蔣定坤, 易 超,2, 羅 琳,2, 朱方捷,2,3, 肖嘉靖,3, 林占熺,2

(1.福建農林大學生命科學學院；2.福建農林大學國家菌草工程技術研究中心;3.福建農林大學海峽聯合研究院，福建 福州350002)

在非洲、南亞的干旱和半干旱地區(qū)，玉米、高粱等作物均無法種植，珍珠粟(Cenchrusamericanus)則是這些地區(qū)重要的作物之一.季節(jié)間和季節(jié)內的降雨量變化往往是限制珍珠粟產量的重要環(huán)境因素之一[1-2].珍珠粟是干旱地區(qū)農村貧困人口糧食安全的重要組成部分，但近年來也因其可作為飼料逐漸受到重視.

含有同源結構域蛋白的同源異形盒轉錄因子被分為14個家族，其中包括與WUSCHEL(WUS)蛋白相關的同源異形盒(WOX)轉錄因子家族.WOX家族基因編碼的轉錄因子是植物特異性轉錄因子，具有由60～66個對植物特定功能至關重要的氨基酸組成的“螺旋—環(huán)—螺旋—轉角—螺旋”保守結構域.根據擬南芥WOX的進化關系將WOX家族基因成員分為3個進化分支，即現代支、中間支、古代支.除了擬南芥，WOX家族基因在核桃[3]、花生[4]、桃樹、梨、杏[5]、楊樹[6]、水稻、玉米等植物中被廣泛研究.在這些植物中，WOX家族基因參與植物生長發(fā)育的整體調控，包括莖頂端分生組織發(fā)育、側生器官發(fā)育、植物干細胞的形成與維持、花器官生長等.WOX1同源基因已被證實可以控制玉米、矮牽牛、苜蓿、煙草的葉片生長[7-9].近年來，一些研究也表明了WOX家族基因可以在旱稻、棉花、蕓苔等作物中響應非生物脅迫和激素刺激.雖然WOX家族基因在多個植物中均有研究，但目前對珍珠粟WOX家族基因成員的鑒定和表達特征研究尚未見報道.

本研究利用生物信息學方法對珍珠粟WOX家族基因進行系統鑒定，并對其編碼的蛋白理化性質、保守基序、基因結構進行了分析及啟動子區(qū)域順式作用元件預測；通過構建珍珠粟和其他代表性植物WOX家族成員系統發(fā)育進化樹解析珍珠粟WOX家族基因成員的進化歷史；同時使用實時熒光定量PCR檢測珍珠粟WOX家族基因成員的表達模式，旨在為進一步探究珍珠粟WOX家族基因功能及其在珍珠粟生長發(fā)育中的作用提供有價值的信息.

1 材料與方法

1.1 序列數據下載

珍珠粟、紫象草(Pennisetumpurpureumcv. ‘Purple’)的全基因組數據和基因組注釋文件分別來源于NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和國家基因組科學數據中心(CNCB)(https://bigd.big.ac.cn/).擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)的WOX蛋白序列來源于植物轉錄因子數據庫PlantTFDB(http://planttfdb.gao-lab.org/).

1.2 珍珠粟WOX家族基因成員的鑒定

使用HMMER 3.0軟件和Pfam數據庫(http://pfam-legacy.xfam.org/)中的WOX隱馬爾科夫模型文件(PF00046)檢索珍珠粟WOX家族基因成員，并以PlantTFDB數據庫(http://planttfdb.gao-lab.org/index.php)中的擬南芥WOX蛋白為檢索序列在候選珍珠粟WOX家族成員中利用BLAST工具進行比對，設置閾值為1×10-5.利用結構域預測工具SMART(http://smart.embl.de/smart/batch.pl)、NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)驗證候選珍珠粟WOX蛋白是否含有WOX結構域，參數為默認參數.

1.3 珍珠粟WOX家族基因結構及蛋白保守序列的預測

使用MEME軟件(http://meme-suite.org/tools/meme)分析珍珠粟WOX蛋白的保守序列.最大基序數量設置為10個，最佳基序寬度設置為6～50[10].使用TBtools軟件展示WOX家族基因結構和保守基序展示圖.提取WOX家族成員結構域序列，使用DNAMAN軟件比對并使用SWISS-MODEL網站(https://swissmodel.expasy.org)預測WOX蛋白結構域模型.

1.4 珍珠粟WOX蛋白質理化性質的分析及亞細胞定位的預測

利用在線網站ExPASyProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對所有候選的WOX蛋白序列進行分子質量、等電點、不穩(wěn)定系數、親水系數等理化性質分析.利用CELLO網站(http://cello.life.nctu.edu.tw/)對各蛋白質進行亞細胞定位預測[11].

1.5 珍珠粟WOX家族基因啟動子區(qū)域順式作用元件預測

選取珍珠粟WOX家族基因上游2 000 bp的序列為基因啟動子序列，利用在線分析網址PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行順式作用元件預測并利用TBtools軟件進行可視化展示.

1.6 珍珠粟WOX家族基因染色體定位

根據基因組注釋信息分析珍珠粟WOX家族基因染色體定位及相關結構[12].

1.7 珍珠粟WOX家族基因系統發(fā)育進化樹的構建

為解析珍珠粟WOX家族基因的進化歷史，對珍珠粟、擬南芥、水稻、紫象草等物種WOX家族成員進行系統發(fā)育進化分析.根據PlantTFDB數據庫中已鑒定的擬南芥、水稻WOX蛋白序列及本地鑒定的珍珠粟、紫象草WOX蛋白序列，利用MUSCLE算法(默認參數)對4個物種WOX蛋白進行多序列比對，并利用IQ-TREE軟件(http://www.cibiv.at/software/iqtree)使用最大似然法(MLE)構建系統發(fā)育進化樹，其中，校驗參數Bootstrap值設置為1 000次重復[13-14].使用在線網站EvolView對進化樹進行美化.利用MCScanX工具鑒定珍珠粟與水稻、紫象草之間的共線性關系，使用TBtools、Cricos軟件進行可視化展示.

1.8 珍珠粟WOX家族基因表達水平的檢測

從NCBI數據庫下載干旱處理1～144 h共8個時間點的珍珠粟根部轉錄組數據(登錄號:SRX13533560)[15].干旱處理設置為：珍珠粟在播種生長14 d后，用20%聚乙二醇6000(PEG-6000)溶液澆灌.利用Fastp工具對下機數據進行質量控制[16]，將過濾后的測序數據利用Hisat2工具比對到珍珠粟參考基因組中[17]，再利用HTSEQ工具計算各個基因的序列數，并進行標準化，得到不同條件下的基因表達水平(FPKM).利用R包Pheatmap工具對WOX家族基因成員的表達量進行繪圖.從上述有表達的WOX家族基因成員中挑選5個進行表達量分析.按照Omega Plant RNA kit試劑盒說明書的步驟提取珍珠粟不同組織(根、莖、葉片、花、種子)樣品中的總RNA，用全式金反轉錄試劑盒ransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix合成cDNA.采用β-肌動蛋白(β-actin)作為實時熒光定量PCR檢測的內參基因，測定基因在不同組織中的相對表達水平[18].WOX基因和內參基因擴增所用的引物序列如附件表Ⅰ(掃OSID碼可見)所示.PCR反應體系(20 μL)：8.2 μL超純水(ddH2O)、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL、1 μL cDNA、10 μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix.PCR反應程序:樣品預變性95 ℃ 30 s、變性95 ℃ 5 s、退火和延伸60 ℃ 30 s(在此階段收集熒光信號),總共進行45個循環(huán)；60 ℃緩慢遞增到95 ℃，每隔0.5 s采集熒光信號構建熔解曲線.采用2-ΔΔCt法對數據進行分析，基因表達水平取來自3個生物學重復樣本的平均值.

2 結果與分析

2.1 珍珠粟WOX家族基因成員的鑒定

為了系統鑒定珍珠粟WOX家族基因成員，先通過HMMER軟件和BLAST工具比對搜索得到珍珠粟候選WOX家族基因成員，再通過NCBI-CDD和SMART網站對其是否含有WOX結構域進行預測篩選，最終鑒定到15個WOX家族基因成員.

2.2 珍珠粟WOX家族基因結構及蛋白保守序列

通過MEME軟件對珍珠粟WOX蛋白進行保守基序預測，結果(圖1)顯示，WOX家族基因成員具有2個保守基序：基序1、2(附件圖Ⅰ，掃OSID碼可見).其中僅PMA5G03287缺失基序2，這可能導致該基因與其他WOX家族基因成員在功能上存在差異；而基序1在所有家族基因成員中均存在，為WOX家族基因成員所共有.基序1、2 共同組成了完整的WOX結構域.此外，保守基序3～10僅存在于由PMA5G00052、PMA2G04992、PMA6G00316組成的亞群中，表明該亞群的成員可能存在與其他分支蛋白不同的生物學功能.提取包含WOX蛋白的同源異型結構域序列并用DNAMAN軟件進行多序列比對，結果(圖2A)顯示，位于螺旋1上的Q、L，螺旋2上的P，螺旋3上的W、F、Q、N、R這幾個氨基酸高度保守，這幾個氨基酸可能是WOX蛋白行使其功能所必需的.PMA2G04992、PMA5G00052、PMA5G03287、PMA6G00316在螺旋2上的氨基酸與其他WOX家族基因成員有差異，這可能影響其功能.使用SWISS-Model網站對WOX蛋白的同源異型結構域進行同源建模，結果(圖2B)顯示，同源異型結構域由螺旋—環(huán)—螺旋—轉角—螺旋構成，這一結構在WOX家族基因中高度保守.其中，螺旋—轉角—螺旋所組成的HTH結構通過氫鍵或疏水作用與DNA相結合.

2.3 珍珠粟WOX家族蛋白的理化性質及亞細胞定位

對鑒定的珍珠粟WOX家族蛋白序列進行理化性質分析，結果(附件表Ⅱ，掃OSID碼可見)表明，珍珠粟WOX家族蛋白的氨基酸個數為216～859,蛋白質分子質量為24.51～93.10 ku,等電點為5.28～9.35，差異較大.其中，5個為酸性蛋白，等電點小于6.5；7個為堿性蛋白，等電點大于7.5；3個為中性蛋白，等電點為6.5～7.5.蛋白質不穩(wěn)定系數為49.85～86.36，均大于40，為不穩(wěn)定蛋白；親水性指數大多為-0.779～ -0.059，均為負數，表明這些蛋白大多數為親水蛋白，但親水程度不同；脂肪系數為50.42～86.63，平均值為58.33，其中，PMA5G00052編碼的蛋白脂肪系數最大(86.63)，PMA4G01060編碼的蛋白脂肪系數最小(50.42).亞細胞定位預測顯示，PMA6G00316、PMA2G04992定位于細胞膜上，PMA5G00052定位于細胞質上，其余定位于細胞核上.

圖1 珍珠粟WOX家族基因結構及保守基序Fig.1 Gene structure and conserved motifs of WOX gene family in C.americanus

圖2 珍珠粟WOX結構域氨基酸序列比對(A)及三維模型預測(B)Fig.2 Amino acid sequence alignment (A) and three-dimensional model prediction (B) of WOX structural domain in C.americanus

2.4 珍珠粟WOX家族基因啟動子區(qū)域順式作用元件

為了研究珍珠粟WOX家族基因可能的調控機制，對其成員在啟動子區(qū)域(起始密碼子上游2 000 bp處)的植物激素響應元件、光響應元件、逆境響應元件、生長發(fā)育調節(jié)元件等潛在順式作用元件進行了預測.結果(圖3)顯示，啟動子區(qū)域主要存在光響應元件、脫落酸響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、玉米醇溶蛋白代謝元件、厭氧誘導響應元件、生長素響應元件、防御和應激反應元件、干旱誘導元件、胚乳發(fā)育元件、赤霉素響應元件、低溫響應元件、分生組織表達元件、水楊酸響應元件、種子特異性響應元件、根特異性元件、類黃酮生物合成基因調控元件等16種已知功能的順式作用元件.其中，光響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、脫落酸響應元件較多，分別為175、66、57個.PMA5G03287所含順式作用元件最少，為19個；PMA2G04992所含順式作用元件最多，為42個.啟動子區(qū)域均存在光響應元件和脫落酸響應元件，表明光和脫落酸可能調控WOX家族基因的表達；13個啟動子區(qū)域存在茉莉酸甲酯響應元件.基于功能預測將順式作用元件劃分為不同類別的結果表明，與激素有關的順式作用元件最多(196個)，其次是光響應元件(175個)、逆境響應元件(53個)、生長發(fā)育調節(jié)元件(27個).

圖3 珍珠粟WOX家族基因啟動子區(qū)域順式作用元件預測Fig.3 Prediction of cis-element in promoter of WOX gene family in C.americanus

2.5 珍珠粟WOX家族基因染色體定位

基于全基因組對珍珠粟WOX家族基因進行染色體定位并用TBtools軟件進行可視化展示.結果(圖4)顯示：WOX家族基因成員在6條染色體上均有分布，且分布主要集中在各染色體近末端的位置；有2個基因分布在1號染色體上，1個基因分布在2號染色體上，2個基因分布在3號染色體上，2個基因分布在4號染色體上，3個基因分布在5號染色體上，5個基因分布在6號染色體上，7號染色體上沒有基因分布.

圖4 珍珠粟WOX家族基因染色體定位Fig.4 Chromosome location of WOX gene family in C.americanus

2.6 珍珠粟WOX家族基因系統發(fā)育進化關系及共線性關系

為了進一步分析珍珠粟WOX家族基因成員與其他物種同源基因的進化關系，從PlantTFDB數據庫獲取了12個水稻家族基因成員(命名為OS-WOX01～12)、18個擬南芥WOX家族基因成員(命名為AT-WOX01～18)，并通過鑒定選取34個紫象草WOX家族基因成員(命名為CP-WOX01～34)，對上述4個物種WOX家族基因成員編碼的蛋白序列進行比對并構建系統發(fā)育進化樹.結果(圖5)表明，4個物種79個WOX家族基因成員分為3個類群：古代支、中間支、現代支.古代支包含29個基因(水稻1個、紫象草20個、擬南芥3個、珍珠粟5個)；中間支包含16個基因(水稻5個、擬南芥7個、珍珠粟4個)；現代支包含34個基因(水稻6個、紫象草14個、擬南芥8個、珍珠粟6個)，為3個分支中最多的一個，且珍珠粟中的6個基因均包含WUS基序(T-L-X-L-F-P-X-X).每個分支均有水稻、擬南芥、珍珠粟的WOX家族基因成員分布，這說明珍珠粟物種的分化時間在WOX基因分化之后.

AT表示擬南芥；CP表示紫象草；OS表示水稻.圖5 WOX家族基因的系統發(fā)育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of WOX gene family

基因共線性是指由于基因組或者基因片段復制產生的同源基因，這些基因在序列上有相似性，且相鄰基因在染色體上的分布順序也相似.利用MCScanX軟件對珍珠粟WOX家族基因與水稻、紫象草所有基因之間進行物種內和物種間共線性分析，并使用TBtools、Cricos軟件將結果進行可視化展示，結果如圖6所示.物種內共線性分析(圖6A)表明，在珍珠粟WOX家族基因成員中，僅PMA6G04281、PMA1G06013經歷了染色體片段復制.物種間共線性分析(圖6B)表明，珍珠粟、水稻、紫象草的共線性基因在各染色體上的分布不同，數量不一.珍珠粟5、6號染色體與水稻、紫象草之間的共線性基因較多.水稻與珍珠粟之間有15對基因具有共線性，紫象草與珍珠粟之間有34對基因具有共線性，表明這些基因是由同一個祖先分化而來，且珍珠粟與紫象草的親緣關系比與水稻的親緣關系更近.珍珠粟的基因數量是紫象草的一半，說明紫象草的二倍體祖先與珍珠粟具有高度相似的組成結構.

OS01～12表示水稻12條染色體序號；CA01～07表示珍珠粟7條染色體序號；CP01～14表示紫象草14條染色體序號.圖6 珍珠粟WOX家族基因物種內(A)和物種間(B)的共線性關系Fig.6 Intra- (A) and inter-species (B) collinearity of WOX gene family in C.americanus

2.7 珍珠粟WOX家族基因成員的表達模式

干旱處理后對珍珠粟根部WOX家族基因成員表達量的轉錄組數據進行了分析.結果(圖7)顯示，干旱處理144 h后，PMA6G04281、PMA6G00316、PMA5G03287、PMA5G01807的表達水平均有不同程度的上調，表明這4個基因可能在干旱脅迫的條件下發(fā)揮著重要作用.

D表示干旱處理，D_L表示干旱處理時間；CK表示對照處理，CK_L表示對照處理時間.圖7 不同時間干旱處理后珍珠粟根部WOX家族基因的表達圖譜Fig.7 Expression map of WOX gene family in C.americanus root after different durations of drought treatment

圖8 珍珠粟不同組織WOX家族基因的表達圖譜Fig.8 Expression map of WOX gene family in different tissues of C.americanus

為了明確WOX家族基因在珍珠粟不同組織中的表達特征，對種子、根、莖、葉、花序5個組織器官WOX家族基因的表達量進行了分析.結果(圖8)表明，WOX家族基因成員在珍珠粟不同組織中的表達水平存在明顯差異.PMA6G05767、PMA6G05977、PMA2G04992、PMA5G00052、PMA5G03287在根、種子中均為低表達，推測這5個基因與根、種子的生長發(fā)育關系不大，其組織表達特性有待進一步驗證；PMA6G05767、PMA6G05977、PMA5G00052、PMA5G03287在莖中均為高表達，推測這4個基因與莖的發(fā)育有關；PMA2G04992、PMA5G00052、PMA5G03287在花序中均為高表達，而在根、葉、種子、莖中相較于花序均為低表達，推測這3個基因在花序的發(fā)育過程中發(fā)揮了作用.綜上可知，珍珠粟WOX家族基因具有明顯的組織表達特異性，暗示著它們在不同組織中的生物學功能可能存在較大差異.

3 討論

WOX家族基因編碼的植物所特有的轉錄因子在調節(jié)植物生長發(fā)育及非生物脅迫過程中扮演著重要角色.目前已有研究解析了擬南芥WOX家族基因成員的數量和相關功能.如：WUS基因在擬南芥花藥器官的發(fā)生過程中能夠調控其分化[19]；WOX3基因的突變會導致擬南芥花瓣變窄或缺失[20]；WOX2基因在維持擬南芥胚胎頂細胞正常功能和胚后發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[21-22].

目前，WOX家族基因在水稻、高粱、玉米、擬南芥、油菜、棉花等植物中具有相關功能研究[23-25]，但對珍珠粟WOX家族基因的鑒定與分析尚未見報道.本研究鑒定得到了15個WOX家族基因成員，與水稻(13個)[23]、油茶(18個)[26]、中華獼猴桃(16個)[27]中的WOX家族基因成員數量接近，但遠少于玉米(31個)[28]、陸地棉(37個)[24]、大豆(33個)[29]的數量.就WOX家族基因而言，珍珠粟具有更大的基因組和更少的基因數量，物種內共線性分析顯示僅有一對基因有片段復制，表明珍珠粟在物種演化過程中沒有多次基因組倍增事件.蛋白理化性質分析顯示，WOX家族基因所編碼的蛋白長短不一，分子質量和等電點也存在差異，表明不同WOX家族基因成員可能存在生物學功能差異.其中，絕大多數珍珠粟WOX家族蛋白成員為不穩(wěn)定的親水性蛋白且定位于細胞核中，這與蒺藜苜蓿、鷹嘴豆、棉花、蘋果、烏拉爾圖小麥相似.本研究結果還顯示：珍珠粟WOX家族基因成員有2個保守基序(基序1、2)，這兩個保守基序共同組成了完整的同源異型結構域；基序1中的W、F、Q、N、R及基序2中的Q、L、P在不同植物(中華獼猴桃、水稻、玉米、擬南芥、甘藍型油菜)WOX家族基因成員中均高度保守；且這些氨基酸位于結構域的第2、3個α螺旋上，與DNA大溝中堿基的相互作用密切相關.結合珍珠粟和其他植物(玉米、棉花、水稻)染色體定位結果表明，大部分植物WOX家族基因成員在進化過程中在染色體上的位置分布依然保守.

基于最大似然法構建珍珠粟、擬南芥、水稻、紫象草4個物種79個WOX家族蛋白成員系統發(fā)育進化樹，結合保守基序和基因結構表明，聚類在同一分支下基因成員基序的個數、次序和基因結構均相似，表明珍珠粟WOX家族基因在進化中高度保守.古代支的3個家族基因成員基序個數和外顯子個數均遠多于現代支和中間支，推測其參與調控的過程，功能與其他成員有所不同.值得注意的是,紫象草WOX家族基因與大多數植物均含有3個分支不同，僅在現代支和古代支有分布，缺少中間支成員，這與毛竹[30]類似，可能存在獨特的進化方式.

本研究結果表明：在WOX家族基因啟動子區(qū)域存在著大量與植物生長發(fā)育、激素響應、環(huán)境脅迫相關的順式作用元件；在15個啟動子區(qū)域中均發(fā)現脫落酸響應元件，脫落酸具有降低和抵御干旱的作用[31]，推測珍珠粟WOX家族基因主要受脫落酸調控，從而抵御干旱；大部分珍珠粟WOX家族基因成員含有多個相同的順式作用元件.在啟動子區(qū)域存在著數量和種類不同的順式作用元件可能反映了基因在轉錄水平上的功能差異.

已有研究表明，擬南芥WOX13、WOX14在花中均有表達[32]，參與花器官的形成和花藥發(fā)育.WOX同源基因在矮牽牛[33]、番茄[34]的花瓣發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用.本研究結果表明，在珍珠粟花序、莖中分別存在3和4個高表達WOX家族基因成員，推測其在花器官和莖尖分生組織中發(fā)揮了調控作用.