呂正陽, 邵登科, 張春源, 賴澤成, 李望豪, 周瑞鵬, 劉梓燁, 王榮波, 林占熺, 魯國東,5, 葉文雨

[1.福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，植物與微生物相互作用福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院 (海峽聯(lián)合研究院)，福建 福州 350002；4.福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350013；5.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002]

土壤鹽堿化是世界旱作農(nóng)區(qū)突出的生態(tài)環(huán)境問題[1].據(jù)統(tǒng)計(jì)，鹽堿土資源遍及世界100多個(gè)國家，總面積約達(dá)10億hm2[2].我國現(xiàn)有鹽堿地面積高達(dá) 9.9×106hm2，這些鹽堿地中具有農(nóng)業(yè)發(fā)展?jié)摿Φ恼嘉覈乜偯娣e的10%以上，是我國優(yōu)良的土地儲(chǔ)備資源，如果不加以改良利用，會(huì)造成極大的資源浪費(fèi)[3].土壤鹽分的增加是一種破壞性的非生物脅迫，抑制了植物的正常生長和發(fā)育，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)產(chǎn)量大幅下降，破壞了自然地區(qū)的生態(tài)平衡[4-6].鹽脅迫的存在會(huì)導(dǎo)致植物產(chǎn)生離子毒害和滲透脅迫，引起植物氧化損傷，增強(qiáng)土傳病原菌的侵染能力[7]，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益、危害環(huán)境安全.因此，對(duì)土壤鹽堿化的治理迫在眉睫.

我國鹽堿地治理方法主要分為工程法、化學(xué)法、生物法，其中，生物法治理鹽堿地的成本較低、生態(tài)安全性好，具有良好的生態(tài)效益并能夠長期改良鹽堿土壤[8].巨菌草(CenchrusfungigraminusZ. X. Lin & D.M. Lin & S. R. Lan sp. nov.)原產(chǎn)于非洲，為禾本科(Gramineae)蒺藜草屬(CenchrusL.)植物，其根系發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)，年產(chǎn)鮮草可達(dá)200～400 t·hm-2，巨菌草目前已被作為優(yōu)質(zhì)飼料、生物燃料等，在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境改良上被廣泛應(yīng)用[9-11].巨菌草在鹽漬地的生物量大且根系發(fā)達(dá)，有利于固定土壤，且對(duì)沙質(zhì)化鹽漬地改良效果較好，土質(zhì)化鹽漬地改良效果相對(duì)一般，對(duì)鹽漬化土壤的改良起重要作用[12-13]，并且已經(jīng)初步應(yīng)用于鹽堿地的治理[14].玉米是我國三大糧食作物之一，與巨菌草同屬于禾本科，屬于鹽敏感作物，土壤鹽漬化嚴(yán)重危害玉米產(chǎn)量[15].植物根際促生菌是指通過自身生命活動(dòng)，直接或間接促進(jìn)植物生長的微生物[16]，如假單胞菌(Pseudomonas)[17]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[18]等.此外，一些根際微生物還能夠增強(qiáng)植物抗逆境生長能力，抑制有害微生物生長繁殖，不僅對(duì)植物體、自然環(huán)境無害，而且許多根際促生菌還有參與植物自身代謝活動(dòng)和改善生態(tài)環(huán)境的功能[19-20]，具有良好的研究和應(yīng)用價(jià)值.

本試驗(yàn)從福建莆田鹽堿地中分離、篩選出1株耐鹽堿能力最強(qiáng)的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)PT6-1，對(duì)其生理生化特性以及其對(duì)巨菌草、玉米耐鹽堿性和抗氧化酶活性等相關(guān)指標(biāo)的影響進(jìn)行試驗(yàn)探究，為應(yīng)用耐鹽堿微生物與巨菌草聯(lián)合治理鹽堿地，增強(qiáng)農(nóng)作物的耐鹽堿生長能力提供材料.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤、菌株、植物材料等 供試土壤：2021年5月采集福建省莆田市秀嶼區(qū)安柄村3年生火龍果地15～20 cm根際鹽堿土壤，裝于無菌密封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室立即處理.供試菌株：PT6-1，分離保存于福建農(nóng)林大學(xué)植物與微生物相互作用福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.巨菌草幼苗：采集自福建農(nóng)林大學(xué)后山菌草基地.玉米種子：中玉九號(hào)，購自吉林省春城種業(yè)有限公司.

1.1.2 培養(yǎng)基 細(xì)菌生長培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基[21]；生理生化特性測(cè)定培養(yǎng)基：CAS檢測(cè)培養(yǎng)基(鐵載體)[21]、蒙娜金有機(jī)磷培養(yǎng)基[21]、無機(jī)磷培養(yǎng)基[21]、Ashby無氮培養(yǎng)基[21]、淀粉水解培養(yǎng)基[21]、脫脂乳粉培養(yǎng)基[21]、解硅酸鹽培養(yǎng)基[21]、明膠液化培養(yǎng)基[21]、CMC培養(yǎng)基(纖維素酶)[22]、King發(fā)酵培養(yǎng)基[23].

1.2 方法

1.2.1 耐鹽堿細(xì)菌的分離、保藏及耐鹽堿能力篩選 準(zhǔn)確稱取5 g土壤樣品與45 mL無菌水混勻置于三角瓶?jī)?nèi)，37 ℃搖床振蕩0.5 h，冰浴30 min，取上清液1 mL，用無菌水梯度稀釋至10-4、10-5，取100 μL上清稀釋液涂布于NaCl濃度為5%、pH值為9(NaOH調(diào)節(jié))的耐鹽堿能力篩選LB平板，37 ℃黑暗恒溫倒置培養(yǎng)48 h，盡可能挑取菌落外觀形態(tài)不同的細(xì)菌單菌落，劃線在新的耐鹽堿篩選平板上，連續(xù)劃線純化3次后保藏[21].用不同濃度NaCl作為單一鹽脅迫處理、NaOH調(diào)節(jié)不同pH值作為單一堿脅迫處理，配制不同的LB液體篩選培養(yǎng)基，以1%的接種量接種細(xì)菌菌液，37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)36 h，每隔3 h測(cè)定1次培養(yǎng)液在600 nm處的光密度(D600 nm)的吸光度.通過菌株生長情況判斷其是否能夠耐受當(dāng)前濃度的鹽、堿脅迫.篩選出耐鹽、耐堿能力最強(qiáng)的菌株，繪制其在常規(guī)LB培養(yǎng)基、含PT6-1可耐受的最高濃度NaCl的LB培養(yǎng)基、可耐受最高pH值的LB培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的生長曲線.

1.2.2 PT6-1的分子鑒定 以細(xì)菌16S rRNA通用引物27F、1492R對(duì)篩選出的耐鹽堿細(xì)菌PT6-1的16S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增[21]，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，將正確的條帶送至擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI的GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進(jìn)行Blast序列對(duì)比，下載高同源性序列，采用MEGA X軟件，鄰近相接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.3 PT6-1生理生化特性 測(cè)定PT6-1解有機(jī)磷[21]、無機(jī)磷[21]、解硅酸鹽[21]、固氮[21]、產(chǎn)IAA[23]、產(chǎn)鐵載體[21]、明膠液化[21]、產(chǎn)淀粉水解酶[21]、產(chǎn)蛋白酶[21]、產(chǎn)纖維素酶[22]、產(chǎn)接觸酶能力[22]的有無，對(duì)產(chǎn)生透明圈的平板進(jìn)行透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)測(cè)量，計(jì)算溶解比(D·d-1)，固氮酶活性測(cè)定用細(xì)菌固氮酶ELISA檢測(cè)試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司).利用革蘭氏染色試劑盒(購自索萊寶生物科技有限公司)對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色[24]，光學(xué)顯微鏡觀察染色結(jié)果.

1.2.4 PT6-1對(duì)巨菌草、玉米在鹽堿條件下生長的促進(jìn)效果 將NaCl以0.3%的比例添加至植物營養(yǎng)土，用自來水和適量NaOH混合后加入土壤，使土壤含水量為40%～50%、pH 值為8.5～9.0，模擬自然條件下的重度鹽堿地.巨菌草幼苗、玉米幼苗在未施加鹽堿脅迫的營養(yǎng)土中培育，待幼苗培育至出芽第7天(株高約8～12 cm)，將幼苗移栽入試驗(yàn)鹽堿土盆中進(jìn)行下一步操作.

取出苗約7 d、生長狀況相近的巨菌草幼苗(苗高約為8～12 cm)，移栽至鹽堿脅迫營養(yǎng)土中， 3株苗1盆，共6盆，其中3盆為對(duì)照組(CK)，3盆為PT6-1菌液灌根處理組.移栽后當(dāng)天進(jìn)行第1次灌根，每盆的灌根量為20 mLD600 nm=1.0的PT6-1菌液，用自來水稀釋10倍進(jìn)行澆灌，對(duì)照組澆灌20 mL LB液體培養(yǎng)基，用10倍自來水稀釋.每隔7 d重復(fù)進(jìn)行1次灌根處理，從幼苗移栽當(dāng)日開始計(jì)時(shí)，待幼苗生長第28天收獲并測(cè)定其每盆植株的株高、莖粗、總鮮質(zhì)量、地上鮮質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量、地上干質(zhì)量、地下干質(zhì)量，玉米的處理方式和測(cè)定指標(biāo)與巨菌草相同(移栽日玉米幼苗株高約10～15 cm).

1.2.5 PT6-1對(duì)巨菌草、玉米在鹽堿脅迫下光合色素含量、抗氧化酶活性的影響 巨菌草、玉米種植，菌液灌根處理方法同1.2.4，取第1次菌液處理后生長第28天的巨菌草、玉米植株，每個(gè)處理及對(duì)照隨機(jī)取3株進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定葉片的總光合色素含量、葉綠素含量，葉片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、根系過氧化物酶(peroxidase，POD)活性和葉片過氧化氫酶(catalase，CAT)活性，試驗(yàn)重復(fù)3次[25].

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽堿細(xì)菌的分離、篩選

分離、篩選出1株耐鹽堿能力最強(qiáng)的細(xì)菌， 將它命名為PT6-1，其耐NaCl 最高濃度為2.4 mol·L-1，最高耐堿pH值為12.PT6-1在pH值為12的LB液體培養(yǎng)基和NaCl濃度為2.4 mol·L-1的LB液體培養(yǎng)基中均能正常傳代培育，但相較于常規(guī)LB液體培養(yǎng)基其延滯期增長(圖1).

2.2 PT6-1的分子鑒定

對(duì)PT6-1進(jìn)行菌液PCR后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2)，PT6-1的16S rRNA片段約1 600 bp.根據(jù)測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站的Blast下載相似序列，MEGA X軟件鄰接法建樹(圖3)，結(jié)合其菌落平板形態(tài)，鑒定PT6-1為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens).

2.3 PT6-1生理生化特性

PT6-1在LB平板上菌落呈白色，菌落不透明且黏性較強(qiáng)(圖4A)；PT6-1為革蘭氏陽性菌，經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡下菌體呈藍(lán)紫色，短桿狀(圖4B)，符合解淀粉芽孢桿菌的形態(tài)特征.PT6-1利用無機(jī)磷、解硅酸鹽、固氮、淀粉水解、蛋白水解、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)纖維素酶、產(chǎn)接觸酶等能力呈陽性(圖4C-4J)，固氮酶活性為(179.77±4.62) U·L-1.其余測(cè)定指標(biāo)：解有機(jī)磷能力、明膠液化能力、吲哚物質(zhì)產(chǎn)生能力為陰性.產(chǎn)生、利用效率(溶解比)=(透明圈直徑D)/(菌落直徑d)，PT6-1在解蛋白、解淀粉、解無機(jī)磷、產(chǎn)鐵載體、降解纖維素能力在各種培養(yǎng)基上的溶解比分別為3.87、2.08、1.26、2.49、4.95(圖5)，PT6-1的解蛋白、解淀粉、產(chǎn)鐵載體和降解纖維素能力較強(qiáng)，平板透明圈大且明顯，利用無機(jī)磷能力較弱，平板上僅有較小的透明圈.

圖1 菌株P(guān)T6-1在不同培養(yǎng)條件下的生長曲線Fig.1 Growth curves of strain PT6-1 under different culture conditions

圖3 PT6-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of PT6-1

A：平板生長形態(tài)；B：革蘭氏染色(藍(lán)紫色)，×100(放大倍數(shù))；C：利用無機(jī)磷能力測(cè)定；D：固氮能力測(cè)定；E：利用硅酸鹽能力測(cè)定；F：產(chǎn)蛋白酶能力測(cè)定；G：產(chǎn)淀粉水解酶能力測(cè)定；H：產(chǎn)接觸酶能力測(cè)定；I：產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定；J：產(chǎn)纖維素酶能力測(cè)定.圖4 PT6-1生理生化特性Fig.4 Physiological and biochemical properties of PT6-1

圖5 PT6-1的幾種生理生化能力的產(chǎn)生、利用效率Fig.5 Production and utilization efficiency of several physiological and biochemical abilities of PT6-1

2.4 PT6-1菌液對(duì)巨菌草、玉米耐鹽堿生長的促進(jìn)效果

施加PT6-1菌液組的巨菌草，相較于對(duì)照組株高、莖粗、總鮮質(zhì)量、地上鮮質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量、地上干質(zhì)量、地下干質(zhì)量分別增加了23.1%、25.33%、45.73%、53.29%、27.24%、44.23%、46.19%、32.35%(表1、圖6).經(jīng)PT6-1菌液處理的玉米，相較于對(duì)照組株高、莖粗、總鮮質(zhì)量、地上鮮質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量、地上干質(zhì)量、地下干質(zhì)量分別增加了38.03%、35.85%、123.02%、163.63%、56.27%、126.15%、153.66%、72.00%； PT6-1菌液處理組的巨菌草和玉米各項(xiàng)生物量指標(biāo)相較于其對(duì)照組均顯著增加，其中玉米相比于巨菌草的增加量更多，總鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量達(dá)到對(duì)照組2倍多.施加PT6-1菌液顯著增加了巨菌草、玉米在鹽堿條件下生物量的積累，PT6-1菌液處理組的巨菌草、玉米葉片相比于對(duì)照組顏色更綠，植株更高，根系更加發(fā)達(dá).

表1 施加PT6-1菌液的巨菌草、玉米耐鹽堿生長的生物量統(tǒng)計(jì)1)Table 1 Growth of C. fungigraminus and maize applied with PT6-1 aqueous solution under saline-alkali soils

A：巨菌草地上部分比較；B：對(duì)照組巨菌草根系；C：PT6-1處理組巨菌草根系；D：玉米地上部分比較；E：對(duì)照組玉米根系；F：PT6-1處理組玉米根系.圖6 施加PT6-1菌液對(duì)巨菌草、玉米在鹽堿條件下生長的影響Fig.6 Effect of PT6-1 aqueous solution on growth of C. fungigraminus and maize under saline-alkali soils

2.5 PT6-1對(duì)巨菌草、玉米在鹽堿脅迫下光合色素含量、抗氧化酶活性的影響

施加PT6-1菌液組的巨菌草和玉米相比于對(duì)照組(圖7)，葉片總光合色素含量、葉綠素含量、根系POD活性、葉片CAT活性均顯著提高，巨菌草分別提高了156.37%、155.69%、68.14%、11.84%，玉米分別提高了77.26%、81.06%、18.25%、9.59%，但是巨菌草、玉米葉片的SOD活性與對(duì)照組無顯著差異.在PT6-1處理下，巨菌草和玉米相比于對(duì)照組植株，POD、CAT活性顯著提高，葉片的葉綠素和光合色素總量顯著升高，說明施加PT6-1菌液能提高巨菌草、玉米的POD、CAT活性，幫助其清除自身氧化損傷，增強(qiáng)其耐鹽堿生長能力和抗逆性.PT6-1菌液的施加提高了巨菌草、玉米的光合色素和葉綠素的含量，增加了植物的光合作用強(qiáng)度，提高了植物的代謝水平，進(jìn)而提高植物的干物質(zhì)積累和植株抗逆性.

A：SOD活性；B：POD活性；C：CAT活性；D：總光合色素含量；E：葉綠素含量.*代表菌液處理組與同植物對(duì)照組數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05).圖7 施加PT6-1菌液對(duì)巨菌草、玉米的光合色素及抗氧化酶活性的影響Fig.7 Effect of PT6-1 aqueous solution on photosynthetic pigments and antioxidant enzyme activities of C. fungigraminus and maize

3 討論

從福建莆田火龍果根際鹽堿土壤中分離、篩選出1株耐鹽堿能力最強(qiáng)的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)PT6-1，其最高耐受2.4 mol·L-1的NaCl，最高耐堿pH值為12.PT6-1擁有固氮、溶解無機(jī)磷、產(chǎn)鐵載體等多種促進(jìn)植物生長相關(guān)的生理生化能力，且能夠增加巨菌草、玉米在鹽堿脅迫下的生物量積累，可以定義PT6-1是耐鹽堿能力較強(qiáng)的根際促生菌.近年來，根際促生菌在促進(jìn)植物生長、改良生態(tài)環(huán)境方面被廣泛報(bào)道.研究表明，貝萊斯芽孢桿菌GB03可以顯著提高擬南芥、棉花等植株的抗逆性，促進(jìn)植物生長，還能參與調(diào)控苜蓿結(jié)瘤固氮[26].馮健等[27]研究表明，施加解磷細(xì)菌能夠促進(jìn)黃瓜吸收土壤中的微量元素，促進(jìn)黃瓜生長.李艷梅等[28]研究表明，產(chǎn)鐵載體芽孢桿菌HSGJ1可以顯著提高花生對(duì)金屬鎳脅迫的抗性，提高花生的生物量，鐵載體在植物促生、環(huán)境修復(fù)、臨床中具有較大的應(yīng)用空間[29].

細(xì)菌通常通過離子滲透調(diào)節(jié)和積累小分子化合物幫助自身應(yīng)對(duì)鹽堿脅迫[30].微生物、植物和土壤在自然環(huán)境中存在著廣泛的相互作用[31-32]，細(xì)菌對(duì)植物耐鹽堿能力的影響主要有滲透調(diào)節(jié)、酶活性調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)和促生作用等[7].PT6-1主要通過促生作用增強(qiáng)代謝和提高抗氧化酶活性以幫助植物耐鹽堿脅迫.施加PT6-1菌液顯著提高了巨菌草、玉米在鹽堿脅迫下生長的生物量，提高了植株P(guān)OD活性、CAT活性和總光合色素含量，POD、CAT是植物清除體內(nèi)氧化損傷的關(guān)鍵酶，反映著植物的抗逆水平和代謝強(qiáng)度[25].鹽堿脅迫會(huì)降低植物的代謝強(qiáng)度、抑制根系營養(yǎng)吸收、導(dǎo)致葉片氣孔關(guān)閉.植物的光合作用在鹽堿脅迫下會(huì)被明顯抑制，表現(xiàn)為葉片發(fā)黃，光合色素含量、葉綠素含量顯著降低等[7].施加PT6-1菌液，顯著增加了植株在鹽堿脅迫生長條件下的光合色素含量，增強(qiáng)了植物光合作用，PT6-1增強(qiáng)植物耐鹽堿的其他機(jī)理還有待進(jìn)一步研究.有研究表明，利用微生物參與改良鹽堿地是可行的，并且有較好效果，微生物聯(lián)合植物治理鹽堿地具有成本低、生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益好等優(yōu)點(diǎn)，在未來可以逐步替代物理法、化學(xué)法而廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐[33-35].

解淀粉芽孢桿菌被國內(nèi)外學(xué)者研究后報(bào)道為一種益生菌[36]，被廣泛應(yīng)用于抑制動(dòng)植物病原菌.但其耐鹽堿促生能力和治理鹽堿地的應(yīng)用卻鮮有報(bào)道，PT6-1作為分離自鹽堿地且耐鹽堿能力和促生能力較強(qiáng)的根際益生菌，具有較好的科學(xué)研究和應(yīng)用前景.