鏡下觀察卵巢niche結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.3 卵巢niche部位膠原蛋白的觀察

果蠅Ⅳ型膠原蛋白(ColⅣ)由α-1 (Cg25c)和α-2 (Vkg)組成,形成異三聚體翻譯后被賴氨酸和脯氨酸羥化酶修飾,最終形成功能性基底膜[19]。在果蠅中,Vkg-GFP是功能性GFP-trap融合到Ⅳ型膠原蛋白 α-2 鏈(Vkg),全長(zhǎng)內(nèi)源性蛋白從其內(nèi)源性啟動(dòng)子中表達(dá)為Vkg-GFP融合蛋白[20]。利用遺傳重組技術(shù)獲得C587-Gal4,Vkg-GFP果蠅,用熒光顯微鏡觀察卵巢niche組織,可根據(jù)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表達(dá)(熒光強(qiáng)度)來(lái)反映Vkg(膠原蛋白)的表達(dá)水平。

1.2.4 卵巢大小的統(tǒng)計(jì)

利用Image J軟件統(tǒng)計(jì)卵巢大小,顯著性水平取P<0.05(*)為顯著,P<0.01(**),P<0.001(***)。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲低Catsup對(duì)果蠅生殖能力的影響

圖1 Catsup表達(dá)下調(diào)對(duì)產(chǎn)蛋量的影響

2.2 敲低Catsup對(duì)果蠅卵巢niche的影響

生殖干細(xì)胞存在于niche組織中,對(duì)果蠅卵子形成至關(guān)重要[22]。在niche組織中,Catsup表達(dá)下調(diào)對(duì)卵巢niche及其大小的影響如圖2所示。

圖2 Catsup表達(dá)下調(diào)對(duì)卵巢niche及其大小的影響

從圖2可以看出,CatsupRNAi會(huì)導(dǎo)致果蠅卵巢niche丟失(圖2a中紅色箭頭所指),同時(shí)Catsup表達(dá)下調(diào)也會(huì)導(dǎo)致卵巢大小顯著減小(圖2b,P<0.01),結(jié)果表明Catsup表達(dá)下調(diào)影響果蠅卵巢niche結(jié)構(gòu)維持,進(jìn)而導(dǎo)致果蠅產(chǎn)蛋減少。

2.3 膳食加鋅對(duì)生殖障礙的影響

Catsup蛋白負(fù)責(zé)將高爾基體內(nèi)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[11],CatsupRNAi會(huì)導(dǎo)致高爾基體內(nèi)積鋅,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)缺鋅。本文通過(guò)調(diào)控膳食中鋅水平分析Catsup敲低對(duì)生殖的影響,如圖3所示。

圖3中:A代表正常食物(normal food,NF)W1118;B代表4 mmol/L ZnCl2W1118;C代表50 μmol/L TPEN W1118;D代表正常食物 NFCatsupRNAi;E代表4 mmol/L ZnCl2CatsupRNAi;F代表50 μmol/L TPENCatsupRNAi。從圖3可以看出,在膳食中添加4 mmol/L ZnCl2能夠在一定程度挽救Catsup敲低導(dǎo)致果蠅產(chǎn)蛋下降,并且其卵巢niche結(jié)構(gòu)和卵巢大小都明顯恢復(fù);而膳食中添加鋅螯合劑50 μmol/L TPEN則會(huì)加重這些表型。結(jié)果表明Catsup敲低導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)鋅減少,從而引起果蠅生殖障礙問(wèn)題,可通過(guò)膳食補(bǔ)鋅改善由于細(xì)胞質(zhì)缺鋅導(dǎo)致的生殖障礙問(wèn)題。

2.4 遺傳補(bǔ)鋅對(duì)生殖障礙的影響

為了進(jìn)一步證實(shí)Catsup敲低導(dǎo)致的生殖問(wèn)題與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)缺鋅相關(guān),本實(shí)驗(yàn)利用遺傳手段調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鋅水平觀察Catsup敲低對(duì)生殖的影響。dZnt7蛋白定位于高爾基體上,負(fù)責(zé)將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中,與Catsup功能相反;dZip1蛋白定位于細(xì)胞膜上,負(fù)責(zé)將胞外鋅轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi),dZnt1蛋白定位于細(xì)胞膜,負(fù)責(zé)將胞質(zhì)中的鋅轉(zhuǎn)出細(xì)胞,與dZip1蛋白功能相反[11]。通過(guò)遺傳重組技術(shù)共表達(dá)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白,觀察對(duì)果蠅產(chǎn)蛋能力、niche結(jié)構(gòu)和卵巢大小的影響,如圖4所示。

圖4 遺傳手段改變細(xì)胞質(zhì)鋅水平對(duì)生殖的影響

圖4中:a代表W1118;b代表CatsupRNAi;c代表CatsupRNAi;dZnt7 RNAi;d代表CatsupRNAi;dZip1 OE;e代表CatsupRNAi;dZnt1 OE。從圖4可以看出,dZnt7 RNAi可以完全挽救CatsupRNAi導(dǎo)致的產(chǎn)蛋能力減弱、niche丟失和卵巢變小等問(wèn)題;dZip1 OE可以部分挽救CatsupRNAi導(dǎo)致的生殖問(wèn)題;而dZnt1 OE則會(huì)加重表型。結(jié)果表明,Catsup敲低導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)缺鋅,高爾基體內(nèi)積鋅,而dZnt7 RNAi或dZip1 OE能夠提高細(xì)胞質(zhì)鋅水平,挽救生殖缺陷問(wèn)題,此外,dZnt1 OE降低細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鋅水平會(huì)加重表型。因此,敲低Catsup是通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)鋅水平導(dǎo)致果蠅的生殖障礙問(wèn)題。

2.5 敲低Catsup對(duì)卵巢卵原區(qū)膠原蛋白的影響

已有研究發(fā)現(xiàn)膠原蛋白對(duì)生殖有重要作用,在果蠅卵巢niche中,Ⅳ型膠原蛋白和β-整合素共同作用維持E-Cadherin正常水平,從而確保生殖干細(xì)胞在卵巢粘附,維持卵巢niche結(jié)構(gòu)[23]。因此,本文推測(cè)Catsup敲低可能影響了卵巢中膠原蛋白的水平,進(jìn)而影響卵巢niche結(jié)構(gòu)維持。本實(shí)驗(yàn)利用C587-Gal4、Vkg-GFP來(lái)觀察niche部位膠原蛋白水平,Catsup表達(dá)下調(diào)對(duì)卵巢卵原區(qū)膠原蛋白的影響如圖5所示。

圖5 Catsup表達(dá)下調(diào)對(duì)卵巢卵原區(qū)膠原蛋白的影響

從圖5可以看出,Catsup敲低導(dǎo)致卵巢卵原區(qū)膠原蛋白顯著減少;dZnt7 RNAi可以完全挽救Catsup敲低導(dǎo)致的膠原蛋白降低;dZip1 OE可以部分挽救;而dZnt1 OE則會(huì)加重該表型。結(jié)果表明Catsup敲低導(dǎo)致卵原區(qū)膠原蛋白減少,影響卵巢niche結(jié)構(gòu)維持,導(dǎo)致卵巢缺陷、產(chǎn)蛋能力下降。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn),在卵巢中敲低Catsup會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)蛋顯著減少、卵巢niche丟失和卵巢變小等生殖障礙問(wèn)題,這些生殖缺陷可能與敲低Catsup導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)缺鋅相關(guān)。從膳食角度出發(fā),調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鋅水平發(fā)現(xiàn)，膳食補(bǔ)鋅能夠在一定程度上挽救敲低Catsup導(dǎo)致的果蠅生殖障礙問(wèn)題,其對(duì)產(chǎn)蛋能力、卵巢niche結(jié)構(gòu)和卵原區(qū)膠原蛋白水平都有一定程度的挽救。

利用遺傳手段在卵巢niche部位敲低Znt7或過(guò)表達(dá)Zip1,增加細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鋅水平,能夠很好地挽救CatsupRNAi導(dǎo)致的生殖缺陷。結(jié)果表明,Catsup在卵巢表達(dá)減少,引起細(xì)胞質(zhì)鋅缺乏,導(dǎo)致卵原區(qū)膠原蛋白表達(dá)減少,影響卵巢niche結(jié)構(gòu)維持、卵巢形態(tài)異常和產(chǎn)蛋能力減弱。

許多文獻(xiàn)報(bào)道,鋅對(duì)生殖健康具有重要作用,但是目前分子機(jī)制并不清楚。Catsup基因是哺乳動(dòng)物Zip7基因的同源物,具有調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)作用。本研究發(fā)現(xiàn)Catsup基因通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鋅水平影響生殖發(fā)育,該結(jié)果為機(jī)體鋅缺乏導(dǎo)致的生殖問(wèn)題的診斷和治療提供理論依據(jù),也為生殖健康相關(guān)保健食品的開(kāi)發(fā)奠定一定基礎(chǔ)。